บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 2การติรวจสอบจ�ลิ�นทร�ย์�ในน��านม

(Determination of Microorganism in Milk )

การติรวจสอบจ�ลิ�นทร�ย์�โดย์อ�อม 2.1 เมทธิ�ลี�นบลี�รี�ดั�กชั่��นเทสต์�

2.2 การีต์รีวจสอบรี�ซาซ�รี�นการติรวจสอบจ�ลิ�นทร�ย์�โดย์ติรง 23. การีน�บจ�ลี�นทรี�ย์�โดัย์กลี�องจ�ลีทรีรีศน� 24 การีน�บจ�ลี�นทรี�ย์�บนจานเลี� ย์งเชั่! อ 25 การีต์รีวจแบคท�เรี�ย์โคลี�ฟอรี�มการติรวจสอบแบคท�เร�ย์อ"�นๆ

2.6 การีต์รีวจหาแบคท�เรี�ย์โรีคเต์�านมอ�กเสบ 27 การีทดัสอบย์าปฏิ�ชั่�วนะในน* านมดั�วย์โย์เก�ต์

บทปฏิ�บ�ติ�การ 21.การติรวจสอบโดย์การเปลิ��ย์นส�ของเมทธิ�ลิ�น บลิ&

(Methylene Blue Reduction Test , MBRT)

หลิ�กการ (Principles)- MBRT เป,นว�ธิ�การีทดัสอบจ�ลี�นทรี�ย์�โดัย์ทางอ�อมหลี�กการี : Methylene Blue เม!�ออย์�-ในสภาวะท��ม�

O2

จะม�ส�น* าเง�น จะเปลี��ย์นเป,นส�ขาวในสภาพท��ม� CO

2

-ชั่��วโมงการีเปลี��ย์นของ MRBT จะส�มพ�นธิ�ต์รีงข�ามก�บจ*านวนแบคท�เรี�ย์

ข�อจ*าก�ดัอย์�-บ�างในการีต์รีวจสอบดั�งน� -แบคท�เรี�ย์บางชั่น�ดั เชั่-น BB . .

Subtilis จะเปลี��ย์นส�ไดั�ชั่�า - Somatic cell แลีะเม3ดัโลีห�ต์ขาวจะฟอกส�

Methylene Blue ไดั�เชั่-นก�น

ว�ธิ�การ (Method) 1 . ไปเปทสารีลีะลีาย์ของ MRBT 1ml. ลีงในหลีอดัต์รีวจสอบ 2. ไปเปทน* านมต์�วอย์-าง 10 ml. ลีงหลีอดัทดัสอบดั�งกลี-าวพรี�อมท� งป4ดัฝา

น*าเข�าไปแชั่-ในอ-างน* าอ� -น 37( + 5 C) ป4ดัฝาอ-างป6องก�นแสง 3. จ�บเวลีาส�งเกต์การีเปลี��ย์นแปลีงส�ของเมธิ�ลี�น บลี� ท�กๆชั่-วงเวลีา 12 1

2 37 8 ชั่ม .อ-านผลีโดัย์กลี�บหลีอดัไป-มา แลี�วดั�ลี�กษณะส�ท��

ปรีากฏิเห3นในแต์-ลีะชั่ม. 4. ท*าหลีอดัควบค�มโดัย์ใชั่�น* านม แต์-ไม-ใส-สารีลีะลีาย์ส�

การว�เคราะห�ผลิ

อ�นดั�บ เกรีดั รีะย์ะเวลีาของการีรี�ดั�วซ�1 ดั�

มากไม-เปลี��ย์นส�ในเวลีา 8 ชั่ม.

2 ดั� เปลี��ย์นส� 8 ชั่ม. แต์-ไม-น�อย์ กว-า 6 ชั่ม.

3 พอใชั่�

เปลี��ย์นส� 6 ชั่ม. แต์-ไม-น�อย์ กว-า 2 ชั่ม.

4 ไม-ดั� เปลี��ย์นส�ภาย์ในเวลีา < 2 ชั่ม.

บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 22.การติรวจสอบร�ซาซ&ร�น (Resazurin

Reduction Test, RRT)

หลิ�กการ (Principles) - RRT ค!อปฎิ�กรี�ย์า - oxidation reduction ของสารีเคม�ท��ม�ความไวเปลิ��ย์นส�- ใชั่�หลี�กการีคลี�าย์ MRBT-การีเปลี��ย์นส�ของต์�วอย์-างน* านม จะอ-านผลีภาย์ใน 1ชั่��วโมงข��นติอนปฏิ�ก�ร�ย์า

ข� น 1 Resazurin ---------------- > Resorufin

(ส�น* าเง�น ) ( ส�ชั่มพ� ) ข� น 2 Resorufin---------------- > Hydroresorufin (ส�ชั่มพ� ) (ไม-ม�ส� ,ขาว)

ว�ธิ�การ (Method) 1. ไปเปท รี�ซาซ�รี�น 1ml. ใชั่�ในหลีอดัต์รีวจสอบ 2. ไปเปทต์�วอย์-างนม 10ml. ใส-ลีงไปในหลีอดัดั�งกลี-าว ป4ดัฝาแลีะกลี�บ หลีอดัไปมา - 23

ครี� ง แลีะน*าไปวางในอ-างน* าท�� อ�ณหภ�ม� 37 +5

C) ป4ดัฝาอ-างน* าให�ม�ดัชั่�ดั 3. เม!�อครีบเวลีา 1 ชั่��วโมง น*าหลีอดัทดัสอบมาเท�ย์บส�ก�บจานส� lovibond comparation

การว�เคราะห�ผลิ

ส�ของติ�วอย์-างน��านม ค�ณภาพของน��านม การติ�ดส�น

ส�น��าเง�น (ไม-เปลิ��ย์นส� ), Blue ด�มาก ด�มากส�ม-วงปนชมพ& , Lavender ด� ด�ส�ชมพ& , Pink พอใช� น��านมก�าลิ�งเส�ย์ส�ขาว , Colourless ไม-ด� น��านมเส�ย์

บทปฏิ�บ�ติ�การ 23การติรวจน�บจ�ลิ�นทร�ย์�โดย์กลิ�องจ�ลิทรรศน�

(Direct Microscopic Count, DMC)

หลิ�กการ (Principles)

-เป,นว�ธิ�ต์รีวจน�บแบคท�เรี�ย์ในน* านมโดัย์ต์รีงดั�วย์กลี�องจ�ลีทรีรีศน�

ให�ผลีรีวดัเรี3วแลีะส� นเปลี!องน�อย์ - แต์-ต์�องอาศ�ย์ความชั่*านาญ

ว�ธิ�การ (Method)การเติร�ย์มแผ-นสไลิด�ติ�วอย์-างนม โดย์ท*าเครี!�องหมาย์รี�ปส��เหลี��ย์มพ! นท�� 1 ต์รี.ซม .ไว�ท��ใต์�แผ-นสไลีดั�

1 cm2 1 cm2

การท�า smear-อ� -นน* านม (37 C ) แลีะ กวนให�เป,นเน! อเดั�ย์วก�น -ใชั่� loop ท��ฆ่-าเชั่! อแลี�ว แต์ะน* านมต์�วอย์-าง 1 loop001( . ml. ) เกลี��ย์ลีงบนพ! นท��ส��เหลี��ย์มให�เต์3ม

แลีะเรี�ย์บ-ปลี-อย์แผ-นสไลีดั�ให�แห�งบนถาดัอ�-นสไลีดั�

3 การย์�อมส� -จ�-มแผ-นสไลีดั�ท��ท*า smear แลี�ว ลีงใน Xylene นาน

- 12 นาท� เพ!�อขจ�ดัไขม�น-ลี�างสไลีดั�ดั�วย์น* าเปลี-า โดัย์เป4ดัน* าก?อกเบาๆ รี�นผ-านส�กครี� - แลี�วปลี-อย์ให�แห�ง- น*าแผ-นสไลีดั�ท��แห�งแลี�ว มาจ�-มแอลีกอฮอลี� 95%นาน - 12 นาท� เพ!�อ fix smear

แลี�วต์ากให�แห�ง-น*าสไลีดั�มาย์�อมดั�วย์ส� Loeffler's methylene

blue โดัย์หย์ดัน* าย์าส� - 12 หย์ดัให�น* าย์าท-วมแผ-นสไลีดั� ท� งไว� 2 นาท� ลี�างส�ออกดั�วย์น* าเปลี-าอ�กครี� ง -แลี�วต์ากแห�ง ก-อนน*าไปส-องในกลี�องจ�ลีทรีรีศน�ต์-อไป

การใช�กลิ�องจ�ลิทรรศน�การใช�กลิ�องจ�ลิทรรศน�-ปรี�บกลี�องจ�ลีทรีรีศน� เรี��มจากก*าลี�งขย์าย์ต์*�า 40

X แลี�วจAงปรี�บไปท��ห�วoil

ข�อส�งเกต์ในการีต์รีวจข�อส�งเกต์ในการีต์รีวจ- แบคท�เรี�ย์ ย์�อมต์�ดัส�น* าเง�นเข�ม- เม3ดัเลี!อดัขาว ย์�อมต์�ดัส�น* าเง�นเข�ม- โซมาต์�กเซลีลี� ย์�อมต์�ดัส�น* าเง�นเข�ม- โปรีต์�น ย์�อมต์�ดัส�ฟ6าเป,นพ! นหลี�ง- ไขม�น ย์�อมต์�ดัส�ขาวหรี!อไม-ต์�ดัส�- ส��งสกปรีก,ฝ�Bน ย์�อมต์�ดัส�เป,นเม3ดัดั*าหรี!อ

น* าต์าลี

การค�านวณจ�านวณแบคท�เร�ย์ (Calculation)

จ�านวนแบคท�เร�ย์ใน 1 ml. = ค-าเฉลิ��ย์จ�านวนแบคท�เร�ย์ใน 1 field x conversion factor

ย์กติ�วอย์-างการค�านวณหาแบคท�เร�ย์ในน��านมกลิ�องจ�ลิทรรศน�ม�ห�ว oil เส�นผ-าศ&นย์�กลิางเท-าก�บ 0.21

ม�ลิลิ�เมติร จ�านวนโคโรน�ท��น�บได�ใน 30 flied ค"อ 4 5 จ�านวนแบคท�เร�ย์ในน��านม ?

1. หาค-าเฉลิ��ย์จ�านวนแบคท�เร�ย์ใน 1 field = 45 30/ 1= .5

2. จ�านวนแบคท�เร�ย์ในน��านม = 1.5 x 300 000,

= 450,000 เซลิลิ� / ml.

บทปฏิ�บ�ติ�การ 24การน�บจ�ลิ�นทร�ย์�บนจานเลิ��ย์งเช"�อ (Standard

Plate Count, SPC)

หลิ�กการ (Principles)-ว�ธิ� Standard Plate Count น� เป,นการีเพาะเลี� ย์ง

เชั่! อในอาหารีท��จ�ลี�นทรี�ย์�ส-วนมากสามารีถเจรี�ญเต์�บโต์ไดั�

-หลี�งจากน� นแลี�วจAงน�บจ*านวนโคโลีน� (colony)-ค-าท��ไดั�บ-งชั่� ถAงความสะอาดัของน* านมดั�บ(ความสะอาดั

ในการีรี�ดันม แลีะความสะอาดัของอ�ปกรีณ� โรีคเต์�านมอ�กเสบ)

ว�ธิ�การ (Method) 1 .การวางแผนการท�า Dilution

ในน��านมด�บจะม�จ�านวนแบคท�เร�ย์อย์&-เป4นจ�านวนมาก จ5งติ�องท�าเจ"อจางก-อนเพาะเลิ��ย์ง1 .ข��นติอนการเติร�ย์ม dilution น��านมชน�ดติ-าง ๆ

Dilutionท��เหมาะสมควรม�จ�ลิ�นทร�ย์�เก�ดอย์&-ในช-วง - 30300 โคโลิน�

9ml. H2

O11:0

A

9ml. H2

O11:0 0B

9ml. H2

O11:0 00

C

9ml. H2

O11:0 ,00

0D

1.

1.

1.

1.

1. การเลิ"อกใช� dilutions ก�บน��านมชน�ดติ-าง ๆ

ชน�ดติ�วอย์-างน��านมชน�ดติ�วอย์-างน��านม DilutionDilutionss

standard plate c ount (SPC)

Coliform

น��านมด�บ 1: 1,000 (10 -3 )1: 10,000 (10 -4 )

1: 100 (10 -2 )1: 1,000 (10 -3)

น��านมพาสเจอร�ไรส� 1 10 10: ( - 1 ) 1 100 10

-

2 ) 1 1 000 1: , (

0 - 3 )

1 1 10:

1: 1 00,

นมย์&เอชท� 11 10 10: ( - 1 )

11 10

10-1)

SPCกลิ�-ม ............

.ติ�วอย์-างน��านมด�บDilutio

n 1 :10

ว�น

SPCกลิ�-ม ..........

...Contr

olว�นท��

4. การเพาะเช"�อ4.1 น�าจานท��จะใช� มาเข�ย์นช"�อติ�วอย์-าง

น��านม1. การหย์ด Dilution-. ใช� ไปเปท ลินไฟ ก-อนด&ดน��านมจาก dilution ติ-างๆ ท��

ท�าไว� จ�านวน 1ml. ลิงในจานเลิ��ย์งเช"�อ 2. การเท Agar ( ติรวจอ�ณหภ&ม�agarติ�องไม-ร�อนเก�น

ไปใช�หลิ�งม"อแติะขวดพอทนได� )- ใช�ไฟติะเก�ย์งลินปากขวด agar ก-อนเป8ดฝา- แลิะเท agar ประมาณ 15 ซ�ซ� ส&-จานเลิ��ย์ง- วางจานบนโติ:ะใช�ม"อจ�บฝาจาน แกว-งติ�วจาน- ในแนวราบบนโติ:ะให� agar เข�าก�นด�

44. วางรีอจน agar แข3งต์�ว น*าเข�าอบท��อ�ณหภ�ม� 32 C นาน 48 ชั่��วโมง

การีวางจานน� นต์�องกลี�บคว*�าจานเลี� ย์งเชั่! อลีง 46 เม!�อครีบ 48 ชั่��วโมง แลี�วน*าออกมาน�บ

จ*านวนโคโลีน�โดัย์ใชั่�เครี!�อง (colony counter) แลีะรีาย์งานผลีในหน-วย์ของโคโลีน�ต์-อml.ของน* านม ( col

ony/ml )

5. การอ-านผลิ 51. เลิ"อกน�บจากจานท��ม�จ�านวนโคโลิน� 30-300 โคโลิน� หากท�กจานม�มากกว-า 300 โคโลิน�ให� ราย์งานเป4น น�บไม-ได� จ�านวนแบคท�เร�ย์ท��น�บได�ในแติ-ลิะจาน = จ�านวนแบคท�เร�ย์ท��น�บได� / ค-า diluteติ�วอย์-างเช-น

น�บจ�านวนแบคท�เร�ย์ได� 250 โคโลิน� ท�� dilution 1 x 10 - 3 0 001( . )

จะม�จ�านวนแบคท�เร�ย์ = 250 / 0001. = 250,000 cfu/ml

หร"อ= 250 x 1 000 250 000, = , cfu/ml

*cfu = colony forming unit

บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 25 การติรวจสอบแบคท�เร�ย์โคลิ�ฟอร�ม

-เป,นว�ธิ�ท��ใชั่�ต์รีวจสอบน* านมภาย์หลี�งจากท��ท*าการีฆ่-าเชั่! อแลี�ว

-ลี�-มโคลี�ฟอรี�มไดั�แก- Coliform bacteria จ*าพวก -gram negative

เชั่-น BBBBBBBBBBB (E. Coli ) ก�บ Enterobacter (หรี!อ Acrobacter)

ความส*าค�ญของแบคท�เรี�ย์โคลี�ฟอรี�ม 1. โคลี�ฟอรี�มเป,นแบคท�เรี�ย์ท��พบไดั�ท��วไปในนม

ดั�บ 2. โคลี�ฟอรี�มไม-ทนในอ�ณหภ�ม�ฆ่-าเชั่! อนมพาสเจ

อรี�ไรีส�ดั�งน� นการีพบแบคท�เรี�ย์ในน* านมท��พาสเจอรี�ไรีส�แลี�ว

แสดังว-าม�การีปนเปC อน

ว�ธิ�การ (Method)-อ� -น Agar ให�อย์�-ในสภาพลีะลีาย์-เต์�มน* านม dilution ต์�วอย์-างลีะ 1ml. ต์-อ 1 จาน

( หากเป,นน* านมดั�บให�ใชั่� 1101100Dilution : , :แลีะน* านมพาสเจอรี�ไรีส�ใชั่� 11 110: , : )

-ให�เท ว� �นแดัง ( Violet red bile agar) ท�บในแต์-ลีะจาน จานลีะ 10 มลี . หม�นจานให�ส-วนผสมเข�าก�นแลีะต์� งท� งไว�ให�ว� �นแข3ง

-น*าจานว� �นท��แข3งต์�ว บ-มในต์��อ�ณหภ�ม� 37 C นาน 24 ชั่ม .

-เม!�อครีบเวลีาให�น*าจานออกมาต์รีวจน�บ -ลี�กษณะโคโลีน�จะเป,นส�แดังเข�มขA นอย์�-ในเน! อว� �น -รีาย์งานผลีเป,น โคโลีน�ต์-อมลี .

= จ*านวนโคโลีน�/จาน x อ�ต์รีาเจ!อจาง

บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 26

การติรวจโรคเติ�านมอ�กเสบโดย์ว�ธิ� California Mastitis Test

-CMT เป,นว�ธิ�ท��ใชั่�การีปรีะมาณค-า somatic cellโดัย์อาศ�ย์ปฏิ�ก�รี�ย์าของ Sodium hydroxide ซA�งจะท*าให�เซลีลี�แต์กสลีาย์ แลีะ ท*าให�โปรีต์�นของเม3ดัโลีห�ต์ขาวเก�ดัการีต์กต์ะกอน-จ�บก�นเป,นก�อนหน!ดั ปรีากฎิให�เห3นดั�วย์ต์าเปลี-า

ว�ธิ�การ ( Method ) 1. ใชั่�ไปเปทดั�ดัน* านมใส-ในจานหลี�มท� ง 4 จาน ๆ ลีะ - 25ml. 2. ไปเปท CMT ใส-จานท� ง 4 จาน (น* าย์า

CMT : น* านมต์�วอย์-าง = 1 :1 ) 3. แกว-งถาดัจานหลี�มวนเป,นวงกลีมอย์-างชั่�า ๆ ให�คะแนนแลีะส�งเกต์การีเก�ดัต์ะกอนจ�บเป,นก�อนท�นท�ภาย์ใน 10 ว�นาท�

ส�ญลิ�กษณ�

% การ ส&ญเส�ย์

ปฏิ�ก�ร�ย์า ลิ�กษณะปฏิ�ก�ร�ย์า จ�านวนจ�ลิ�นทร�ย์� ( / )

- 0 negative ส-วนผสมเหลิวปกติ�ไม-ม�ติะกอน, ส�ม-วง

0-200,00

T 3 trace ส-วนผสมข�นเลิ=ก น�อย์ แติ-ไหลิได�

ปกติ�, ส�ม-วง

150,000- 500,000

1 11 WeakPositive

ส-วนผสมเร��มหน"ดพอเห=นไหลิเป4นเส�น, ส�ม-วง

400,000 - 1,500,000

2 28 DistinctPositive

ส-วนผสมหน"ด ติรงกลิางม�ติะกอนไม-ค-อย์ไหลิ, ส�ม-วง

800,000 - 5,000,000

3 46 StrongPositive

ส-วนผสมหน"ด ติรงกลิางม�ติะกอนเหน�ย์วติ�ดอย์&-ติรงกลิางช�ด, ส�ม-วง

>5,000,000

+ ใส-ส�ญลิ�กษณ�เพ��มในกรณ�

Alkalinemilk

70pH .หร"อมากกว-า

ให�ใส- + ติามติ�วเลิขในกรณ�เห=นเป4นส�ม-วง

การหลิ��งน��านมผ�ดปกติ� เติ�านมอ�กเสบ

แบบไม-ติ�ดเช"�อ ไม-แสดงอาการ

Y ใส-ส�ญลิ�กษณ�เพ��มในกรณ�

Acid milk ,

pH < 5 .2

ให�ใส- Y ติามติ�วเลิขในกรณ�เห=นเป4นส�เหลิ"อง

แสดงว-าม�จ�ลิ�นทร�ย์�ท�าให�น��านมเส�ย์

หมาย์เหติ� : รีะว�งการีอ-านผลีต์รีวจน* านมจากโคแรีกคลีอดัแลีะชั่-วงปลีาย์การีให�นม ซA�งจะให�ผลีบวก

บทปฏิ�บ�ติ�การท�� 27 การทดสอบย์าปฏิ�ช�วนะในน��านมด�วย์โย์เก�ติ

-ปDญหาน* านมท��พบบ-อย์ ค!อการีปลีอมปนย์าปฏิ�ชั่�วนะหรี!อสารีป6องก�นการีเส�ย์ของน* านม

ว�ธิ�ต์รีวจอย์-างง-าย์ค!อการีท*าโย์เก�ต์เทส ( Yogurt test )

-โดัย์น* านมท��ม�สารีก�นนมเส�ย์เม!�อใส-จ�ลี�นทรี�ย์�จากโย์เก�ต์ เพาะเลี� ย์งแลี�วจะพบว-าเชั่! อต์าย์ -ต์-างก�บน* านมท��ไม-ม�สารีป6องก�นเส�ย์ เชั่! อจะเจรี�ญไดั� ท*าให�น* านมเก�ดัต์ะกอน

การติรวจสอบย์าปฏิ�ช�วนะเบ"�องติ�นโดย์ว�ธิ� PlainYoghurt

ว�ธิ�การ1.ใชั่�โย์เก�ต์จ!ดั 1 ถ�วย์ 150 กรี�ม ) ผสมน* าเย์3น

150 มลี . คนให�เข�าก�น2.น*าน* านมดั�บ 10 มลี . ต์�มเดั!อดั 10 นาท� แลีะปรี�บอ�ณหภ�ม� - 3537 C3.ใส-โย์เก�ต์ท��เต์รี�ย์มไว� 1 ซ�ซ� . ลีงในหลีอดัน* านม เขย์-าให�เข�าก�น4.บ-มใน Water Bathอ�ณหภ�ม� 48 C นาน 3ชั่��วโมง5.ท*าต์�วอย์-าง Bank แลีะ Control เพ!�อเปรี�ย์บก�บผลีจากน* านมดั�บ

การอ-านผลิ-ถ�าต์�วอย์-างน* านมม�การีจ�บต์�วเป,นก�อน/หน!ดั อ-านผลีเป,นลีบ - ( ) ค!อไม-ม�สารีย์�บย์� งจ�ลี�นทรี�ย์�-ถ�าต์�วอย์-างน* านมย์�งเป,นน* านมปกต์� ไม-หน!ดัให�อ-านผลีเป,นบวก (+) ค!อ อาจม�สารีย์�บย์� งการีเจรี�ญเต์�บโต์จ�ลี�นทรี�ย์�

การติรวจสอบย์าปฏิ�ช�วนะโดย์ว�ธิ� Yoghurt with Bromocresol Purple

-ใชั่� โย์เก�ต์รีสจ!ดัไม-ต์�องเจ!อจาง-ใชั่�นม 2 ซ�ซ� . ต์�มในน* าเดั!อดั 10 นาท� แลีะปรี�บ

อ�ณหภ�ม� - 3537 C-ผสมโย์เก�ต์ 01. ซ�ซ� . ปรีะมาณ 1 หย์ดั + BCP

02. ซ�ซ� B 2 หย์ดั ) เขย์-าให�เข�าก�น-บ-มใน Water Barth อ�ณหภ�ม� 45 C นาน 3

ชั่��วโมง

การอ-านผลิ ต์�วอย์-างถ�าม�ส�เหลี!อง =

ผลีลีบ ต์�วอย์-างถ�าม�ส�น* าเง�น = ผลี

บวก