课程要求：• 每次课后都要做 1~2 题与上课内容相关的练习，学委按学号排好，交到研究生助理师兄师姐处。课程成绩• 期末笔试 60% ，平时成绩 40%• 平时成绩：两次实验报告分数平均 20% ，课后练习 20% 。（ 17 次练习总评）。• 联系方式：黄思齐： 13570564914郑绮姗： 18998498620

Ultraviolet Spectrophotometry, UV

第十章 紫外 - 可见分光光度法

基本要求1. 了解紫外—可见吸收光谱产生的原理2. 了解紫外—可见吸收光谱仪基本构成部件及其作用掌握紫外—可见吸收光谱用途3. 掌握紫外吸收光谱在有机化合物结构解析方面的应用4. 掌握紫外—可见吸收光谱在定量分析方面的应用

第一节 紫外光谱产生原理

物质的吸收光谱光的波粒二象性 波动性： λν= c 粒子性： E = h ν物质对光的选择性吸收 M( 基态 ) + h → M*( 激发态 ) 吸光 M( 基态 ) + h ← M*( 激发态 ) 发光当电磁辐射的能量 hν=E1-E0, 与物质的某种能级相等时，物质吸收光能后发生能级跃迁。

电磁辐射与物质的相互作用 - 常用光谱分析法分类

紫外光谱技术：基于紫外光与物质相互作用，使紫外光信号发生改变，再根据信号的改变对物质进行分析的技术。

紫外光谱产生原理

紫外 - 可见吸收光谱是基于分子外层价电子跃迁产生的吸收光谱，与分子电子结构紧密相关。

4

E （ * ） <150 nm ，远紫外光谱（烷烃）E （ n* ） 约 170-180 nm （含杂原子烷烃， n* 约220 ～ 250 nm ， S ， I ）紫外 : 200 ～ 380 nm ，可见光 : 380 ～

760 nm

Beer-Lambert 定律 ---- 吸收定律A = -log(I / I0) = e c l

• e = 摩尔消光系数• c = 摩尔浓度• l = 比色池长度• A ，吸光度• I ，透射光的强度• I0 ，入射光的强度紫外光谱的吸收与吸光物质的量有关 8

第二节 紫外 - 可见分光光度计的基本结构

紫外 - 可见分光光度计的基本结构

光源 单色器 吸收池 检测系统

记录显示 系统

• 光源 可见光区常用钨丝灯，发射波长（ 325—2500 ）范围，其中最适用范围 320—1000nm 。紫外光区光源常用气体放电光源，如氢、氘放电灯，发射光谱波长 190 —400nm ，最适宜使用范围 180—350nm 。 寿命 :500 ～

800h ，少数达2000h

开关次数与其正常使用时间成反比。最好在需要关灯 4小时以上才关灯。点亮后须要 30 分钟左右的稳定时间。

•单色器使光源发出的光变成所需要的单色光

•吸收池• 紫外及可见分光光度法中，一般使用液体试样。盛放试液的液体池。• 试样放在分光光度计光束通过的光路上。• 可见光区用玻璃吸收池， 400nm ～ 2000nm• 紫外光区用石英吸收池 , 180nm ～ 3000nm:液体池、气体池、微量池（容积 5μl ～ 1ml ）、流动池、长光径池（测量稀溶液用）

•检测器 • 光电倍增管，• 二极管阵列作为检测器。

分光光度计类型• 单光束分光光度计• 双光束分光光度计

一次测量即可得到样品溶液的吸光度，可以连续地绘出吸收光谱曲线，可以消除光源强度变化带来的误差。

• 双波长分光光度计 通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差 A 。 ∆ A =Aλ1-Aλ2

分光光度计类型

优点：测定高浓度、多组分混合试样 , 测定浑浊试样bcAA

II

A )(lg1212

2

1

ee

第三节 分子结构与紫外吸收光谱

紫外吸收光谱在定性分析中的应用

7.0~2.0

%20~%65

：

：

A

T

紫外光图的特点：带状光谱

11

紫外吸收光谱图 • 紫外光谱特性常数：

吸收波长（ λmax ），强度（ ε max ），

• 书写方式：UV (MeOH): λmax 230(ε 11 ， 600) nm

7.0~2.0

%20~%65

：

：

A

T

末端吸收 最强峰肩峰

峰谷 次强峰

max min

A

名词解释

名词解释• 红移： 最大吸收波长向长波方向移动 • 兰移： 最大吸收波长向短波方向移动 • 增色效应：使吸收强度增大的效应 • 减色效应：使吸收强度减小的效应 • 发色团• 助色团

饱和有机化合物 R-H,R-X• * • n *

25

• 不产生紫外吸收的有机化合物

• 烷烃： max<190 nm

甲烷 125 nm ，乙烷 135 nm • 醇、醚、含氮、含硫化合物及卤代物 硫醚、醇 n* 跃迁吸收波长 ~210 nm

分子结构与紫外吸收光谱

发色团：产生紫外吸收及可见光吸收的基团C ＝ C ； C ＝ O ； C ＝ N ；— N ＝ N—N=O; C=S; C≡C; N≡C; X=C=Y

17

ΔE （ π→π* ）约 160-190 nm π 键共轭吸收波长红移至近紫外区及可见光区ΔE （ n→π* ）（含有 C ＝ O ， C=S ， N ＝O ）吸收波长范围在近紫外 270 ～ 290 nm

•产生紫外吸收的有机化合物

烯烃、炔烃和共轭二烯烃及其衍生物• 非共轭烯 * 跃迁 <190 nm 乙烯 165nm(e 15000)

• 共轭体系延长， max 向长波方向移动，且出现多条谱带 , e 增加• H-(CH=CH)n-H, n=8 时 max 在可见光区• π→π* 跃迁特点： ε >104

羰基化合物 C ＝ O C=S 紫外吸收光谱• 醛、酮类化合物

C ＝ O n* 跃迁 ( R ), max270 ～ 300 nm, e100, 呈 平滑带形，对称性强33

芳香族化合物紫外吸收光谱 • * 跃迁，• B 带： 230-270 nm ，中等强度，精细结构为苯的特征谱带• E1 带 180-184 nm ， 一般在远紫外光谱区• E2 带 200 ～ 204 nm ，强吸收带 , 观察不到其精细结构41

结构与紫外吸收的关系

无紫外吸收 产生紫外吸收* 跃迁 n* 跃迁

* 跃迁 键共轭

n* 跃迁及共轭体系

芳环多条谱带* 跃迁

max < 200 nmmax >200 nm

emax ≥104

E2 带K 带

max > 270 nm

eMax<10 0

R 带

E1 带180-184 nm ， max ≥104

E2 带200 ～ 204 nmemax > 1,000

B 带> 250 nm ，有精细结构e max > 200

饱合化合物 共轭烯 羰基化合物

影响吸收带的因素

电荷转移络合物• 富电子 ( donor, D 分子 )和缺 ( acceptor, A 分子 ) 的

2 种分子形成的一类络合物。电荷转移复合物的形成分子吸收辐射后 , 分子中的电子从给体最高占有轨道向受体最低空分子轨道跃迁而发生电子能量吸收 ,这种跃迁称为电荷转移 ,由这种迁移引起的反应称为荷移反应 , 其产物为 CTC 。 εmax >104

l/mol.cm• a阿司咪唑 , b四氰基乙烯

助色团取代：本身不产生紫外及可见光吸收，但与生色团相连时，使生色团的吸收向长波方向移动 , 且吸收强度增大-OH ， -OR ，— NH— ，— NR2— ， -X ， -

SH 、 -Cl, -Br, -I不同助色团的红移顺序为： NH3

+ < CH3 < Cl ， Br < OH < OCH3< NH2< O-

有公式可以定量计算19

影响紫外吸收的结构因素

烯碳上烷基取代基含孤对电子取代基数目增加，max 红移

(CH3)2C=C(CH3)2 ， max197 nm(e 11500)助色基团使 n→π* 跃迁的吸收带蓝移

BrBr

E

¦Ð *

¦Ð

¦Ð *

¦Ð

¦Ð

n

28

n n

n

O

OO

OR

¦Ð*

¦Ð

¦Ð3*

¦Ð2

¦Ð1

助色基与苯相连，产生 p- 共轭，使 E2带、 B 带 max 均红移， B 带吸收强度增大，精细结构消失

OH

B

270 (1450)

E

211

NH2

287 (1450) 235 (9130)

Cl

257 (170) 210 (750)

254 (250)204 (7900)44

不同生色团的红移顺序：

SO2NH2<COO- ， CN<COOH<COCH3<CHO<Ph<NO2

• 苯与生色基团 C=C 、 C=O 、 N=O 共轭，在 200 ～

250 nm 出现 E2 (K 带 >104), ， B 吸收带产生较大红移

46

• 稠环芳烃， B 带 ,E2 带红移

52

58

• 隔离效应：非共轭双键不会影响吸收带的波长（ CH2 有隔离效应）C C CH2 C C

61

介质对紫外吸收的影响溶剂极性增加， K 带移向长波， R 带移向短波

OH O-

+ OH-

溶液的酸碱性 pH 值可影响物质存在形式，影响吸收波长

紫外吸收光谱在结构解析中应用• 紫外光谱的结构信息：谱图简单，只有一、二个吸收峰

70

确定有机化合物构型

紫外吸收光谱在定性分析中应用• 目的是要鉴定出待分析化合物是什么化合物• 做法：吸收光谱的形状 吸收峰的数目 吸收峰的位置（波长） 吸收峰的强度 相应的吸光系数 完全一样（在同样条件下：浓度，比色池厚度）

对比吸收光谱的一致性比较 λmax 、 ε(εmax)看出化合物的区别

消光系数不同

45.3~15.388.1~70.1550

361

278

361

550361278

12

AA

AA

VB

，

三处最大吸收，，定性鉴别：药典规定

药典上的用法：维生素 B12 的吸收曲线分别在 278nm 、 361nm 和 550nm 波长处有三个吸收峰，可通过它的吸收光谱的特征，利用其特征吸收值之间的比值 A361/A278 和 A361/A550 进行定性鉴别，并了解维生素 B12 的纯度。

第四节 紫外吸收光谱在定量分析中的应用

lCEIIBeerLamber 0

lg定律表达式

lCETAIIT

lg0

吸光度

透光率lECAT 1010或

：吸光系数E

描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系

Lamber-Beer 定律：吸收光谱法基本定律

摩尔吸光系数意义：

ε=f （物质性质，温度，溶剂， λ ）•当组分性质、温度和溶剂一定， E=f （ λ ）• 不同物质在同一波长下 ε 可能不同（与吸收的跃迁几率、分子的截面积有关）• 同一物质在不同波长下 ε 一定不同• ε↑ ，物质对光吸收能力↑ , 定量测定灵敏度↑ 根据 ε 大小可区分峰强弱： ε> 104 强吸收 ， 103 ～ 104较强吸收， 102 ～较弱吸收， ε<10 弱吸收 .•在同一波长下，各组分吸光度具有加和性

吸光系数两种表示法： 1 ）摩尔吸光系数 ε ： 在一定 λ 下， C=1mol/L ， L=1cm 时的吸光度 2 ）百分含量吸光系数 / 比吸光系数： 在一定 λ下， C=1g/100ml ， L=1cm 时的吸光度 3 ）两者关系 %1

110 cmEMe

化学因素的影响： 解离、缔合、生成络合物或溶剂化等会对比尔定律产生偏离

偏离吸收定律的因素

强酸性条件下测量酸型，可消除影响

非单色光对比尔定律产生偏离

0201

02011

1210lglgII

IIlCETAlCEE

）（

偏离吸收定律的因素

Ø 透光率的测量误差—— ΔT

7.0~2.0%20~%65

%80.36434.0lg

：，：适宜的浓度范围：对应最小的测量误差

，

AT

TT

TTT

CC

lg434.0

浓度的相对误差

Ø 吸光度测量的条件选择：1 ）测量波长的选择： λmax

2 ）吸光度读数范围的选择： A=0.2~0.73 ）参比溶液 (空白溶液 ) 的选择：

采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰

有一化合物在乙醇溶液中的 λmax 为 240nm ，其 ε为 1.70×104 ，摩尔质量为 314.47. 试问配什么样的浓度测量最合适。A=0.434= εC

浓度分析方法• 吸光系数法（绝对法）

%100%

]/[]100/[

)/()()(

样

已知稀释

或

求含样方法：

CCi

lALmolC

lEAmLgC

CAmLgCigW

i

ii

iEi

e

ü 对照法：外标一点法

注：当样品溶液与标准品溶液稀释倍数相同时S

iSi AACC

AA

标样和分别测定一定方法：

标样与样品浓度相近

；截距为

固定仪器和测定条件；前提：

0sC

iC

C

S

iSi AAmm %100%

mm

i i

ü 标准曲线法

%100%

~

样

同上条件

固定条件

查得测定样品

曲线分别测定配制标准系列方法：

固定仪器和测定条件

CCi

CA

ACA

CACKA

i

ii

Ø 多组分的定量方法 cba AAAA总定量依据：

两组分吸收光谱不重叠（互不干扰） 两组分在各自 λmax下不重叠→分别按单组分定量

a

a

aaaa

EA

CCEA1

111 由

b

b

bbbb

EACCEA

2

222 由

bb

aa

AE

AE

222

111

；测定

；测定过程：

ü 两组分吸收光谱部分重叠λ1→ 测 A1→b 组分不干扰→可按单组分定量测

Ca

λ2→ 测 A2→a 组分干扰→不能按单组分定量测Ca baba

aa

AEE

AE

2222

111

；和测定

；测定过程：

a

a

aaaa

EA

CCEA1

111 由

bb

aababa CECEAAA

22222由

ba

aba

b ECEA

C2

22

ü 两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定（ 1 ）解线性方程组法（ 2 ）等吸收双波长消去法 (3)导数光谱法

解线性方程组法方法：

baba

baba

AEE

AEE

2222

1111

；和测定

；和测定

bb

aaba CECEA

111

bb

aaba CECEA

222

baba

bbabba

a EEEEEAEA

C1221

1221

baba

abaaba

b EEEEEAEA

C1221

2112

等吸收双波长法 方法：

消除 a 的影 响 测b

baba

baba

AAA

AAA

222

111

babbaabababa AAAAAAAAA )()( 212121

aa AAa 2121 和的等吸收点选

bb

bbb

bbba

CE

CEE

AAA

)( 21

21

b

ba

bb

ba

b EA

EEAC

21

消去 b 的影响测a

注：须满足两个基本条件• 选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点• 选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大

bb AAb '2'1'2'1 和的等吸收点选

aa

aaa

aaba

CE

CEE

AAA

)(

'

21

'2'1

a

ba

aa

ba

a EA

EEAC

''

'2'1

clcA ee

，函数把吸收光谱看做波长的

其的导函数图像就是导数光谱

导数分光光度法

n

n

n

n

ddcl

dAdIlc

dd

ddI

e

e

,

一阶导数信号与浓度成正比。二阶、三阶… .n 阶导数信号亦与浓度成正比。特点：解决干扰物质与被测物光谱重叠，消除胶体等散射影响和背景吸收，提高光谱分辨率。

导数吸光度光谱绘制•人工作图法：从吸收光谱的数据中每隔一个波长小间隔 Δλ （ 1 ～ 2nm ），逐点计算出ΔA/Δλ 的值，利用这些数值对波长描绘成图像，就得一阶导数光谱。用类似方法又可从导数光谱中获得高一阶的导数光谱。

ii

ii

i

AAA

1

1

• 仪器扫描法：用双波长分光光度计以固定Δλ （ 1 ～ 2nm ）的两束单色光同时扫描，记录样品对两束光吸光度的差值ΔA ，便得到样品的一阶导数光谱。

• 装有微处理机的分光光度计，利用它的记忆和处理数据的功能，可直接存储吸收光谱的数据并加以处理，可描述一阶、二阶……等各阶的导数光谱。

•导数峰高测量方法如下图：

正切法：相邻峰 ( 极大或极小 ) 切线中点至相邻峰切线 ( 极小或极大 ) 的距离 d ；峰谷法：两相邻峰值 ( 极大或极小 )间的距离 p1或 p2 ；峰零法：极值峰至零线间的距离 z 。

一阶导数光谱法测定阿达帕林脂质体中药物含量

阿达帕林的光谱曲线在 279 nm处有一较大的峰 -谷位值 ,而空白脂质体在此波长的光谱曲线与基线重合 ,故采用 279 nm处一阶导数峰 -谷值 (零谷值 D ) 对阿达帕林测定

• 制备浓度为 6.12, 12.24, 18.36,30.60,

36.72μg·mL-1 的系列溶液。• 以含 12%四氢呋喃的甲醇溶液为空白 , 用一阶导数法测定上述阿达帕林溶液在 279

nm 处的“零谷值” D, 分别为0.0325,0.0642, 0.096 4, 0.1289, 0.1604, 0.1892 。

• 以阿达帕林浓度 (C,μg·mL-1 ) ～“零谷值” D 作工作曲线 , 得回归方程为 :D = 0. 0052C + 0.0015, r = 0.999 7 ( n =3) 。

一阶导数光谱法测定阿达帕林脂质体中药物含量