遺伝子の解析遺伝子の解析第第 22弾　弾　 DNADNAシークエンスシークエンス

法法

DNADNAシークエンスシークエンス（（ ABIABI　　 PRISMPRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む）３１０を用いて遺伝子の配列を読む）

ABI　 PRISM３１０についてABIABI　　 PRISMPRISM３１０での３１０でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよばれる方法で行っています。まず、 PCR反応で A,G,C,Tそれぞれに、励起する波長が異なる４種類の蛍光色素をｄｄNTPにつける方法（ Dye　 Terminator法）を用い、その標識された DNAフラグメントを内径５０ μｍのキャピラリー管のなかで電気泳動を行い A,G,C,Tそれぞれの蛍光を CCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができます。

オートシークエンサー（（ ABIABI　　 PRISMPRISM３１０）３１０）の反応では合成される DNAを蛍光物質で標識します。その標識された DNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を自動で検出し、コンピューターで解析します。

原理

～～ DNADNAシークエンスの流れシークエンスの流れ～～

PCRにて目的の DNA量を増やす。（同時に蛍光標識も行う）

エタノール沈殿にて目的 DNAの分離・精製

オートシークエンサーにて目的 DNAの塩基配列の読み取り

Ｐ 塩基

OH

Ｐ 塩基

H

デオキシヌクレオチド（ｄ NTP）と

　　　　　ジデオキシヌクレオチド（ｄｄNTP）

デオキシヌクレオチド（デオキシヌクレオチド（ dNTdNTPP））

ジデオキシヌクレオチド（ジデオキシヌクレオチド（ ddNTddNTPP））

dNTPと ddNTPは PCR法でそれぞれ DNAの構成単位として利用されます。違いは３ ´の位置の水酸基が水素基になっていることです。 Nには A,T,G,Cの 4種類の塩基が当てはまります。

dNTPdNTPとと ddNTPddNTPの伸長反応の違いの伸長反応の違い

５ ´末端

３ ´末端

３ ´末端

A A

T T T

Ｇ

ＧＣ

Ｐ Ｐ Ｐ

Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ

OH

伸長反応は Stop３ ´末端

T T T

Ｇ

ＧＣ

A

Ｐ Ｐ

A

Ｐ

Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ

A

Ｐ H５ ´末端

ddATPが

反応した場合

dATPが

反応した場合３ ´末端

T T T

Ｇ

ＧＣ

A

Ｐ Ｐ

A

Ｐ

Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ

A

Ｐ OH５ ´末端

続く

dNTPdNTPとと ddNTPddNTPが一緒にあるとが一緒にあるときにきに PCRPCR反応をすると・・・・反応をすると・・・・

A*,T*,G*,C*が取り込まれると、そこで伸長反応が停止するのでいろいろな長さ（分子量）の DNA断片が作られる

dNTPを A,T,G,Cとし、 ddNTPを A*,T*,G*,C*とする

ACGTACGTGCATGC

５´ ５ ´３ ´

３ ´

A*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

ACG*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

ACGTACG*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

ACGT*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

テンプレート DNA

PCR反応

Ｐ 塩基

H

蛍光色素

Dye　 Terminator法

P

H

P

H

P

H

P

H

A T G C

ddNTPの４種類の塩基（ A,T,G,C）それぞれに異なった蛍光色素を標識することで 4種類の ddNTPを見分けることができる。

ACC*TGGATGC

５´ ５ ´３ ´

ACG*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

ACA*TGTATGC

５´ ５ ´３ ´

ACT*TGAATGC

５´ ５ ´３ ´ ほぼ同じ長さ（分子量）だ

が

これら４種類の DNAを

区別することができる

蛍光色素で標識することで・・・・・

ゲル電気泳動の分子ふるい効果ゲル電気泳動の分子ふるい効果DNAは負電荷を持つ高分子なので全て＋極へ進みます。 DNAの分子量が小さいほど（短いほど）ゲルマトリックスとのふるわれ方が少なく、進みやすくなります。このように一定時間泳動すると分子量の差によって DNAが分離されることを分子ふるい効果といいます。

－

＋

ゲルマトリックス

低分子 DNA

高分子 DNA

ACGTACGTGCATGC

５´ ５ ´３ ´

３ ´

Ex)塩基配列を知りたい（水色部分が知りたい部分） DNA

Dye　 Terminator法を利用して PCRをすると

A*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

ACG*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

ACGT*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

AC*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

ACGTA*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

ACGTAC*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

ACGTACG*TGCATGC

５´ ５ ´３ ´

出来上がった DNA断片

プライマー

PCRで作られた DNA断片をポリマーを充填した（ゲルと同様）キャピラリー管の中で電気泳動をすると

－

＋

分子ふるい効果

により短い断片

が早く＋極側へ

移動する

A*５´

ACG*５´

ACGT*５´

AC*５´

ACGTA*５´

ACGTAC*５´

ACGTACG*５´

ACGTACGTGCATGC

５´ ５ ´３ ´

蛍光のついた塩基を早く＋極側についた順に並べると

ACGTACG

よって知りたかった塩基配列は ACGTACGとなる

参考文献

改訂遺伝子工学実験ノート　羊土社　　　　　バイオ実験超基本 Q&A　羊土社

実際のシークエンス結果（一部抜粋）