生化学合同講義（ 2009 年 6 月 3 日）
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生命科学研究科、山本和生 [email protected]. 生化学合同講義（ 2009 年 6 月 3 日）. 「 突然変異生成の分子機構 」 1) 突然変異をどのように把握するか 2) 突然変異とがん. File の upload http://www.biology.tohoku.ac.jp/~kazuo/09seikagaku/. 突然変異 (mutation). 塩基配列が変化する（広い意味での変化）。 その結果 表現型が変化 する。 ( 表現型の変化が子孫（広い意味の子孫）に伝わる ) 。 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
生化学合同講義（ 2009年 6 月 3日）
生命科学研究科、山本和生 [email protected]
「突然変異生成の分子機構」 1) 突然変異をどのように把握するか 2) 突然変異とがん
Fileの uploadhttp://www.biology.tohoku.ac.jp/~kazuo/09seikagaku/
突然変異 (mutation)
塩基配列が変化する（広い意味での変化）。 その結果表現型が変化する。 ( 表現型の変化が子孫（広い意味の子孫）に伝わる ) 。表現型の変化しない塩基配列変化はヒトの場合 0.1%の頻度で全員にある（ polymorphism)
意義；進化（多様性）・がん・遺伝病
生物は適応的に変異が生じて進化したのではなくて，ランダムに生じた変異が淘汰されることによって進化した（非ラマルク説）。
遺伝と遺伝病遺伝病は遺伝現象を担っているもの（遺伝子や染色体）の異常によって起こる病気
もし異常が体細胞（手や肝臓などの細胞）に起きた場合，遺伝病にはなるが遺伝はしない。
もし生殖細胞（精子や卵子になる）に起きた場合，遺伝する可能性がある。
ヒトは全員， 20〜 30個の遺伝病をヘテロ接合体（ T/t）の状態で持っている。多くは劣性なので発現（発病）しない。
genetic disease（遺伝子病）inheritant disease（遺伝する病気）
遺伝病とは遺伝病は遺伝という現象を担っているものすなわち遺伝子や染色体の異常によって起こる病気を言う。「遺伝病とは遺伝する病気」と言うわけではない。 伝わるとか伝わらないという概念とは違う。
親が正常でも突然変異によって起こる遺伝病もある。先天異常についていえば，病気の赤ちゃんの多くは，まったく正常な両親から生まれており，けっして特別な人がかかわるわけではない「自分自身が遺伝病に罹患しているかもしれないし，遺伝病の子が生まれるかもしれない」というのが正しい理解。
常染色体劣性遺伝病
健康保因者同士の結婚で，生まれる子供の４人に１人が病気になる
劣性遺伝病 -1
両親とも保因者で，それぞれ 1 個は白丸， 1 個は黒丸を持っている場合，患者が生まれることがある。どちらから白あるいは黒が伝わるかで， 4 通りの組み合わせが出来る。白と白なら正常，白と黒は健康で保因者，黒と黒なら病気の子となる。すなわち，保因者同士のカップルからは， 4 人に1 人の割合で病気の子供が生まれる。
劣性遺伝病は 1 万人から 10万人に一人の割合で起こるものが多い。平均して発生頻度が 4 万人に 1 人の病気の場合，患者すなわち黒丸二個の人は 4 万人に 1 人の割合で生まれるが，保因者すなわち黒丸 1 個の人がどれくらいいるかというと，答えは100人に 1 人である。 4 万人に 1 人と大変稀な病気であっても，保因者の頻度は二桁も高くなる。
算数の問題；ある劣性遺伝病の発生頻度が 4 万人に 1 人とする。保因者同士のカップルからは， 4 人に 1 人の割合で病気の子供が生まれる。保因者は何人に 1 人か？保因者を X 人に一人とすると，(1/X)2 x (1/4) = 1/40000: この式より， X2 = 10000；X = 100
Hardy-Weinberg の法則
野生型遺伝子 (A)の頻度を p変異遺伝子 (a)の頻度を q (p + q = 1) とする。健康保因者 (Aa)の頻度についてAA : Aa : aa = p2 : 2pq : q2
ある遺伝病患者が 40000人に一人とすると，aa（遺伝病）の頻度 q2 = 1/40000, q = 1/200p = 1- q = 1-1/200 = 199/200Aa（保因者）の頻度 = 2pq = 2 x 199/200 x 1/200 = 199/20000 = 99.5/10000 ≒ 1/100
別の解き方；保因者の頻度を y とすると，保因者同士が結婚する確率は y2，その結婚から患者が生まれる確率は 1/4、以上より， y2 x 1/4 = 1/40000。この式を解くと， y = 1/100
A A
aaAA
Aa Aa
aa
パネットの方形
劣性遺伝病 -2常染色体劣性遺伝病は先天代謝異常症を中心に約2000種類知られている。すべての疾患の頻度が明らかになっているわけではないが，保因者頻度を 100人に 1 人程度とすると， 2000 x 1/100 = 20となり，すべての人は常染色体劣性遺伝病の病的遺伝子を 20個程度持っているということになる。「全てのヒトはみな保因者」である。
よく，劣性遺伝病の子供が生まれると，親は自分たちが保因者だったことを重く見て落ち込む人がいるが，それはたまたま病気の子供が生まれ， 1 個分の黒丸を持っていたことがわかっただけで，全ての人は，等しく 20個の遺伝病を持っていることを忘れてはならない。保因者であることは，恥ずべきことではない。
塩基と大きさ
Purines Pyrimidines
Adenine Thymine Weak
Guanine Cytosine Strong
Large Small
DNAの化学 -1
DNAの化学 -2
DNA, RNA, thymine, uracil
2-Deoxyribose2-Deoxyribose RiboseRibose
ThymineThymine UracilUracil
22
1111
2233 33
4444
55 55
Nucleotide
3 components to nucleotides:-Purine(A & G) or pyrimidine(T & C) base-Ribose (RNA) or 2-deoxyribose (DNA) sugar -Phosphate
Base + sugar = NucleosideBase + sugar + phosphate = Nucleotide
DNAの方向性について
G C
T A
C G
T
T
A
A
P
P
P
P
P
P
P
P
P
PPP
:
:
:
:
ÅE
ÅE
5'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
3'
3'
ÉfÉIÉLÉVÉäÉ{Å[ÉYÉäÉìé_
âñäÓOH
OH
HO
Dinucleotideの構造
The 3’ C of one nucleotide is linked to the 5’ C of the next nucleotide in a phosphodiester linkage.
O
O
CH2O
3'
POO
O
HN
NN
N
NH2
O
OH
CH2OPO
O
H
N
N
O
NH2
5' cytidylyladenylateor5'pCpA
5'
3'
5'
5’pCpA3’
3’
5’
Watson and Crick’s DNA
model
10
10 塩基で１
回転
塩基で１
回転
幅は一定幅は一定
Purine facesPurine faces
pyrimidine pyrimidine
andand
vice-versavice-versa
2 nm
3.4 nm
Mutations
Point Mutations -- DNA複製間違い1. transitions 2. transversions 3.
frameshift mutations 4.deletionStructural Mutations -- 染色体の組み換え間違い
1. Deletions 2. Inversions 3.Translocations 4. DuplicationsChromosome Mutations -- 細胞分裂間違い 1. Polyploidy 2. Aneuploidy
transitionと transversionを総称してbase substitution（塩基置換）という
Point Mutations
プリン
アデニン (A)
グアニン (G)
ウラシル (U)
チミン (T)
シトシン (C )
ピリミジンピリミジン
1. transitions (change from pupu or pypy)2. transversions (pu ⇔ py) keto-enol tautomerism
thermal depurination (10,000 adenines per cell per day) deamination (cytosine), oxidation (guanine) replication error3. frameshift mutations replication slippage4. Deletion
replication slippage recombination
Transitionと transersion
5’-GATCC-3’-CTAGG-
-GACCC--CTGGG-
transition
5’-GATCC-3’-CTAGG-
-GAGCC--CTCGG-
transversion
Transitionのほうがよく起こる。 Transitionや transversion突然変異生成やそれを抑制する機構に違いがある。
Transition tautomeric shift depurination
Tautomeric Shifts
C
C C
C
N N
H
O
H
CH3
O
H
thymine( 通常はケト型 )
(adenineと対合 )
tautomeric shift
C
C C
C
N N
H
H
CH3
HO
O
thymine( まれにエノール型 )(guanineとも対合 )
4
5
6
1
2
3
tautomeric shiftアデニン，シトシンのイミノ型への tautomeric shift 及びグアニン，チミンのエノール型への tautomeric shiftはおおよそ 10-4〜 10-5の頻度で起きている。下はグアニンの例。
HN
O
N
H
dR
N
N
NH2
9
8
76
5
43
2
1
OH
N
H
dR
N
N
NH2
9
8
76
5
43
2
1
ケト型グアニン（正常型）
エノール型グアニン
N ここが変わる
tautomeric shiftの結果， dGは dTと結合できるようになる。
チミン tautomerによる変異
A T-e
G:T-e
normal G C
mutant
GT-e A T
tautomeric shift
or
突然変異が生じるためには２回の複製を経る。G:T-e は， mismatchとして修復の対象となる。
A T G T-e
normal
normal
正常塩基及び tautomerの塩基対合の性質
Base common state pairs with rare state pairs with
All tautomers cause transition mutations
T keto(=O) A enol (-OH) G
G keto C enol T
A amino(-NH2) imino(-NH)T C
iminoamino G AC
Depurination: 高頻度に生じる自然損傷
Depurination ；塩基とdeoxyribose (S)の間に切断が入り， adenine あるいはguanine がDNAから遊離する。
自然塩基損傷，高温などが原因。
P
S
Pur
Py
S
P
depurination
P
S
Pur
Py
S
P
P
S
Pur
Py
S
P
P
S
Pur
Py
S
P
P
S
Pur
Py
S
P
P
S
Pur
Py
S
P
P
S
Pur
Py
S
P
P
S
Pur
Py
S
P
P
S
Pur
Py
S
P
P
S
Py
S
P
P
S
Py
Pur
S
P
P
S
Py
Pur
S
P P
S
Py
Pur
S
P
P
S
Py
Pur
S
P
P
S
Py
Pur
S
P
P
S
Py
Pur
S
P
P
S
Py
Pur
S
P
P
S
Py
Pur
S
P
Pur
frameshift mutations
3. frameshift mutations
main causes missense repair, alkylating agents, oxidative damageintercalating substances (ethidium bromide, flavones)replication slippage
Frameshift (Replication Slippage)
読みとり枠(reading frame)が変化するような変異のことをframeshift mutationと言う。基本的には複製エラーで生じる。
Frameshift mutation and diseases-1
1) Huntington disease 第 4 染色体にある。常染色体優性変異 第 4 染色体上のhuntingtin遺伝子が作るタンパク質 3145 アミノ酸の Huntingtinの中のグルタミン酸(CAG)繰り返しが、増えて、異常タンパク質が出来、それが脳に蓄積する。
CTGCCGTGCCGGGCGGGAGACCGCCATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAAGGCCTTCGA METAla Thr Leu Glu Lys Leu MET Lys Ala Phe Glu
GTCCCTCAAGTCCTTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA Ser Leu Lys Ser Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCTCCTCA Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln
GCTTCCTCAGCCGCCGCCGCAGGCACAGCCGCTGCTGCCTCAGCCGCAGCCGCCCCCGCC Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gln Pro Gln
Gln -- CAA CAGPro -- CCG CCU CCC CCA
Frameshift mutation and diseases-2
2) Fragile X syndrome (FRAX) 脆弱 X症候群x-染色体上の Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1)遺伝子の CGG 繰り返し配列の伸長（ 200個以上）の結果，遺伝子発現不全となり，「精神障害」などの症状に陥る。
ACGGCGAGCGCGGGCGGCGGCGGTGACGGAGGCGCCGCTGCCAGGGGGCGTGCGGCAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCTGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCACCTCTCGGGGGCGGGCTCCCGGCGCTAGCAGGGCTGAAGAGAAGATGGAGGAGCTGGTGGTGGAAGTGCGGGGCT
3) Poly-CAG repeat による Huntington 以外の神経系の遺伝病 。 dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA), spinobulbar muscular atrophy (SBMA) and spinocerebellar ataxia (SCA) types 1—3, 6, 7 and 17
繰り返し（ repeated sequence）を複製する際に slipすると，繰り返しの増加や減少 (frameshift）が生じる。
Mutation = Damage - Repair
Substitution mutations from one pyrimidine to another or one purine to another (horizontals in diagram) are called transitions. Mutations from a pyrimidine to a purine, or the reverse (verticals and diagonals in diagram), are called transversions. Transitions are more frequent than transversions
When ancestry is uncertain, mutations are designated as mutations relative to an arbitrarily chosen "wild type" genome. They are classified as substitution, insertion or deletion mutations. Insertions or deletions can be small (one or a few nucleotides) or large (more than a few dozen nucleotides).
A G
CT
ATGCCAATCCG
ATGCCGATCCG
ATGCCGAATCCG
ATGCCGATCCG
ATGCCG ATCCG
substitution
deletion insertion
deletion insertion
NNNN---N
transitions
transversions
Structural Mutations
1. deletions = loss of sequence
2. inversions = reversal of orientation
3. translocations = displacement4. duplications = multiplication
主な原因 : 放射線，紫外線，複製エラー，組み換えエラー ,
染色体レベルの突然変異
1.polyploidy = multiple sets of chromosomes
2.aneuploidy = absence or multiple chromosomes
原因；減数分裂時の染色体不分離，チューブリンの機能不全。がんの発生に強く関わる
ゲノム；ある生物がもつ遺伝情報の全体。ゲノムのなかで生命活動を維持するための機能的な部品を規定しているところを遺伝子。遺伝情報の全体は染色体に保持されている。
染色体； DNAと核タンパク質の集合体。全遺伝情報がある。多細胞生物は，父親からのと母親からの染色体をそれぞれ持つ（１対）。ヒトは 23対持つ。 セントロメア
動原体
テロメア
分裂中期の写真なので，染色体が 4 本ある。
ゲノム（ゲノム研究）
Ploidyの変化
2 倍体（ diploi
d ）
4 倍体（倍数体）
異数体（ aneuploidy）
遺伝子あるいは染色体の増幅
転座 欠失
DNA損傷チェックポイントの間違
紡錘体チェックポイントの間違い
中心体複製チェックポイントの間違い チェックポイントの
間違いが，染色体の突然変異（数の変化など）を導く
polyploidyの例
The consequences of mutation on the phenotype
loss of function = hypomorph (“null”) 多くの突然変異gain of function = hypermorph proto-oncogene → oncogene haploinsufficiency (+/-)の場合，酵素量が半分になり，機能が半分になる。dominance and recessivenessヒトなどのように染色体が 2nで，遺伝子の片一方が変異で，片一方が正常の時に，正常形質が現れると劣性変異（ recessive），変異形質が現れると優性（ dominant ）という。
The consequences of mutation on the phenotype
somatic mutations = cell death and cancergerm-line mutations = heritable diseases
it is assumed that every person has between 1-2 lethal alleles (heterozygosity protects from deleterious effects of mutations)
heterozygosity
+/+ -/+
-/-
Point mutation etc.
変異形質が現れる -- その変異は dominant変異形質が現れない --その変異は recessiveHaploinsufficiencyと劣性との区別が時に必要Haploinsufficiencyと dominant negativeとの区別が時に必要
変異細胞
DNA polymeraseが関わる突然変異UV、活性酸素等
GlycosylaseEndonuclease
Y ファミリー DNAポリメレース(dinB, umuCD, RAD30, XPV等 )
Glycosylase, Endonuclease, Exonucease, Helicase(polA, recJ, recQ, hns, topB, RAD27, FEN1等 )
mismatch
mismatch
GlycosylaseEndonuclease
Exo/Hel Exo/Hel
apoptosis p53 cell cycle arrest
組み換えが関わる突然変異； gross rearrangement
HR NHEJ
LOH GCR
damage
突然変異の生成DNA 複製に依存して生成するもの 1) Point Mutations
1. transitions 2. transversions 3. frameshift mutations
2) Structural Mutations（小さいサイズ変化） 1. deletions 4. duplications染色体 (DNA) 組み換えに依存して生成するもの Structural Mutations (LOH， GCR) 1. deletions 2. inversions 3.translocations 4. Duplications細胞分裂に依存して生成するもの 1. Polyploidy 2. Aneuploidy
紫外線 Ultraviolet Light
100 300250200150 400350
UV-C UV-B UV-A
X-Rays Ultraviolet light Visible light
Ozone absorptionAir absorption Transmitted by
normal galass
nm
UV radiation spectrum.UV-A--360 nm以上、 UV-B--280 or 290-360 nm、 UV-C--280 nm 以下
cyclobutane thymine dimer 6-4 photoproduct
thymine
thymine
紫外線（ UV）による DNA損傷
紫外線感受性大腸菌
0 10 20 30 40 50
0.5 1
1
10-1
10-2
10-3
10-4
組み換え修復の欠損した大腸菌 (recA) 及び除去修復欠損大腸菌 (uvrA)は，紫外線に感受性で，両方欠損した二重欠損株 (uvrA recA)はきわめて感受性となる。二重変異株の場合，約 1 個の DNA損傷で，大腸菌は死ぬ。
uvrA recA
recA
uvrA、 uvrB、 uvrC
wild-type
生存率
紫外線線量 (J/m2)
除去修復モデル
UvrAタンパク質はUvrBタンパク質を呼び込み UvrBを傷に結合させる。
Molecular Match Maker
UvrBと UvrCが切れ目を入れる
色素性乾皮症（ Xeroderma Pigmentosum; XP）
XP Patient
色素性乾皮症 (XP)は，光線過敏症の常染色体劣性遺伝性皮膚疾患である。 この疾患の病因は，紫外線によるＤＮＡ損傷の修復機能の障害によるものである。又， XPは 8群（Ａ〜 G 群とバリアント群）に分類され，日本人に多いＡ群は，皮膚疾患に加え，進行性の中枢神経障害や末梢神経障害が出現する。
色素性乾皮症（ XP）患者の皮膚細胞は紫外線に弱い
紫外線 (J/m2)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
色素性乾皮症の皮膚
正常人の皮膚
皮膚細胞を用いてXP患者がなぜ紫外線に感受性なのかを実験することができる。皮膚がん発症の仕組みを実験することが出来る。
Kazuo Yamamoto
XPと発がん
高等生物の除去修復
RNA ポリメラーゼ II
XPE (UV DDB)
損傷の認識
XPC-HHR23B CSA， CSB
XPG
TFIIH(XPB， XPD)損傷周囲の二本鎖
DNAの巻き戻し
XPGXPA
ERCC1-XPF
RPA
損傷両端での一本鎖 DNA切断
PCNARFC DNAポリメラーゼまたは
傷のある oligonucleotideの切り出し
修復合成
DNAリガーゼDNA鎖再結合
傷の認識Transcription coupled repair (TCR)Global genomic repair (GGR)
高等生物の除去修復
紫外線 (UV)によるファージ突然変異と大腸菌recA
1
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
ファージへの UV照射
突然変異頻度
1
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
突然変異頻度
野生株、 uvrA欠損株
UV照射
UV非照射
recA, lexA(Ind) 変異株
UV照射
UV非照射
UV照射宿主
UV非照射宿主
ファージへの UV照射
紫外線誘発突然変異生成には recA, lexA(Ind) 遺伝子が必要
紫外線 (UV)によるファージ突然変異と大腸菌 recA
突然変異が生じる遺伝子（ファージ）にも，その宿主にも紫外線の傷が生じることが必要である。 突然変異生成に新しいタンパク質合成が必要である。
recA遺伝子， lexA遺伝子産物が関与している。 recA遺伝子， lexA遺伝子発現は，紫外線によって誘導される。
紫外線による recA遺伝子の発現と recA & lexA変異
0 5 10 15 20 25 UV(J/m2)
500
1000
1500 野生株
uvrA変異株
recA変異株 lexA変異株
recA遺伝子は紫外線によって誘導される。その発現には activeな recA遺伝子と lexA遺伝子が必要である。紫外線は (DNA損傷は）， recAをはじめ２０以上の遺伝子の発現を誘導する = SOS response
発現量
(U)
紫外線照射しても突然変異が生じない大腸菌突然変異の分離
1) recA変異株2) lexA(ind-) 株3) umuCD変異株 -- 突然変異生成に直接働くタンパク質をコードする遺伝子。
recA遺伝子， lexA遺伝子は調節タンパク質をコードする突然変異生成にはタンパク質合成が必要である。
紫外線によって生じる突然変異
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
0 4020
突然変異頻度
紫外線照射（秒）
uvrA変異株
野生株
recA、 lexA(Ind)、 umuCD欠損株
突然変異生成には少なくとも， 3 つの遺伝子産物が必要である。大腸菌は受け身的に突然変異を生じるのではなくて，積極的に変異を起こすシステムを内在させている。
uvrA欠損株では突然変異がよく起きる。
SOS モデル
Pol IV
Pol V
LexA の結合と分解
umuC umuD
recA
lexA
SOS OFF
SOS ON
大腸菌 SOS regulated genes
polB, dinB, umuCDは損傷乗り越え型 DNAPolymeraseを作る
umuCD 遺伝子
umuD umuC
P (SOS boxを持つ )
umuD遺伝子， 15.000 Daタンパク質を作るumuC遺伝子， 45.000 Daタンパク質を作る
UmuD タンパク質にも LexAや CI タンパク質と同様に ala-gly 配列があり， RecAの作用によって autocleavageを受け，活性型 UmuDとなる。in vitroで UmuCと活性型 UmuDの二量体は， complex を
作る。UmuCD2 タンパク質は， DNA 複製酵素の活性がある (DNA polymerase V)-その作用は，損傷部位で止まることなく無理矢理複製する (translesion polymerase) 。従って間違う可能性が高い。 Error-prone
umuCDタンパク質の作用モデル
活性型の 2 量体の
UmuDは UmuC， ε ，
βと結合し
て， DNA-
PolymeraseVとし
て働く。
DNA Polymerase & UmuCD Polymerase
Pol III
UmuCD2
UmuCD2
SOS-responseで誘導される DNA polymerase
1) PolB (DNA polymerase II)--- translesion
synthesis
2) dinB(polymerase IV) --- translesion
synthesis →フレームシフト変異（ 1〜 2塩基付加または欠失）を引き起こす3) umuCD (Polymarese V) -- translesion
synthesis → 塩基置換変異を引き起こす
β- タンパク質（ β-clamp）と complexを作り，複製する。
Leading鎖に損傷ができて、 replication forkが停止した場合；A forkの崩壊 --死B forkの後退、 chikenfoot構造を取り、修復する。組み換え酵素が関わる。C 複製の再開、 translesion synthesis polymeraseが機能する。
Replication forkでの損傷回避
組み換え 損傷乗りこえ
損傷乗り越え複製大腸菌の場合， polII，PolIV, PolVが関わる。突然変異を伴う。ヒトの場合， Pol ， Pol等が関わる。
PolV-catalyzed TLS and RecAGoodman MF (Molecular Cell, Vol. 17)より
Pol Vによる DNA複製は，紫外線損傷 (X)があっても無くても， RecAタンパク質に依存する。
RecAは， PolVと結合して，DNAへの結合を助ける。
PolV-RecA結合モデル
紫外線損傷の突然変異誘発作用
1) RecAタンパク質を活性型にし， LexA
の分解を促す。→ SOS (polB, dinB, umuCD)誘発
2) RecAタンパク質を活性型にし， UmuD
の分解を促し，活性型 UmuDを作る。
3) 突然変異の鋳型となる
紫外線によって生じる突然変異
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
0 4020
uvrA欠損株では突然変異がよく起きる。
uvrA変異株
野生株
recA、 lexA(Ind)， umuCD欠損株
除去修復がないから
紫外線による突然変異の解析
UV to λ UV to λ then PR GC→AT 5’TC- 10 2 5’CC- 7 3 PuCPy- 1 1 PuCPu- 1 1
AT→GC 5’ TT- 17 14 5’CT- 0 1 PuTPy- 1 3 PuTPu- 0 1 ____________________________ 合計 37 31
大腸菌と λ ファージとを別々に紫外線照射する。
両者を mixし、， λ ファージの突然変異を調べる。
必要なら mixした後光回復をし， λ ファージの突然変異を調べる。
λ ファージ変異体の DNA配列を求め，野生型ファージの配列との違いを求める。
例えば 5’-ATCG-3’が 5’-ATTG-3’になっていたとすると， GC→AT があるとカウントする。
PR = 光回復，ピリミジン二量体を DNAから除く。
紫外線誘発変異の解析結果
1) Pyrimidine-pyrimidine (PyPy) の位置で、 3’ Py が変化している。
2) CT では変異は起きない。3) TC, CC 部位での変異は光回復処理で消えるが， TT部位でのそれは消えない。
以上から得られる結論 １）紫外線損傷が生じると考えられる位置で変異が起きている。損傷そのものが鋳型となっている。
２） CT 損傷は変異の基質にならない。 ３） 3’が変異となる。 ４） TC, CC → は光回復できる。 CPD。 TTはでき
→ ない。 CPDではない。 大腸菌は CPD-photolyaseしか持っていない。
A rule model
in vitroで UV 損傷のある DNA を鋳型に複製させると，3’の向かいには， Aが入りやすい。つまり， T^C, C^Cでは Cの向かいに Aが入るので変異となる。 T^T, C^Tの場合， Aが入ると，本来の pairingなので正常配列になる。
T^TT^C5'
3'
5'3'
5'3'
Pol III
(or UmuCD)
T^C
A
5'3'T^T
A
5'3'AA
TT 3'5'
5'3'AA
TT 3'5'
C to T transition no mutation
Pol III
(or UmuCD)
Pol III
(or UmuCD)
Pol III
(or UmuCD)
TC, CC変異での deamination model
CH 3
O
N
6
5
4
3
2
1
HN
O
N
6
5
4
3
2
1
O
H
NH2
N
O
HN
O
H
N
H
uracil
6
5
4
3
2
1
N
O
H
N
H
NH 2
6
5
4
3
2
1
cytosine
NH 2
HH
CH 3HN
O
N
6
5
4
3
2
1
HN
O
N
6
5
4
3
2
1
O
HO
TC dimer TU dimer
NH2
deamination
deamination
TC, CC 二量体の 3’Cはとりわけdeamination の
→ 頻 度 が 高 いDNA polymeraseV (UmuCD) はdeaminate したC(=U)を Tと間違え て A を いれ ， C→T transition が出来る。
大腸菌での紫外線誘発突然変異のまとめ
紫外線損傷（ピリミジン２量体， 6-4付加体）が突然変異の基質となる。
Translesion synthesis(TLS) polymerase (polII, polIV, polV)が複製停止した polIIIに取って代わる。
紫外線損傷が TLS polymeraseを誘導する。
Leading鎖に UV損傷ができて， replication forkが停止した場合；A forkの崩壊 --死B forkの後退、 chikenfoot構造を取り修復する。組み換え酵素が関わる。C 複製の再開， translesion synthesis polymeraseが機能する。突然変異が増える。
Replication fork stallと TLS
組み換え 損傷乗りこえ
組み換え経路をblockすると，損傷乗り越え経路が活発になり，その結果突然変異が増える。
Cell cycle
MG 0
G 1
S
G 2
RESTINGRESTINGDIVISIONDIVISION
GROWTH GROWTH FACTORSFACTORSGROWTH GROWTH FACTORSFACTORS
損傷チェックポイント G1/S
損傷チェックポイント G1/S
INTERPHASEINTERPHASE
損傷チェックポイント G2/M
損傷チェックポイント G2/M
2c4c
2c 2c
紡錘体チェックポイント
中心体複製チェックポイント
ヒト培養細胞の場合，全体は概ね 24時間で M 期は 0.5時間程度
Swe1 (Wee1)， Cdc25による G2/M境界checkpoint
Cdc25
Swe1
G2/M 境界
CDK1(Cdc28) /
Cyclin B
P P PCDK1(Cdc28) /
Cyclin B
P
G2期prophase
G2/M境界では， Swe1は MPFをリン酸化することで，周期の進行を遅らせ， Cdc25 phosphataseは脱リン酸化することで，周期を前に進める。PHQは Swe1 (Wee1)を安定化するので， MPFを不活性型に保ちelongated bud形成を促す。
P
G2/M境界 checkpointシグナルと異数性の生成
Cdc25 Wee1
inactive = G2 active = M
p38P
p38
環境ストレス(ROS等 )
Chk1Chk1
ATM/ATRDNA damage
G2/M 境界 arrest
Aneuploidy--> 発がん / 老化
???
chk2
p53
P21
S arrest
14-3-3
CDK1(Cdc28) /
Cyclin B
P P PCDK1(Cdc28) /
Cyclin B
P
Diploid (2n)と haploid (n)
ヒトの場合，精子や卵子は haploidで 22本の常染色体の１つずつと X または Y をもつ
たいていのヒト細胞は diploid (2n)で， 2 本の相同な（但し同一ではない！）染色体をもつ。
ヒトの G2期細胞は tetraploid (4n)となっている。相同染色体がそれぞれ，同一の染色体2 本 (sister-chromatid)で構成される。
塩基置換などによる突然変異は複製（コピー）エラーの結果である
DNA複製誤りが原因である。複製誤りを修復するシステム（ mismatch repair）を生物は持っている。
mismatch repairが欠損すると，ヒトは大腸がんになる（ hereditary nonpolyposis colon cancer; HNPCC) -- 細胞の突然変異頻度が高いから。
大腸菌自然突然変異
大腸菌 DNApolymeraseによる複製誤り頻度は 200 x 10-8/cell/genenration。
複製後ミスマッチ修復系が働いて，変異頻度は 2 x 10-8となる。
高等生物（ヒト，植物，酵母など）での自然突然変異頻度も，同様のしくみが働いて，変異頻度は 2 x 10-8〜 10-6となる。
塩基が変化するような突然変異はおおよそ 10-
8の頻度で生じる。
発がんがんは， oncogeneが power-upあるいはがん抑制遺伝子が power-down
正常細胞 がん細胞
正常マウス がん細胞が一つあるマウス がんマウス
細胞のがん化； １つのがん細胞が出来る過程マウス / ヒトのがん化；がん細胞が一つある状態から，たくさん ある状態になるまでの過程。十数年以上かかる
全ての過程には，少なくとも 6〜 10個の遺伝子が関わる
がん（ cancer）1) 一つの疾患ではなくて，似たような細胞特性をもつ，多くの疾病の総称。2) すべてのがん細胞は， 6〜 10個の遺伝子突然変異の結果，成長の制御が不能に陥ったものである。がんは体細胞の病気である。3) がんの約 1 パーセントは家族性（ familial）で，この場合，家系内でがんにかかりやすい遺伝子変異がある。残りの 99パーセントは散発性（ sporadic）で，この文脈では家族性ではない事を意味し，体細胞の突然変異の結果である。4) 正常細胞からがん細胞への転換には，複数のプロトオンコジーンとがん抑制遺伝子突然変異 (6-10個 )を必要とする。
protooncogeneとがん抑制遺伝子
がんとの関わり；1) protooncogeneの機能は，細胞分裂を促進するか， apoptosisを阻止すること。 Oncogeneは protooncogeneの power up型Ras--星状細胞腫（ astrocytoma）の 45パーセント，神経膠芽腫（ glioblastoma;）の 35-50パーセントサイクリン D--食道がんの 35パーセント，膀胱がんの 15パーセント，乳がんの 15パーセント
2) がん抑制遺伝子 (tumor suppressor gene) の機能は，細胞分裂を阻害するか，アポトーシスを促進すること。P53--すべてのがんの半数以上で， p53が機能を失っていることが示されているp16/p19ARF--神経膠腫（脳腫瘍の一種）の 55パーセント，中皮腫 （ mesothelioma）の 55パーセント，黒色腫の 50パーセント以上で，機能喪失が観察される。
遺伝子が特定された病気（一部）
染色体 代表的がん遺伝子名 その他病気遺伝子数
１染色体 ●がん遺伝子 Nras(p13.2) ●がん遺伝子 trkA(q23-q24) 78 ●乳がん (p36) 2 染色体 ●遺伝性非ポリポーシス大腸がん (p22-p21と q31-q33) 45 ●がん遺伝子 Nmyc(p24.1)5 染色体 ●大腸がん (q21) ●大腸ガン抑制遺伝子 MCC 32 ●家族性大腸ポリポージス抑制遺伝子 APC(q21-q22) 第 7 染色体 ●大腸がん (p22) ●がん遺伝子 met(q31) 44 第 13染色体 ●網膜芽細胞腫抑制遺伝子 RB ●家族性乳がん (q12.3) 18第 15染色体 ●がん遺伝子 fea(q26.1) 23第 17染色体 ●乳がん (p13.3)p53に関連 ●がん遺伝子 erbB2(q11) 52 ●神経線維腫症 1 型（レックリングハウゼン病） ●がん遺伝子 erbA(q11.2) ●がん抑制遺伝子 p53(p13.1) ●家族性乳がん (q21) ●乳がん抑制遺伝子プロヒビチン第 18染色体 ●がん遺伝子 yes(p11.3) ●遺伝性非ポリポーシス大腸がん (q1) 17 ●膵臓がん・大腸がん (q21.1)がん抑制遺伝子●がん抑制遺伝子 DCC
1 回の aneuploidyで複数の遺伝子変化を起こすことが出来る。
発がんと突然変異
がん突然変異説を信じるとして，例えば 6 個の遺伝子変異でがんになるとする。それぞれの遺伝子突然変異頻度を10-5として， 6 個の遺伝子変異で説明すると，がんに至るまでの頻度は (10-5)6 = 10-30 /cell/generationとなる。ヒト個体は， 1012-1013 の細胞で構成されている。生涯の細胞数を 1014と仮定 (100歳まで生きるとすると，合計は36500日；分裂する stem cellが仮に 0.1%あり，１日１回分裂するとすれば， 1013 x 0.1% x 36500 = 36500 x 1010 = 3.65 x 1014； stem cellの分裂は1:1)しても，突然変異だけで説明すると，ヒトはがんに罹る可能性はきわめて低い。
がん細胞の oncogene， TSGに変異がある突然変異頻度の高い遺伝病（ミスマッチ欠損，色素性乾皮膚症など）は，発がん頻度が高い発がん化学物質は突然変異誘発作用がある
環境化学物質の突然変異原性（遺伝毒性），発がん性の試験
1) エームス (Ames)試験 --サルモネラ菌を用いて， DNA損傷に依存した DNA複製依存性突然変異原性の有無を調べる。2) マウス実験 --化学物質を数百匹のマウスに投与し， 2年間飼育して，発がん性を調べる。
変異物質 発がん物質非変異・発がん物質；例，アスベスト，ベンゼン， o-phenylphenol
変異・非発がん物質；例，ヒドロキシルアミン，9-アミノアクリジン
変異・発がん物質 (50-60%) ；例，過酸化水素，ニトロソグアニジン，放射線
変異・非発がん物質が存在非変異・発がん物質が存在
放射線誘発突然変異と細胞悪性形態変化の頻度は違う
10-5
X 線を照射したゴールデンハムスター細胞を二群に分け，一方で細胞悪性形態変化 (malignant morphological change)を指標にして細胞がん化頻度を求め，他方で HGPRT遺伝子座における体細胞突然変異頻度を調べた（京都大学，渡邉正己）
細胞がん化と突然変異誘導動態が全く異なる
生存曲線●
細胞悪性形態△
突然変異□
突然変異による発がんと aneuploidyによる発がん
突然変異だけで説明すると，ヒトはがんに罹る可能性はきわめて低い（前の頁の説明）。
遺伝子の変異が生じると，その表現型はすぐに現れる。がんは 10年以上の時間をかけてゆっくり発病する。
世の中には非変異・発がん物質や変異・非発がん物質が存在する。突然変異だけでは発がんを説明できないことの証拠。
非変異・発がん物質は， M 期 arrest，中心体の断片化，異数化等を誘発する。変異・発がん物質も中心体の断片化や aneuploidyを誘発する。ほとんど全てのがん細胞で aneuploidyは観察される。
異数性だけではがんにはならない（ Bub変異の両親；広島大，松浦）。
突然変異と aneuploidyは共に発がん multistepにかかわる。
がん突然変異説に対する疑問Science, vol297, 2002正常細胞
大腸直腸がん
がん細胞の染色体数は正常細胞のとは異なる。 Aneuploidy(異数性）
Aneuploidy(異数性）Polyploidy(倍数性）
Aneuploidy (異数性）とがん
ひと大腸直腸がん細胞Jallepalli & Lengauer (2001)
同じ CAN1遺伝子の変異でも diploidと haploidで突然変異頻度が異なる
カナバニン抵抗性突然変異 (CanR)
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
0 50 100 紫外線 (J/m2)
haploid
diploid (CAN1/Δcan1)
CanR frequency
酵母の CAN1遺伝子の突然変異を調べると， diploid heterozygousの時は， haploidに比べて頻度が 100倍高い。組み換えなどによる loss of heterozygosity (LOH)の頻度が高いからである。
複製誤りによる変異
組み換えによる変異≒ LOH
Kazuo Yamamoto
酵母 aneuploidy実験系と CanRの生成
can1⊿
ADE2
LYS2
CanR ADE+ LYS+
CanR ADE+ lys-
CanR ade- lys-
組み換え遺伝子変換
異数性
ADEと LYSのマーカーによって， CanRを分類をする。MMS， H2O2 処理で，頻度は約 10倍上昇する。
0 20 40 60 80 %
遺伝子変換組み換え
aneuploidy0 20 40 60 80 %
遺伝子変換
組み換え
0 20 40 60 80 %
遺伝子変換組み換え
aneuploidy
未処理
MMS (1 mM)
H2O2 (1 mM)
ADE2 ADE2
LYS2
aneuploidy
DNA損傷物質は組み換えと aneuploidyを誘発する
非変異・発がん物質による aneuploidy
can1⊿
ADE2
LYS2
CanR ADE+ LYS+
CanR ADE+ lys-
CanR ade- lys-
組み換え遺伝子変換
aneuploidy
0 20 40 60 80 %
遺伝子変換組み換え
aneuploidy
遺伝子変換組み換え
aneuploidy
未処理
ADE2 ADE2
LYS2
遺伝子変換組み換え
aneuploidy
無処理 -- 1 x 10-4
Acrylamide (AA 100 mM) 1x 10-3
Acrylonitrile (AN 75μM ） 9 x 10-4
Carbendazim (CD 0.2 mM) 6 x 10-4
AA 100 mM
AN 75μM
CD 0.2 mM
組み換え
遺伝子変換
aneuploidy
0.00 0.25 0.50OPP (mM)
CanR-
frequency
Surviving fraction
化学物質による aneuploidy 生成機構； o-phenyl phenol ， PHQの作用機構
輸入柑橘類の防カビ剤として使用されるポストハーベスト剤。突然変異は誘発しない。 DNAに作用しない。マウスに膀胱がんを誘発する。
OH OH
OH OH
O•
O
O
Fe3+ Fe2+
O2 O2-
NAD• NADHOPP
phenylhydroquinone (PHQ) Phenylbenzoquinone (PBQ)
100
10-1
10-2
10-3
10-4 10-5
10-4
10-3
10-2Frequency
0 (mM)0.10.250.5
組み換え遺伝子変換
aneuploidy塩基置換
PHQの aneuploidy誘導性
2.001.000.00
Can-R frequency
DHBP (mM)
Surviving fraction
100
10-1
10-2
10-3
10-4
0 1 1.5DHBP (mM)
Distribution (%)
100
80
60
40
20
0
遺伝子変換
組み換え
aneuploidy
致死作用
CanR 変異頻度
1)致死作用に閾値がある。2) CanR 変異 (LOH)が濃度依存的に誘導される3) aneuploidyの誘導4) 塩基置換型突然変異の誘発はない5) マウスに膀胱がんを誘発する
ヒト培養細胞でも PHQは Aneuploidyを引き起こす70
60
50
40
30
20
10
0
Proportion of chromosome
numbers (％
)
Aneuploidy (%): 43 73 67 56 57 57
1day 2day 3day 4day 5day
day after addition of PHQ
≦40414243 ≧47
464544
Chromosome numbers
PHQ16hr処理
↓
Wash
↓
通常の培地で
数日培養
↓
染色体観察
HCT116 : 染色体数 主に 45本
No treated
DNA損傷を作らない PHQでも Aneuploidyを誘発 --> 非標的仮説
180
150
12090
60
30
0
YPD 2 mM PHQ 15 g/ml Noc
PHQは，酵母の細胞周期を G2-M期で停止する
.
.
YPD100
80
60
40
20
00 50 100 150 200
0 50 100 150 200
100
80
60
40
20
0
2 mM PHQ
% cells
% cells
Minutes after release from G1
A
B
Minutes after release from G1
G1-S
G2-metaAna
G2-metaG1-S
Ana
PHQ 処理すると酵母の形態異常 (elongated bud)が観察される
YPD 0.1% MMS 15 g/ml Nocodazole 2 mM PHQ
拡大図
Budの形態形成が不十分な状態で周期の進行が止まっている。Mophogenesis checkpoint -- G2/M境界で delay。 正しい状態を確認して MPFを活性化して M 期に進む。酵母 swe1(wee1 homolog)欠損株では elongated bud形成は無い。 Swe1欠損株では G2/M境界 delayも無い。MPF = mitosis promoting factor = CycB + Cdk1 (Cdc28)
Swe1 (Wee1)， Cdc25による G2/M境界checkpoint
Cdc25
Swe1
G2/M 境界
CDK1(Cdc28) /
Cyclin B
P P PCDK1(Cdc28) /
Cyclin B
P
G2期prophase
G2/M境界では， Swe1は MPFをリン酸化することで，周期の進行を遅らせ， Cdc25 phosphataseは脱リン酸化することで，周期を前に進める。PHQは Swe1 (Wee1)を安定化するので， MPFを不活性型に保ちelongated bud形成を促す。
PHQは Swe1を安定化する
Time (min)
2 mM PHQ
YPD
0 30 45 60 75 90 105
0 30 45 60 75 90 105
Swe1
Swe1
Loadingcontrol
Loadingcontrol
α factorで G1に同調し， release後 65分に PHQを加える。10%SDS-PAGEで流して western blottingPHQは Swe1のリン酸化を抑制して安定化する
100
80
60
40
20
0
0 50 100 150 200
100
80
60
40
20
0
% cells
% cells
Minutes after release from G1
180
150
120
90
60
30
0
YPD 2 mM PHQ 15 g/ml Noc
Minutes after release from G1
0 50 100 150 200
G1-S
G2-metaAna
G1-S
G2-meta
Ana
Swe1欠損株 YPD
Swe1欠損株 2 mM PHQ
Swe1変異株では PHQ処理しても細胞周期は正常に進む
Swe1株の FACS
Swe1欠損株では PHQ処理は周期を止めないMad2変異株では PHQは周期を止めるPHQは G2/M境界で周期を止める
P
DNA damage checkpointと G2/M transition checkpoint
Cdc25 Wee1
p38P
p38
環境ストレス(ROS等 )
Chk1Chk1
ATM/ATRDNA damage
G2/M 境界 arrest
chk2
p53
P21
S arrest
14-3-3
CDK1(Cdc28) /
Cyclin B
P P PCDK1(Cdc28) /
Cyclin B
P
X
Swe1(Wee1)は Hog1(p38MAPK)および Chk1の下流
PHQは Hog1(p38)をリン酸化する
0 30 60 30 60 30 60 30 60 30 60 min
NaCl PHQ DMSO MMS Nocodazole
p-Hog1p
Hog1
PHQは Hog1をリン酸化し，その下流の Swe1を安定化する。PHQは Cdc25をリン酸化（不安定化）する (HCT116での結果）。従って， PHQは G2/M transitionで細胞周期を止める。
PHQ作用のまとめ
（１） PHQは MAPK経路を活性化 (Hog1-Swe1経路 )することにより， 細胞周期を G2/M境界で止める
（２） Hog1-Swe1経路は PHQが誘発する異数性（ Aneuploidy）の中心経路である
（３） PHQは ATM/ATRを活性化しないので， chk1由来の G2/M境界 arrestは起きない。 Chk1変異株は野生株と同じように PHQに反応する。
PHQはヒト培養細胞にアポトーシスを誘導する
Cont Noc 100 125
PHQ (μM)
116kDa
85kDaPARP
Actin
Nocodazole 150 nM。 PHQ 100 M 。
PHQ
Noc
核 (DAPI)細胞
No treated
Kazuo Yamamoto
薬剤で 48時間処理後， DNAの断片化と， apoptosis特異的PolyADP ribose polymerase (PARP)の分解を見た。
PHQは中心体の増幅もしくは断片化を誘導
-tubulin 核 mergeInterphase
Mitosis
-PHQ
PHQ処理（ 16hr）
-PHQ
PHQ処理（ 16hr ）
11.4％
1.9 ％
4.9 ％
2.4％
≧３の割合
非変異・発がん物質 OPP1) エームス試験陰性。大腸菌，ヒトやマウスの培養細胞などでも突然変異は誘導しない。 Haploid酵母でも突然変異誘発はない。 DNA損傷は作らない。
2) マウスに膀胱がんを作る（ aneuploidy を伴う）。
3) 染色体喪失型 LOH（ monosomy =aneuploidy ）の誘発と発がん。
- 仮の説明 -●もし一方の染色体上のがん抑制遺伝子に前もって突然変異があるとき， OPP処理で正常遺伝子を持つ染色体が喪失すると (-/0)となりがんになる。
●一方の染色体が喪失すると，がん抑制遺伝子が(+/+)から (+/0)と半分になる。ゆくりとがんになる。
Aneuploidy(CIN)を考えると何がいえるか
塩基置換変異 (MIN)の 10倍の頻度で生じる 非常にまれというわけではない染色体 22本対を考えると， 1 対の染色体には複数のがん関連遺伝子が乗っている。 1 回の eventで複数の遺伝子の変化を説明できるがん抑制遺伝子で発現量の低下による発がんがあるProtooncogeneで発現量の増加による発がんがある。
Aneuploidy (CIN)とがん
a) がん抑制遺伝子の場合
b) proto-oncogeneの場合
+
+
正常 protooncogeneが３個になる→増殖傾向
1) Heterozygous (-/+)から (-/0)となる2) Homozygous(+/+)から (+/0)となる
Balb/c p53+/+(n=5)
Balb/c p53-/+ (n=56)
Balb/c p53-/-(n=85)
Probability of tumor-free
Weeks
矢印 は 50%のマウスにガンができる週。
P53(+/-) マウスの発がん機構(Kuperwasser C et al., Am J Pathol. 157:2151-2159, 2000.)
1) LOHの結果 (-/0)となる (+) alleleの loss-- 乳ガン 2) (-/+)のまま p53量が 1/2 -- lymphoma haploinsufficiency
がんは突然変異？ Aneuploidy?
ヒトがん細胞には aneuploidyがあるか突然変異があるか？ --両方ある
Non-mutagenic carcinogenはすべてaneuploidyを導くか？ -- 一部 YES, 一部 NO
染色体の増減で， protooncogene，がん抑制遺伝子の発がんの機構をすべて説明できるか？ -- 出来るのもあるし，出来ないのもある