PCR 을 이용한 DNA 합성과전기영동법을 통한 정량분석

20030666 화 학 과 류 대 승

Purpose

Escherichia coli K12 에서 분리 , 정제된 chromosomal DNA 인 mgsA 의 DNA sequence 를 이용하여 mgsA DNA 를 PCR(polymerase chain reaction) 을 통해 복제 , 증폭하는 메카니즘과 장치 조작법을 익히고 , PCR 로 인해 얻어진 DNA의 분석을 위한 전기 영동법 (Electrophoresis) 의 원리를 이해하여 DNA증폭법과 정량법을 익힌다 .

PCR(polymerase chain reaction)

• 1980 년대 중반에 Kary Mullis 에 의해 고안

• DNA 분자의 단일부위가 여러 번 복제되어 , DNA 단편이 증폭되는 원리

• PCR 은 매우 간단하면서 감도가 높고 응용범위가 넓어 현대 생명과학에서 가장 중요한 테크놀로지 중의 하나

• PCR 은 유전자 클로닝보다 신속한 기술이면서 훨씬 덜 복잡하고 , 하나의 출발 분자로 부터 수백만 개의 복사본을 증폭시킬 수 있음 .

• PCR 의 이러한 높은 민감도는 단일세포 또는 이미 말라 버린 혈흔이나 사망한지 오래된 인간의 뼈같은 시료로부터 얻은 미량의 DNA 를 증폭할 수 있다는 것을 의미

• 과학수사기법이나 DNA 칩 기술로의 응용 , 유전학 연구의 새로운 지평을 연 선구자적 기술

• E-field 에서 Cation/Anion 이 Cathode 또는 Anode 쪽으로 이동하는 현상을 이용

• 이동하는 속도에 미치는 영향

- 전기장의 세기 , 이온의 전하량 , 크기와 모양 , 용액의 pH 와 점성도 , 용액 (Buffer)

에 있는 다른 전해질의 농도와 이온 세기 , 지지체의 종류 등

- 용액 내에서의 분자의 이동속도는 그 분자의 고유한 성질

• 아미노산 , 핵산 , 단백질 등의 Zwitterion 들을 분리 , 분석할 때 매우 효과적인 수단

• Electrophoresis 는 주로 이온화된 분자 ( 이온 ) 의 정량에 한정된 수단

• 유동성 매체 (Medium) 로 액체 또는 기체가 사용

- Agarose 전기영동법은 매체로 아가로스 겔을 이용

전기영동법전기영동법 (Electrophoresis)(Electrophoresis)

DNA 의 인산에스터 결합 (-) charge 를 가지고 있다 .이러한 당 - 인산기의 뼈대에 염기가 결합하여 DNA 를 이룬다 .

A=T, C≡G 의 수소결합

DNA 는 각 염기의 상보적 결합으로 인한 이중나선을 이룬다 .

DNA 의 구조

PCR 의 원리

DNA 는 항상 5`end→3`end 으로 합성됨 .

3 번탄소의 – OH 가 5 번탄소의 Phosphate 를 공격함

Leading strain

lagging strain

5`end

Denaturing 된 DNA 는 2 가닥으로 분리되며 각각이 5` →3 방향으로 합성됨 .

3` end

5`end

3`end5`end

3`end

Primer 제작• mgsA DNA sequence : atggaactga cgactcg……ggaccgt ctgaagtaa

• Upstream Primer : atggaactga cgact

• Downstream Primer : ctggca gacttcatt

• 결합온도 (TM), Temperature of melting ① Tm=(4 x {G+C} + (2 x {A+T})℃ ② Upstream primer(5`), atggaactga cgact (4 x {5+2} + (2 x {5+3}) = 54℃ ③ Downstream primer(3`), ctggca gacttcatt (4 x {3+4} + (2 x {3+5}) = 54℃

※ 좋은 primer 의 조건 1. 두 primer 의 Tm 값이 비슷해야 한다 . 2. g-c: a-t =1:1 에 가까운 값을 가져야 한다 . 3. primer-dimer 가 되지 않도록 주의한다 . 4. aaaa 등의 같은 sequence 가 오지 않도록 한다 .

Chemicals

• Template: 2μℓ, (mgsA)

• Upstream primer: 1μℓ

• Downstream primer: 1μℓ

• dNTP: 5μℓ

• 10×완충용액 : 5μℓ

• 증류수 : 35μℓ

• Taq DNA polymerase: 1μℓ

PCR Running

•PCR Cycle : 15회

•Denaturation : 95℃, 5 분

•Annealing : 61.5℃, 30초

•polymerization 72℃, 1 분

⇒ 15회 반복 , 처음 DNA 양의 32768배로 증폭

• Agarose gel 을 매체로 이용하여 전기장을 걸어 DNA 를 분리할 때 사용

- 전기장에 의한 DNA 분자의 이동

• DNA 는 deoxyribose 가 인산에스터 결합을 하기 때문에 phosphate group

에 의해 (-) charge 를 가짐

- 두 전극 사이에 위치했을 때 (+)극 쪽으로 움직임

•DNA 분자가 Agarose gel 사이를 통과하는 속도

- 분자량이 커질수록 , Agarose gel 이 치밀할수록 (gel%가 높을수록 )

늦어짐

- DNA 의 분자량이 같더라도 구조에 따라 달라짐

전기영동을 통한 전기영동을 통한 DNADNA 의 분리의 분리

Agarose gel 전기영동 결과

증폭시킨 mgsA 와 Loading dye 를 넣고 전기영동시킨 결과 . 왼쪽부터 레더 , gldA, mgsA, mgsA, gldA순서 . 아래쪽이 (-)극 위쪽이 (+)극 . gldA(1104bp) mgsA(459bp)

1kbp 의 gldA 가 더 밝은 빛을 내는데 , 큰 bp 크기때문에 EtBr 과 더 많이 결합하기 때문 .

Ladder, 각각의 bp 크기별로 혼합되어있어 reference 로 쓰인다 .

1) 100V의 전압

- 전압이 세질수록 전기장도 커지므로 전기영동 시간 단축

(100V 20 분 실행 )

2) Agarose 격자구조 때문 Agarose 의 농도가 높을수록 DNA 는 느리게 이동

- 60~5kbp 분리에 적합한 0.3% agarose gel 의 농도로 진행

(-) 극에 놓인 DNA 가 (+) 극으로 이동하게 됨

전기영동법의 메카니즘

DNA 전기 영동시의 실험 설정 (1)

3) 1 x TAE buffer (Tris-acetate EDTA)

- DNA agarose 전기 영동시 주로 사용 , 분자량이 큰 경우 사용

4) Agarose gel

- 분자량이 100bp~20kbp 인 DNA 사용 , 해상력이 낮음

5) DNA Loading dye

- Bromophenol Blue (BPB, 파란색 ) 과 Xylene Cyanol (XC, 빨간색 ) 염색시약 또한 음전하를 띄고 있어 DNA 와 같이 이동함

- sucrose, glycerol, NaCl 등이 함유 : DNA 가 든 시료를 gel 속에 잘

가라앉게함 .

6) EtBr (Ethidium bromide))

- - EtBr 분자가 DNA 의 당과 nucleotide 사이에 존재하는 수소결합에 끼어듦

- Ethidium bromide 은 자외선 (UV, 590nm) 를 받으면 오렌지색으로 형광을 내는데 , 이것으로 DNA 의 양과 존재 유무를 알 수 있음

DNA 전기 영동시의 실험 설정 (2)

Ethidium bromide(EtBr)Ethidium bromide(EtBr)

DNA 이중나선에 끼어드는 헤테로 고리 화합물 .DNA 의 염기도 헤테로 고리 화합물로 모양이 비슷하게 생겨서 강한 친화력을 가짐

Discussion

주형 DNA 인 mgsA 를 PCR 을 통해 대량으로 증폭시켜 보았으며 , 증폭시킨 DNA 를 전기영동을 통해 정량할 수 있음을 배웠으며 , 각 기기들의 사용법과 테크닉 , 주의사항을 익힐 수 있었다 .

이러한 PCR 을 통한 증폭은 필요한 특정 DNA 의 부분만을 대량으로 손쉽게 얻어낼 수 있으므로 DNA 칩 제작기술에 원천기술이 되며 , 매우 강력한 툴임을 알게 되었다 .

이상- 끝 -