프로바이오틱 유산균의 기능성 박명수 1 , 권 빈 1.2 , 조상희 1 , 염은미 2 ,...
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프로바이오틱 유산균의 기능성 박명수 1 , 권 빈 1.2 , 조상희 1 , 염은미 2 , 김남주 2 , 김혜영 2 , 지근억 1.2 , 1) ㈜ 비피도 연구소 2) 서울대 식품영양학과 지 근 억. 배 경. Human large colon : Bacterial fermentor * Cell density = 10 11 - 10 12 CFU/ml * Volume = 6 Cm diameter x 1.5 m * Total bacterial number = 10 14 cfu/ colon - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
프로바이오틱 유산균의 기능성
박명수 1, 권 빈 1.2, 조상희 1, 염은미 2, 김남주 2, 김혜영 2, 지근억 1.2,
1) ㈜비피도 연구소2) 서울대 식품영양학과
지 근 억
Human large colon : Bacterial fermentorHuman large colon : Bacterial fermentor
Cell density = 10 Cell density = 10 1111- 10- 101212 CFU/ml CFU/ml
Volume = 6 Cm diameter x 1.5 mVolume = 6 Cm diameter x 1.5 m
Total bacterial number = 10Total bacterial number = 1014 14 cfu/ coloncfu/ colon
Major products = short chain fatty acids, ammonia, Major products = short chain fatty acids, ammonia,
methane, Hmethane, H2, 2, amine, etc.amine, etc.
Host : control of mediumHost : control of medium
Who is harmful ?Who is harmful ?
Who is beneficial ?Who is beneficial ?
배 경
장내 세균의 중량 : 1.0-1.5kg
장내 세균의 80% 는 현재 배양 불가 Dr. Benno, Yoshimi
Asian Conference on Lactic Acid
Bacteria (2001)
장내세균과 인체와의 관계장내세균과 인체와의 관계
장 내 세 균장 내 세 균
• 혐기성 미생물의 서식장소• 영양성분의 섭취• 적정수준의 독성 ( 예 , Bacteroides)
을 발휘하여 인체를 공격•독성이 강하여 인체에 큰 해를 입히는 균들은 도태
인 체인 체
•세균의 대사산물 ( 저급 지방산 )흡수하여 에너지 획득 ( 섭취열량의 10-15%)
•식품섭취의 부족시 : 득•식품섭취의 과잉시 : 실•단백질 , 지방 등은 대부분 세균에 의하여 분해되어 독성물질로 변환
•장내세균은 장관벽을 두텁게 하고 면역기관을 발달 시킴
배경
5050 일된 유아의 변일된 유아의 변
3333 세 여성의 변세 여성의 변
6363 세 노인의 변세 노인의 변
인체의 대장 인체의 대장 = = 미생물 발효조미생물 발효조인체의 대장 인체의 대장 = = 미생물 발효조미생물 발효조
배경
인체에 대한 장내 미생물의 영향인체에 대한 장내 미생물의 영향
유해균 / 독성균 유익균
Bacteroides
Bifidobacterium
Eubacterium
Streptococcus
Lactobacillus
E. coli
C. perfringens
Staphylococcus
Proteus
감염증과 감염증과 설사 유발설사 유발
장 부패 촉진장 부패 촉진
발암물질 생성발암물질 생성
독성균에 대한 독성균에 대한 억제 작용억제 작용
소화 촉진소화 촉진
장 부패 억제장 부패 억제
Log CFU/g feces
8
11
6
2
Birth Infants Maturity Aged
11
10
8
6
4C. perfringens
Lactobacillus
E. coli, Streptococcus
Bifidobacterium
Bacteroides, EubacteriumL
og c
oun
ts /
g fe
ces
연령에 따른 장내 균총의 변화연령에 따른 장내 균총의 변화연령에 따른 장내 균총의 변화연령에 따른 장내 균총의 변화(Mitsuoka)
배경
비피더스균
장내 균총
면역 체계
설사 억제변비 개선 혈중
콜레스테롤 저하
유당 불내증 개선
소화작용 도움항 종양 효과
유해균 억제
비타민 합성B2,B6,B12
인체에 유익한 비피더스균의 작용인체에 유익한 비피더스균의 작용
I : 비피더스 , 유산균 벡터 및 유용 유전자 발현
비피더스 Secretion 벡터 대장균 Secretion 벡터 Leuconostoc 벡터
GRAS-host
CORE TECHNOLOGY
Bifidobacterium
GRAS promoter
GRAS rep gene
MCS
GRAS-vector
GRAS : Generally Recognized As Safe
GRAS selection marker
BIFIDO
E.coli system
AD1. Long research history2. Well defined metabolic pathway3. Full genome-sequenced 4. Easy to manipulate5. Mass culture and Mass production
DA1. Cellular toxicity (LPS)2. Weak acid tolerance3. Inevitable Purification process 4. Weak secretion 5. Environmental contamination6. Inapplicable to Food
Bifidus system
AD1. GRAS2. Applicable to Food and Pharmaceuticals3. Purification is an optional step4. Environment-friendly product5. Strong secretion system6. Weak external protease activity7. Possible to secure platform technology
DA1.Short research
history
2. Poorly defined
metabolic
pathway
3. Absence of good
expression
system
4. Weak molecular
breeding
technique
Advantages of Bifidus system
BIFIDO
형질전환 된 비피더스
형질전환 되지 않은 비피더스
비피더스 발현 시스템의 활용 예
BIFIDO
Cell Extract Supernatant
OD
405
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Released phosphate
/ml c
ult
ure
Methods & Results
Medium : Modified MRS except for phosphate reagent
Cell extract : 9.5X concentration , SonicationSupernatant : Centrifugation
Phytase Liquid Assay : Heinonen-Lahti Method
94%
6%
Figure 1. Phytase assay measuring phosphate released by phytase
Species No. of Strains
Contry
Bifidobacterium BreveBifidobacterium longumBrevibacterium lininsLactobacillus acidophilusLactobacillus bulgaricusLactobacillus caseiLactobacillus gasseriLactobacillus helveticusLactobacillus johnsonniLactobacillus plantarumLactobacillus rhamnosusLactobacillus sakeiLactococcus lactisLeuconostoc mesenteriodesOenococcus oeniPediococcus pentosaceusPropionibacterium freudenreichiiStreptococcus thermophilus
121132111111422113
EnglandSwiss, USA
USAUSA
France, USAUSA, France
USAUSA
SwissNetherland
New ZealandFrance
France, Netherland,England, USA
USA, KoreaFrance, USA
USANetherland
Belgium, France, USA
유산균 유전체 염기서열 결정유산균 유전체 염기서열 결정
•유산균을 이용한 건강 기능성 및 치료용
유전의 발현
•저칼로리 감미 소재 생산 균주 개발
- 알라닌 , 소비톨 , 만니톨 , 타가토스 생산 균주
•비타민 생산 균주 개발 - 엽산 , 리보플라빈 ,
비타민 B12
•치료용 유산균 - 염증 치료제인 인터루킨 생산
균주 , 병원성 균주에 대한 항원 발현
백신용 균주 등
유산균 유전자 재조합체유산균 유전자 재조합체
차별적 핵심 연구차별적 핵심 연구 , , 산업화산업화 , , 공동 연구공동 연구
유산균 유전자 벡터 및 발현 기술 의 원천 기술 확보
Bifidobacterium - E. coli shuttle vector Leuconostoc - E. coli shuttle vector E. coli secretion vector 발현 유전자 : cholesterol oxidase, phytas
e, endostatin, amylase 균체밖으로 90 % 이상 분비
II : 유용 생리활성 유산균 제품 개발
1970 년대 7위
1990 년대 4위
2000 년대 2위
출처 : ( 한국인 발생 대장암 ,
서울 삼성병원 연구과제 )
대장암 증가추이대장암 증가추이
Selective screening Random screening
Growth rate Sensory evaluation
Product development & Evaluation
Immune modulation Intestinal colonization
Probiotic Bifidobacterium ScreeningProbiotic Bifidobacterium Screening
Acid Bile Oxygen AntimutagenicityBacteriocin
Healthy human subjects
• 로타바이러스 : Reoviridae 과에 속하며 어린이 및 유아의 급성소아장염유발 원인 바이러스로 1943 년 Light 와 Hodes 에 의해 보고됨 .
• 서울 지역의 소아 설사군을 대상으로 설사 유발 원인을 조사한 결과 rotavirus 가 설사군의 47% 에서 검출되어 가장 높은 출현빈도를 나타내고 있으며 이는 세계보건기구의 통계치인 20% 의 두배를 웃도는 수치임 .
• 작년 2001 년도에 발생한 경기도 고양시 산후조리원의 영아 집단 사망의 원인은 로타바이러스로 밝혀져 대책이 시급함 .
• 1999 년 미국에서 와이어스社 (Wyeth) 에 의해 로타바이러스 백신이 개발돼 식품의약청 (FDA) 의승인을 받은 적이 있지만 백신 투여 후 ‘장중첩 증상’ 등의 부작용이 있어 바로 허가가 취소돼 현재까지 세계적으로 부작용 없는 로타바이러스 백신은 없는 것으로 알려짐 .
• 최근 장내 유용 미생물을 이용한 로타바이러스의 억제에 관한 연구가 진행되고 있음 : probiotics 의 경구투여시 로타바이러스성 설사의 강도와 기간을 줄여줌
현재까지는 백신등의 의약품 차원에서 연구가 되었으나 본 연구에서는 장에 천연적으로 존재하는 비피더스를 이용하여 안전하게 제어하고자 함
배 경
Screening for anitrotaviral bifidus
0
20
40
60
80
100
120
0 0.1 0.5 1 2 3
(유산균 농도 g/ml)
(%
)감
염저
해율
47180
활성 단백질 분리 정제
Internal sequencing
PCR-cloning
0
20
40
60
80
100
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Protein (g/ ml)
Inhib
ition
(%)
IC50=0.05ug/ml
CLA 정의
• Conjugated Linoleic Acid (CLA): Linoleic Acid 의
이성질체 (cis-9, trans-11)
• Linoleic Acid 를 화학 합성하여 생산
(cis-9, trans-11; trans-10, cis-12)
• Rumen Bacteria 에서 의해 합성 (cis-9, trans-11)
• Linoleic Acid Isomerase 에서 의해 생화학적으로
합성 (cis-9, trans-11)
CLA 기능
항암 효과 : Mouse 피부암 , 전위암 , 복수암 억제효과
항동맥 경화 효과 : Hamster 의 대동맥 경화증 발생억제
콜레스테롤 축적 저하 효과 : 돼지 및 닭의 콜레스테롤 함량 저하
체지방 감소 효과 : 인체의 체중 감소
항균 효과 : 곰팡이 Aspergillus 와 Rhizopus 생육저해 , 식중독균 Listeria
와 Vibrio 균 생육저해
항산화 효과 : CLA 함유 돼지고기 및 닭고기에서 Thiobarbituric acid reacti
ve substances(TBARS) 의 생성 저하 및 저장성 증가
Continuous production of CLA from LA by immobilized Continuous production of CLA from LA by immobilized L. reuteL. reute
riri in a packed-bed bioreactor in a packed-bed bioreactor
Time (h)
0 4 8 12 16
Co
nju
gat
ed l
ino
leic
aci
d (
mg
/L)
0
20
40
60
80
100
120
140
50 mM Tris-HCl buffer as pH 7.5 and 0.05% LA at 25oC. CLA production in a packed-bed bioreactor () and replacement reaction in a test tube containing whole cell of L. reuteri ().
Continuous production of CLA from LA by Continuous production of CLA from LA by immobilized enzyme in a packed-bed bioreactorimmobilized enzyme in a packed-bed bioreactor
Time (h)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Co
nju
gat
ed l
ino
leic
aci
d (
mg
/L)
0
50
100
150
200
50 mM Tris-HCl buffer as pH 7.5 and 0.05% LA at 25oC. CLA production in a packed-bed bioreactor of immobilized enzyme() and replacement reaction in a test tube containing free enzyme ().
GABA 의 작용
억제성 신경전달물질로서 혈압강하 , 진정작용 등의 작용을 하고 , 외에도 뇌혈류를 증가시켜 산소공급량을 많게 하고 뇌세포 대사기능을 활발하게 하여 자율신경 실조증 , 중풍과 치매예방 , 기억력증진 , 불면증 등에도 효과를 인정받고 있음 .
그밖에 간기능 활성과 알콜대사 촉진 기능으로 숙취제거 음료에도 이용 . 비만해소작용과 신장기능 촉진작용도 보고되고 있음 .
GABA
생물계에서 Gluramate 에서 이산화탄소가 빠져나가는 과정을 거쳐 효소로서 생성 .
식물계에서는 Glutamate decarboxlyase 와 함께 GABA 가 널리 존재하고 있음이 오래전부터 알려져 있었으나 동물에서는 뇌 속에 존재한다는 것이 1950년에 처음 발견되었고 , 특히 포유동물의 뇌 속에만 존재하는 특이한 아미노산으로 이에 대한 다양한 작용들이 보고되고있음 .
대다수의 유산균에서도 GABA 가 생성되고 있는 것으로 보이고 , lactococcus lactis, lactobacillius brevis 등이 대표적 . 특히 lactobacillius brevis경우 8개 중 4 개의 strain 이 GABA 를 생산한다고 보고됨 .
Lactobacillus reuteri 에 의하여 생산되는루테린의 항균성
연속 공정에 의한 루테린 생산
Glycerol solution
pump
collector
Immobilized beads or free cell Incubator
Silicon tubing
Fig.5. Bioreactor for production of reuterin by immobilized L. reuteri using agarose beads. The solution flow rate was about 0.45ml/min.
신제품 개발 사용균주
Bifidobacterium strains Adherent bacteriaBGN-4 500E2-18 168E-15 132JS-9 84RD-54 67SI 61SH-2 47RD-60 42B. bifidum ATCC 2952 35CN2 30SJ-32 26KJ 24해준 23B. animalis ATCC 2552 22B. adolescentis ATCC 15703 19SH-5 17B. infantis ATCC 15697 15B.longum ATCC 15707 11M-6 10MS-1 10
Mean numbers of adhering bifidobacteria per 50 Caco-2 cell
대장암 억제활성 – 균주의 선발
30종의 bifidobacteria 균주를 대상으로 배양액 및 균체의 활성을 측정한 결과 , 가장 뛰어난 대장암 증식저해활성을 가진 bifidobacteria BGN4 를 획득
Bifidobacterium sp. BGN4
• 30 개의 bifidobacteria strain 중 가장 활성이 높은 strain 으로서 BGN4 를 선발
Electron scanning morphology of BGN4
0
20
40
60
80
Bifidobacterial Strains
Tum
or G
row
th In
hibi
tion
(%)
0
20
40
60
80
100
Control 1x1075x1061x106
BGN4 Cell Concentration (cells/ml)
Cel
l Via
bilit
y (%
) of H
T-29
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100 IC50 (g/ml) = 23
Cel
l Via
bilit
y (%
) of
HT
-29
Concentration (g/ml) of BGN4 Cell Extract
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100
K-ras (IC50
(g/ml) = 10)
HT-29 (IC50
(g/ml) = 23)
NIH3T3 (IC50
(g/ml) > 100)
Chang (IC50
(g/ml) > 100)
HeLa (IC50
(g/ml) > 100)
Cel
l Via
bilit
y (%
)
Concentration (g/ml) of BGN4 Cell Extract
• BGN4 의 whole cells 및 cell extract ; HT-29 colon cancer cell 에 대한 증식억제 효과 보임
• Cell line specificity ; 활성의 세포 간 특이성을 보임
BGN4 의 항암활성
Group ACF Size
Control
SM2)
SM+Protease
SM+Bifido3)
BGN4
92.00 ± 7.04 90.17 ± 17.77 86.50 ± 9.74 66.38 ± 13.88* 85.17 ± 14.72
+++++
+++++
+++++
+++
++
The effect of Bifidobacterium spp RD65 and BGN4 on number and size of aberrant crypt foci
1) All the numbers are expressed as Mean ± SE 2) Soy milk powder
3) Bifidobacterium spp
항종양효과 -동물실험
프로바이오틱스를 이용한 알레르기 예방
•장 면역은 인체 면역중 50% 이상 차지•장관 항원의 샘플링 : Peyer’s patch•Lamina propria : IgA 생산 및 분비 , 소장은 주로 IgA1 대장은 주로 IgA2•상피 세포 (intestinal epithelial cells)•IEL (intra epithelial T-lymphocyte)•장내 세균이 없는 동물은 알레르기 발생이 증가•프로바이오틱 유산균은 Th1 세포를 활성화 , IL-10, TGF-beta, INF-gamma 생산 촉진•장관 세포 침투계 정상화 , 세균총 정상화 , 장관 면역계 조절 ,
알레르기 발생 면역 억제
4) 4) 장내 세균과 앨러지장내 세균과 앨러지
앨러지 보유 유아 : Bifidobacteria 감소 , clostridia 증가
Bjorksten et. al. (2001) 앨러지 보유아에서의 bifidobacteria, enterococci 감소 보고
B. bifidum 은 정상아에서 , B. adolescentis 는 앨러지 보유아에 우세
B. bifidum 은 TNF-alpha 생산 감소 시킴 . IL-10 증가 시킴
B. adolescentis 는 반대 정상아의 B. bifidum 은 장세포 부착능 이 좋음 .
5) Probiotic5) Probiotic 의 종류별 효과의 종류별 효과
Kalliomaki et al. (Lancet 2001)
Lactobacillus sp. GG 에 의하여 eczema 감소 , 피부 감작은 변화 약함 .
Bifidobacteria 는 피부 감작 줄임 : 현재
Experimental weeks
w0 w1 w2 w3
PN
-sp
ecif
ic Ig
E (
ng
/ml)
0
100
200
300
400
500 G1 : Bif/Pre + PN
G2 : Bif/Pre + PN/Bif
G3 : PBS/Pre + PN
G4 : naive
Simultaneous administration of live Bifidobacteria during peanut-sensitization can reduce the peanut specific serum IgE antibody levels in murine(C3H/HeJ) model of food allergy. G1 : Pretreatment of Bifidus, 14-days-before peanut sensitization; G2 : Pre and simultaneous treatment of Bifidus(total 28days) and peanut sensitization;G3 : Sham-treated peanut sensitization ; G4 : Naïve.
선행연구결과
선행연구결과IFN- r
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
G 1 G4
pg
/mL
RPMI
PMA
Bifidus 100+ PMA
Bifidus 10+PMA
Bifidus 100
Effect of Bifidobacterium. Sp BGN-4 on production ofIFN-r in splenocytes of sensitized C3H/HeJ.
제품 섭취에 따른 균총의 변화
0
2
4
6
8
10
12
1 (차 비섭)취
2 ( )차 섭취 3 ( )차 비섭취 4 ( )차 섭취 5 ( )차 비섭취
실험구
Log
of C
FU/g
bifidusbacteroidesLactobacillusClostridiumE.colitotal aer ob e s
제품의 인체평가
균주의 산업화
Viable cell counts of Lactobacillus acidophillus in commercial probiotic products
Product typeCfu/g Can provide
BenefitClaimed Actual
Health products(Dry)
H1 Not specified
1.5 X 10E3 No
H2 1 X 10E8 1.6 X 10E3 No
H3 4 X 10E8 7.3 X 10E2 No
H4 Not specified
2.5 X 10E6 No
Pharmaceutical products (Dry)
P1 Not specified
4.8 X 10E6 Maybe
P2 Not specified
1.3 X 10E8 Yes
P3 5 X 10E9 3.2 X 10E9 Yes
P4 2 X 10E7 2.2 X 10E3 No
출처 : Fundamental Food Microbiology, Academic press, 2001, p220
III : 유산균을 이용한 생물전환
0
100
200
발효시간
이소플라본농도
( / )㎍ ㎖
GenisteinGenistinDaidzeinDaidzin
0 시간 18 시간
비피더스에 의한 대두 이소플라본의 생물전환
활성화 이소플라본 제품
㈜ 비피도 연구원 서울대 식품미생물실 연구원