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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Tese
Sistema de gestão da qualidade para Centros de
Coleta e Processamento de Sêmen bovino:
elaboração, implantação e impacto
Karina Lemos Goularte
Pelotas, 2014.
1
KARINA LEMOS GOULARTE
Sistema de gestão da qualidade para Centros de Coleta e Processamento de
Sêmen bovino: elaboração, implantação e impacto
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do conhecimento: sanidade animal).
Orientador: Thomaz Lucia Junior Co-orientador (es): Arnaldo Diniz Vieira
Eduarda Hallal Duval Rafael Gianella Mondadori
Pelotas, 2014.
1
Dados de catalogação na fonte:
( Gabriela Machado Lopes – CRB-10/1842 )
G694s Goularte, Karina Lemos
Sistema de gestão da qualidade para centros de coleta e
processamento de sêmen bovino: elaboração, implantação e impacto /
Karina Lemos Goularte ; orientador Thomaz Lucia Junior - Pelotas, 2014.
88 f. : il.
Tese (Doutorado) Programa de Pós- Graduação em Veterinária.
Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2014.
1. Appcc 2. Sêmen bovino 3. Qualidade 4. Marcador 5. Fertilidade I.
Lucia Junior, Thomaz (orientador) II.Título.
CDD 636.21
2
Banca Examinadora: Professor Doutor Thomaz Lucia Junior (orientador), Doutor em Medicina Veterinária pela Universidade de Minnesota, EUA. Professor Doutor Elci Lotar Dickel, Doutor em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Professor Doutor Bernardo Garziera Gasperin, Doutor em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Santa Maria. Doutor José Carlos Ferrugem Moraes, Doutor em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
3
Agradecimentos
Ao programa de Pós-Graduação em Veterinária da UFPel pela oportunidade
de realização do doutorado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão da bolsa de estudos e a oportunidade de realização do doutorado
sanduíche, que agregou muito na minha formação profissional e pessoal.
Ao professor orientador Thomaz Lucia Junior por acreditar na minha
capacidade profissional, pelo apoio e os ensinamentos passados durante o
doutorado.
Ao meu companheiro Murilo pelo incondicional apoio ao meu crescimento
profissional e pessoal.
À minha colega e amiga Eduarda Hallal Duval pela ajuda, pelos
ensinamentos obtidos durante a elaboração e execução do meu trabalho e, a
amizade nascida durante a execução desse trabalho.
Ao professor Rafael Gianella Mondadori pela inegável ajuda e incentivo
quanto ao meu crescimento.
Aos professores integrantes do grupo ReproPEL Carine Dahl Corcini,
Arnaldo Diniz Vieira, Ivan Bianchi e Antônio Sérgio Varela Junior pelo apoio e ajuda
nos momentos necessários.
Aos colegas do ReproPEL Fabiana Moreira, Elisângela Mirapalheta Madeira,
Elisa Caroline dos Santos, Carlos Eduardo Ranquetat Ferreira e Jorgea Pradie pela
ajuda, apoio, companheirismo, amizade e momentos únicos vividos nesses 4 anos
de convivência.
Aos alunos da graduação, estagiários do laboratório ReproPEL, pela ajuda e
oportunidade de convivência nesse período.
Aos meus pais, Julieta e Ubirajara, pelo exemplo que me foi dado, apoio e
incentivo na minha caminhada.
As minhas irmãs, Cristina e Fabiana, e “irmãos”, Celso e Leonardo, pelo
incentivo e apoio que me foi fornecido.
4
Aos funcionários da multinacional ABS Pecplan por acreditarem no meu
trabalho e apoiarem na execução do mesmo.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse
trabalho e, consequentemente, para a minha formação...
MUITO OBRIGADA!
5
Resumo
Goularte, Karina Lemos. Sistema de gestão da qualidade para Centros de Coleta e Processamento de Sêmen bovino: elaboração, implantação e impacto. 2014. 88f. Tese (Doutorado em Sanidade Animal) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2014. Apesar de o Brasil ter comercializado mais de 12 milhões de doses de sêmen bovino no ano de 2012, ainda não existe um padrão de processamento das doses comercializadas pelos estabelecimentos cadastrados pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. A hipótese do presente trabalho é de que a elaboração e a implantação de um sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) para um centro de coleta e processamento de sêmen bovino seja capaz de identificar as etapas potencialmente danosas para a viabilidade das doses, diminuir a sua rejeição e melhorar a sua qualidade final, a partir da adoção de medidas preventivas e de controle do processo. A implantação do sistema APPCC identificou as etapas que apresentavam perigos para a qualidade das doses de sêmen produzidas, ocorrendo redução na contaminação durante o seu processamento (P<0,05), Também houve um incremento na motilidade progressiva e na integridade das membranas plasmática e acrossomal dos espermatozóides (P<0,05) após a implantação do sistema APPCC, bem como uma redução na rejeição de partidas e doses de sêmen (P<0,05), o que se refletiu em uma diminuição dos custos de produção. Assim, a utilização do sistema APPCC resultou na padronização do processo de produção de sêmen bovino congelado, com incremento da qualidade seminal, redução na rejeição de doses e nos custos para a indústria. Adicionalmente, durante o programa de doutorado sanduíche na Universidade de Calgary (Canadá),foi avaliado o envolvimento da enzima conversora da angiotensina no processo de capacitação espermática e fertilização in vitro em bovinos. Após o bloqueio da atividade da enzima com o inibidor específico captopril,observou-se níveis semelhantes de fosforilação da proteína tirosina e de clivagem e desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto, em comparação com o controle (P>0,05). Portanto, o presente estudo sugere que a enzima conversora da angiotensina não é necessária para o processo de capacitação espermática nem está envolvida na fertilização in vitro, em bovinos. Palavras-chave: APPCC; sêmen bovino; qualidade; marcador; fertilidade.
6
Abstract
Goularte, Karina Lemos. Quality management system for bull artificial insemination centers: design, execution and impact. 2014. 88f. Tese. (Doutorado em Sanidade Animal) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2014. Although more than 12 million doses of bull frozen semen were sold in Brazil in 2012, the production process of the doses sold by the artificial insemination centers registered in the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply is not yet standardized. The hypothesis of the present study is that the design and implementation of a hazard analysis and critical control points (HACCP) system in a bull artificial insemination center can identify steps potentially harmful to the viability of semen doses, to decrease their rejection and to improvement their final quality, after the adoption of preventive and process control measures. The implementation of the HACCP system identified hazardous steps for the quality of the produced semen doses, leading to a reduction in their contamination during processing (P<0.05). There was also an increase in progressive motility and plasma membrane and acrosome integrity of spermatozoa (P<0.05) after implementing the HACCP system, which resulted in reduced rejection of semen batches and doses (P<0.05) and decreased production costs. Thus, the execution of the HACCP system standardized the production process of bull frozen semen, with improved sperm quality and reduction in both rejection of doses and costs to the industry. Additionally, during the sandwich doctorate program at the University of Calgary (Canada), the involvement of angiotensin converting enzyme in the capacitation process and in vitro fertilization in cattle was evaluated. After blocking the enzyme’s activity by the specific inhibitor captopril, there were similar levels of tyrosine phosphorylation and cleavage and embryonic development until the blastocyst stage in comparison with the control group (P>0.05). Therefore, the present study suggests that the angiotensin converting enzyme is neither required for sperm capacitation nor involved in in vitro fertilization in cattle. Keywords: HACCP; bovine semen; quality; marker; fertility.
7
Lista de Figuras
Artigo 1 APPCC: um modelo para Centros de Coleta e
Processamento de Sêmen Animal
Figura 1 Modelo de um fluxograma para centro de coleta e
processamento de sêmen animal.....................................
33
Quadro 1 Determinação do PCC...................................................... 34
Quadro 2 Monitoramento do(s) PCC(s)............................................ 35
Quadro 3 Resumo do plano APPCC................................................ 36
Artigo 3 Bovine angiotensin-converting enzyme testis
specific is neither required for sperm capacitation
nor released during this phenomenon
Figure 1 Tyrosine phosphorylation before (1) and after incubation
for 4.5 h in Sp-TALP (2), 100 µM of ouabain (3) or 100
µM of ouabain + 10 µM of captopril (4). PL = protein
marker ladder – kDa…………………………………………
79
Figure 2 Germinal ACE content before (1) and after incubation for
4.5 h in Sp-TALP (2), 100 µM of ouabain (3) or 100 µM
of ouabain + 10 µM of captopril (4). PL = protein marker
ladder – kDa………………………………………………….
80
8
Lista de Tabelas
Artigo 2 Impacto da implantação do sistema APPCC em um
centro de coleta e processamento de sêmen bovino
Tabela 1 Contagens microbianas médias (UFC/mL) nos
diferentes pontos de coleta em um CCPS bovino, antes
e após a implantação do sistema APPCC........................
54
Tabela 2 Parâmetros de qualidade do sêmen bovino após o
descongelamento, antes e após a implantação do
sistema APPCC................................................................
55
Tabela 3 Produção do Centro de Coleta e Processamento de
Sêmen bovino, durante o período de 4 meses antes e 4
meses após a implantação do sistema APPCC...............
56
Artigo 3 Bovine angiotensin-converting enzyme testis
specific is neither required for sperm capacitation
nor released during this phenomenon
Table 1 Total, progressive and linear motility of bull spermatozoa
after incubation for 4.5 h (n = 150 sperm samples)……...
77
Table 2 Rates of cleavage and embryo development to the
blastocyst stage after in vitro fertilization using bull
sperm with or without (Control) captopril prior to
exposition to cumulus-oocyte complex……………………
78
9
Lista de Abreviaturas
APPCC Análise de perigos e pontos críticos de controle
ACE Angiotensin converting enzyme
BPF Boas práticas de fabricação
BPP Boas práticas de processamento
COC Complexo cumulus oocyte
ECA Enzima conversora da angiotensina
ACE Angiotensin Converting Enzyme
GPI Glycosylphosphatidylinositol
ML mililitro
OMC Organização mundial do comércio
PC Ponto de controle
PCC Ponto crítico de controle
POP Procedimento operacional padrão
PPHO Procedimento padrão de higiene operacional
UFC Unidade formadora de colônia
µL Microlitro
µM Micromolar
10
Sumário
1. Introdução.................................................................................................. 12
2. Objetivos.................................................................................................... 16
3. Artigos........................................................................................................ 17
3.1 Artigo 1 - APPCC: um modelo para Centros de Coleta e Processamento
de Sêmen Animal.......................................................................................
18
Resumo...................................................................................................... 18
Introdução.................................................................................................. 18
Elaboração do APPCC.............................................................................. 20
Histórico de revisão do plano..................................................................... 28
Referências................................................................................................ 30
3.2 Artigo 2 - Impacto da implantação do sistema APPCC em um centro de
coleta e processamento de sêmen bovino.................................................
37
Resumo...................................................................................................... 38
Introdução.................................................................................................. 39
Metodologia............................................................................................... 40
Resultados................................................................................................. 43
Discussão................................................................................................... 44
Conclusão.................................................................................................. 49
Referências................................................................................................ 50
11
3.3 Artigo 3 - Bovine angiotensin-converting enzyme testis specific is neither
required for sperm capacitation nor released during this
phenomenon…………………………………………………………………….
57
Summary………………………………………………………………………... 58
Introduction……………………………………………………………………... 59
Results………………………………………………………………………….. 61
Discussion………………………………………………………………………. 62
Materials and Methods………………………………………………………… 66
References……………………………………………………………………… 71
4. Conclusão geral………………………………………………………………... 81
5. Referências…………………………………………………………………….. 82
6. Anexo…...………………………………………………………………………. 85
7. Apêndice………………………………………………………………………... 87
12
1 INTRODUÇÃO
Em 2012, foram comercializadas mais de 12 milhões de doses de sêmen
bovino no Brasil, o que representa um crescimento de 74.4% na atividade, em
comparação com o ano de 2002 (ASBIA, 2012; 2002). Segundo o Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), a bovinocultura é um dos principais
destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial, sendo o Brasil detentor do
segundo maior rebanho do mundo, com cerca de 200 milhões de cabeças.
Apesar do crescimento na comercialização de doses de sêmen no Brasil,
apenas 10% das fêmeas em idade reprodutiva são inseminadas (ASBIA, 2012). Em
alguns casos, o uso da inseminação artificial depende da importação de sêmen
(BARBOSA& MACHADO, 2008), que responde por 46,7% do total das doses de
sêmen comercializadas em 2012 (ASBIA, 2012). Apesar de os centros de coleta e
processamento de sêmen (CCPS) bovino serem responsáveis pelo processamento
de 53,3% das doses de sêmen comercializadas no Brasil, estes indicadores
mostram que o mercado a ser explorado ainda é bastante amplo,
Em função de serem fiscalizados pelo MAPA, os CCPS devem cumprir uma
série de exigências quanto à estrutura física, documentação, sanidade do rebanho,
entre outros aspectos. Apesar destas exigências, não existe ainda um padrão de
processamento das doses comercializadas. Por outro lado, em 2012, o Brasil
exportou 226.020 doses de sêmen bovino congelado, em especial para Canadá,
Paraguai e Colômbia (ASBIA, 2012). Segundo o MAPA, a partir de 04 de dezembro
de 2013 o Brasil pode exportar sêmen e embriões bovinos para a Costa Rica,
evidenciando o crescente mercado existente. Porém, para a introdução de seus
produtos e a sua manutenção em um mercado cada vez mais competitivo, torna-se
necessário a padronização de seu processamento e dos serviços oferecidos, com
incremento da qualidade.
13
O sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC),
utilizado inicialmente na indústria de alimentos, vem ao encontro dessa necessidade.
Além de padronizar a qualidade da produção, o sistema APPCC permite identificar
avaliar e controlar os perigos significativos para a qualidade e a segurança do
produto (FAO & WHO, 2009). Além disso, sua implantação satisfaz à legislação
nacional e internacional, dando segurança e favorecendo a exportação (RIBEIRO-
FURTINI & ABREU, 2006).
O processo de criopreservação resulta em redução da viabilidade
espermática, quando comparado com o sêmen fresco, caracterizada principalmente
pelo declínio da motilidade (WATSON, 2000). Um crescimento excessivo de
bactérias, provenientes da microflora do prepúcio ou da genitália externa do touro
(THIBIER & GUERIN, 2000) ou introduzidas durante a coleta ou o processamento do
sêmen, no ambiente da sala de coleta ou no laboratório (KAPROTH & KRICK,
2004), pode resultar em aglutinação espermática e diminuição da motilidade
(ALTHOUSE, 2008; MORETTI et al., 2009). Portanto, mesmo que os CCPS realizem
exames sanitários regularmente para o controle de doenças transmitidas através do
sêmen, para evitar uma queda na viabilidade e qualidade das doses produzidas,
deve-se avaliar todo o processo de produção de doses de sêmen congeladas,
identificando-se as etapas potencialmente perigosas no que diz respeito à
contaminação microbiológica das amostras, implementando medidas preventivas
e/ou ações corretivas.
O sistema APPCC descreve detalhadamente as atividades realizadas e
representa uma cópia fiel do sistema de produção, com a descrição de seu
fluxograma, a identificação de seus perigos com os pontos de controle e/ou pontos
críticos de controle, com registro de suas operações, com as revisões e correções
necessárias para garantir a segurança e qualidade do produto final. Assim, a
elaboração de um sistema APPCC para CCPS foi proposto no projeto “Centro de
rastreabilidade sanitária e genética de sêmen”, aprovado no Edital
MCT/CNPq/MAPA/SDA nº 64 em 2008, buscando a implantação de um centro
colaborador em Defesa Agropecuária, vinculado ao MAPA, junto ao laboratório de
reprodução animal da Faculdade de Veterinária da UFPel (ReproPel). O sistema
visou auxiliar o MAPA no que diz respeito a fiscalização dos CCPS, descrevendo
todo o sistema de produção apontando etapas chave para a qualidade do produto
14
final. Assim, além de padronizar os processos de produção em cada CCPS, o
sistema ajudará o MAPA no momento da realização de auditorias.
Somando-se a garantia de alguns parâmetros seminais e microbiológicos
provida pela implantação do APPCC, para a indústria da inseminação artificial,
touros testados com alta capacidade fertilizante são essenciais para garantir a
eficiência reprodutiva (FOOTE & PARKS, 1993; MOURA, 2005), apesar de existirem
diferenças entre machos ou amostras e estas não poderem ser explicadas pelas
avaliações convencionais da viabilidade espermática ou morfologia (SAACKE et al.,
2000). Dessa maneira, a expectativa de dispor de marcadores que indiquem o
potencial reprodutivo de cada indivíduo tem sido o foco de inúmeras pesquisas, que
provavelmente poderão contribuir significativamente na escolha de reprodutores
superiores (JOBIM et al., 2009). A enzima conversora da angiotensina (ECA) é uma
ectoenzima ancorada na membrana plasmática que cataliza a conversão da
angiotensina I para o octapeptídeo ativo angiotensina II (CORVOL et al., 1995). A
ECA existe em duas isoformas: somática (sECA) e testicular ou germinal (gECA),
sendo esta expressa exclusivamente sobre a célula germinal haplóide no testículo e
caracterizada por uma região N-terminal espécie-específica e dividindo a mesma
região C-terminal com a sECA (SIBONY et al., 1993; SIBONY et al., 1994).
Fuchs et al (2005) não encontraram diferença na concentração, morfologia
ou motilidade espermática após a capacitação, comparando o sêmen de
camundongos tipo selvagem e homozigotos mutantes. Porém, após o teste de
ligação a zona pelúcida (ZP), os espermatozóides dos machos do tipo selvagem
ligaram-se facilmente a ZP (33,2 espermatozóide/ovócito) enquanto os
espermatozóides dos machos mutantes tiveram uma grande redução (1,2
espermatozóide/ovócito), demonstrando a importância da ECA no processo de
fertilização. Estes achados concordam com os dados de Hagaman et al (1998), que
relataram que espermatozóides de camundongos knockout-ECA apresentaram
inabilidade para migrar para o oviduto e deficiência de ligarem-se a ZP.
A capacidade fertilizante do espermatozóide é alcançada após a
capacitação, um processo maturacional que leva ao desenvolvimento do estado de
fertilização competente, in vivo ou in vitro (YANAGIMACHI, 1994). A fosforilação das
proteínas espermáticas é importante para a capacitação, especialmente nos
resíduos de tirosina (NAZ & RAJESH, 2004), sendo esta relacionada com a
capacitação espermática em bovinos (GALANTINO-HOMER et al., 2004) e
15
considerada o evento marca da capacitação (GALANTINO-HOMER et al., 1997). A
ECA é tirosina fosforilada no ectodomínio (SANTHAMMA et al., 2004), podendo
estar envolvida no processo de capacitação e, por conseguinte, na aquisição da
capacidade fertilizante. O papel exato da ECA no trato reprodutivo masculino e sua
real função no processo de fertilização não estão completamente elucidados,
principalmente em bovinos, podendo esta ser um candidato a marcador para
fertilidade na espécie.
Portanto, visando padronizar o processo de produção de doses de sêmen e
melhorar a qualidade do produto final comercializado pelos CCPSs e, também,
buscar um marcador de fertilidade para sêmen bovino o presente trabalho levanta
duas hipóteses: (1) que a implantação do sistema APPCC em um CCPS bovino
tenha como benefícios a padronização da produção de doses de sêmen, com
incremento na qualidade e (2) que a ECA esteja envolvida no processo de
fertilização em bovinos, podendo, futuramente, ser utilizada como marcador de
fertilidade.
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2 OBJETIVOS
Objetivo Geral
Elaboração e implantação de um sistema de Análise de Perigos e Pontos
Críticos de Controle em um centro de coleta e processamento de sêmen bovino.
Objetivos Específicos
Determinação dos possíveis perigos, pontos de controle (PC) e pontos
críticos de controle (PCC) relacionados ao processamento do sêmen
bovino.
Estabelecimento de protocolos de boas práticas de processamento (BPP),
procedimentos-padrão de higiene operacional (PPHO) e análise de
perigos e pontos críticos de controle (APPCC) que sirvam de modelos
para centros de coleta e processamento de sêmen bovino.
Otimização da eficiência do processo de criopreservação de sêmen
bovino, com redução dos custos e certificação da qualidade do produto
final.
Avaliar os efeitos do bloqueio da atividade da enzima conversora da
angiotensina em bovinos sobre parâmetros como: movimento
espermático, fosforilação de resíduos de tirosina (avaliados no processo
de capacitação espermática), taxas de clivagem e blastocisto após
fertilização in vitro.
Contribuir com os órgãos governamentais responsáveis pela fiscalização
dos centros de coleta e processamento de sêmen animal.
17
3 ARTIGOS
3.1 Artigo 1
Artigo formatado de acordo com as normas da revista Theriogenology
APPCC: um modelo para Centros de Coleta e Processamento de
Sêmen Animal
K.L. Goularte1*; E.H. Duval2; R.G. Mondadori 1,3; E.M. Madeira1, T. Lucia Jr 1
1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2LIPOA, Faculdade de Veterinária, 3Instituto
de Biologia
Universidade Federal de Pelotas, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil
*Autor para correspondência: ReproPel, Faculdade de Veterinária,
Universidade Federal de Pelotas,
Campus Capão do Leão, 96010-900, Pelotas, RS, Brasil;
Tel./fax: (55) 53-32759161. E-mail address: [email protected]
18
APPCC: um modelo para Centros de Coleta e Processamento de
Sêmen Animal
K.L. Goularte1*; E.H. Duval2; R.G. Mondadori 1,3, E.M. Madeira1, T. Lucia Jr 1.
1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2LIPOA, Faculdade de Veterinária, 3Instituto
de Biologia
Universidade Federal de Pelotas, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil
Resumo
O sistema de análise de perigos e pontos críticos de controle (APPCC) permite uma
abordagem científica e sistemática de controle dos processos identificando e
atuando sobre as etapas onde possam ocorrer perigos ou situações críticas. A
implantação do sistema satisfaz à legislação nacional e internacional, dando
segurança e abrindo as portas para a exportação. O objetivo do presente trabalho foi
elaborar um modelo de APPCC a ser implantado em centros de coleta e
processamento de sêmen animal, o qual permitirá um maior controle na produção
das doses de sêmen congelado bem como a certificação do produto oferecido. A
elaboração baseou-se na literatura disponível sobre a utilização do sistema na
indústria de alimentos e, também, nos resultados obtidos após a implantação do
APPCC em um centro de coleta e processamento de sêmen bovino. A elaboração
do plano levou em consideração as etapas de implementação do sistema. Cada
linha de produção apresenta um fluxograma diferente, devendo portanto, o plano ser
avaliado e adaptado para cada uma. A utilização do sistema nos centros de coleta e
processamento de sêmen animal permite um maior controle do processo de
produção de doses de sêmen congelado, diminuindo-se as perdas oriundas do
processamento e, por conseguinte, a elaboração de um produto com qualidade
certificada, sendo o mesmo mais competitivo possibilitando a inserção e manutenção
no mercado externo.
Paralavras-chave: APPCC, qualidade sêmen, centro de coleta
1. Introdução
Entende-se por Centro de Coleta e Processamento de Sêmen (CCPS) o local
em que se reúnem animais para a realização da coleta e processamento do sêmen
[1]. Esses centros ficam sob fiscalização do Ministério da Agricultura, Pecuária e
19
Abastecimento (MAPA) cumprindo exigências com relação a estrutura física,
documentação, exames sanitários entre outros. Esses requisitos são avaliados para
obtenção e manutenção do registro como CCPS.
O sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) vem ao
encontro de qualquer sistema de produção, permitindo uma abordagem científica e
sistemática de prevenção e controle dos processos, identificando e atuando sobre as
etapas onde possam ocorrer perigos ou situações críticas [2]. A utilização desse
sistema já vem sendo amplamente aplicada em vários ramos da indústria, além da
alimentícia [3]. Logo, a implantação do sistema APPCC nos CCPSs permite um
maior controle no sistema de produção de doses de sêmen congeladas e,
consequentemente, incremento na qualidade das doses produzidas.
O oferecimento de um produto com qualidade certificada permite as empresas
uma maior concorrência no mercado, atingindo inclusive mercados externos.
Segundo o Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio Exterior-Brasil, a
empresa que exporta adquire vantagens em relação aos concorrentes internos,
pois diversifica mercados, aproveita melhor sua capacidade instalada, aprimora a
qualidade do produto vendido, incorpora tecnologia, aumenta sua rentabilidade e
reduz custos operacionais.
Em 1998, o Ministério da Agricultura e Abastecimento instituiu, através da
portaria número 46, o SISTEMA DE ANÁLISE DE PERIGOS E PONTOS CRÍTICOS
DE CONTROLE - APPCC a ser implantado, gradativamente, nas indústrias de
produtos de origem animal sob o regime do Serviço de Inspeção Federal – SIF,
considerando a necessidade de atendimento aos compromissos internacionais
assumidos no âmbito da Organização Mundial de Comércio (OMC) e consequentes
disposições do Codex Alimentarius, assim como no do MERCOSUL. Logo, a
20
implantação do APPCC satisfaz à legislação nacional e internacional, dando
segurança e abrindo as portas para a exportação [4].
A aplicação do sistema em diferentes áreas de produção vem demonstrando
seus benefícios como, controle de indicadores de condições higiênico-sanitárias no
leite [5], redução dos custos para manter a qualidade em planta de processamento
de pescados [6] e medidas preventivas para pontos de controle e pontos críticos de
controle na produção suína [7]. Assim, a utilização do sistema APPCC na indústria
de material genético animal, além de promover a padronização dos serviços
oferecidos garantirá a qualidade do produto final, tornando o mesmo competitivo e
atrativo para o mercado externo.
O modelo aqui apresentado baseou-se nos princípios do sistema já utilizados na
indústria de alimentados [9], nos resultados obtidos com a implantação do APPCC
em um CCPS bovino (dados não mostrados) e, também, no depósito de pedido de
patente do processo gerado nesse trabalho [8]. Vale ressaltar que, as indústrias
apresentam fluxograma diferente, ou seja, a avaliação do modo de produção deverá
ser realizado por um profissional capacitado, bem como as adaptações necessárias
a cada linha de produção.
2. Elaboração do APPCC
A elaboração do sistema é realizada baseando-se nas etapas abaixo
relacionadas.
2.1 Definição dos objetivos
Nesta etapa são identificados os objetivos da implantação do sistema na
empresa em questão, como maior controle do processo de produção de doses de
sêmen congeladas; diminuição das perdas oriundas do processamento inadequado
21
ou da falta de controle sobre alguma etapa do processo; produção de doses de
sêmen bovino congeladas com qualidade certificada; inserção no mercado externo;
entre outros.
2.2 Identificação e organograma da empresa
A elaboração do plano inicia pela identificação, razão social, endereço e telefone
da empresa, o que por ela é produzido e o destino de sua produção (mercado
interno e/ou externo). Devem ser identificados os setores envolvidos no
desenvolvimento, implantação e manutenção do sistema, sendo nomeados os
responsáveis e suas respectivas funções e atribuições pela elaboração, implantação,
acompanhamento e revisão do programa.
2.3 Descrição do produto e uso esperado
Nessa etapa, o produto a ser comercializado deve ser descrito, por exemplo: “o
produto sêmen bovino congelado é composto por sêmen bovino adicionado de
diluente para sua manutenção e preservação”.
As informações que estão contidas nessa etapa são a composição do produto
como matéria-prima e demais ingredientes, as características importantes do
produto final, como motilidade e vigor mínimos aceitáveis, as formas de uso
esperado como inseminação artificial e fertilização in vitro, as características da
embalagem e as instruções contidas na mesma como número da partida
correspondente a data do congelamento, nome ou número de registro do CCPS no
MAPA, nome e número de registro genealógico definitivo do doador, código da raça
- padronizado internacionalmente por duas letras, e no caso de sêmen sexado letra
M para Macho e F para Fêmea) [1].
22
Nessa etapa é importante mencionar também os cuidados durante a distribuição
e comercialização onde pode ser citado a manutenção das doses de sêmen em
nitrogênio líquido, devendo este ser periodicamente medido para evitar danos às
amostras congeladas.
2.4 Fluxograma do processo
A descrição do processo de produção das doses de sêmen bovino congelado
facilita a identificação de perigos e etapas potencialmente danosas para a qualidade
do produto final. O fluxograma compreende desde a avaliação do status sanitário do
rebanho, toalete dos touros até o armazenamento e posterior liberação das doses
para comercialização. A descrição do processo segue a ordem do fluxograma.
Ainda, para cada etapa do processamento, o POP (procedimento operacional
padrão) correspondente deve ser elaborado. Cada POP contempla as seguintes
informações: operação a ser realizada, responsável, descrição da atividade, ação
preventiva, monitoramento, ação corretiva e registro. Na figura 1 encontra-se um
modelo de fluxograma para centro de coleta e processamento de sêmen animal,
ressaltando que cada CCPS terá seu próprio fluxograma.
2.5 Classes e tipos de perigos contemplados no plano
Refere-se aos possíveis perigos encontrados desde a coleta do sêmen até o
envase, congelamento e liberação do produto final.
Perigo por definição é agente biológico, químico ou físico presente ou adicionado
ao ejaculado, com potencial para causar perda da viabilidade, da qualidade do
produto final ou representar risco para a sanidade do rebanho onde a dose for
utilizada (adaptado de [9]).
23
Em um CCPS são considerados perigos biológicos (B) bactérias, vírus ou
protozoários, perigos químicos (Q) alguns componentes utilizados na elaboração do
diluente como o crioprotetor glicerol e resíduos dos desinfetantes utilizados na
limpeza do material. Perigos físicos (F) são considerados presença de maravalha,
poeira, terra ou qualquer objeto que possa causar prejuízo na qualidade da amostra
ou risco ao animal em que a dose de sêmen será utilizada. Temperatura elevada ou
reduzida do diluente no momento da diluição podendo causar choque térmico e
resíduo de água no material utilizado para coleta, nesse caso também são
considerados perigos físicos. Adição errônea do volume de diluente interfere na
padronização das doses produzidas. Todos estes perigos citados acima são
exemplos que podem ser modificados para cada estabelecimento.
A elaboração de um formulário identificando todas as etapas do processamento,
com os perigos potenciais para cada etapa, a respectiva análise dos perigos e suas
medidas preventivas auxiliam na tomada de decisões, sendo importante anexá-lo ao
plano. Cada etapa pode apresentar mais de um perigo, devendo os mesmos serem
identificados e listados. Os perigos referentes a etapas posteriores ao fluxograma,
que não podem ser controlados no estabelecimento, podem ser listados e
identificados em formulário próprio.
2.6 Análise dos perigos e medidas preventivas
Esta etapa é efetuada contemplando a identificação dos perigos significativos,
do risco e da severidade de cada perigo e caracterização das medidas preventivas
correspondentes. Para garantir a segurança, sempre que necessário deve-se
modificar o processo. Esta etapa serve de base para identificação dos pontos
críticos de controle (PCCs).
24
2.6.1 Risco e Severidade dos Perigos
Perigos Biológicos: risco zero não existe no mundo biológico [10], mas ele deve
ser o mais próximo possível a este valor. Para avaliação da severidade do perigo
biológico deve ser levada em consideração a recomendação da OIE [11] de
contagens abaixo de 5000 UFC/ml de sêmen processado.
Perigos Químicos: Na avaliação da severidade destes perigos deve ser levado
em consideração o fato de o componente ser ou não espermicida, sendo altamente
prejudicial para a amostra ou apenas diminuir a viabilidade dos espermatozóides
[12]. É importante lembrar que a composição correta dos diluidores é fundamental
para o sucesso da criopreservação [13].
Perigos Físicos: Presença de maravalha e/ou terra no ejaculado deve ser
avaliada em termos de quantidade e no caso de excesso destes contaminantes o
ejaculado deve ser descartado. O espermatozoide não é adaptado a sofrer as
variações de temperatura envolvidas na criopreservação, devendo estas, assim
como os tempos de resfriamento e congelamento, serem obedecidas [14,15].
2.6.2 Limites críticos e de segurança
Limite crítico por definição é um critério, valor ou atributo, que separa o
aceitável do inaceitável [9], enquanto que o limite de segurança é um critério mais
estreito ou restrito que o limite crítico, sendo parâmetro utilizado para reduzir o risco
[2]. Cada CCPS deve definir o limite crítico e de segurança para os perigos
identificados, como por exemplo a concentração de glicerol no diluente citrato-gema
para sêmen bovino, que pode variar de 6 a 8% [16]. O limite crítico será um valor,
nesse caso, o qual encontra-se fora da variação permitida e, o de segurança,
compreendido dentro da variação.
25
2.6.3 Medidas preventivas
As medidas preventivas devem estar listadas em formulário próprio,
identificando-se a etapa, os perigos encontrados (B e/ou Q e/ou F) com suas
respectivas medidas.
Exemplo:
Etapa – pré-coleta (toalete do touro);
Perigos encontrados: F - maravalha, terra; Q - resíduo do desinfetante e B -
microrganismos contaminantes;
Medidas preventivas: Higiene Pessoal dos Colaboradores, Realização da
toalete conforme descrito (POP), higienizando o prepúcio externamente e
internamente, secando a região previamente a coleta.
2.7 Identificação dos Pontos Críticos de Controle
As Boas Práticas de Fabricação (BPF) e os Procedimentos Padrão de Higiene
Operacional (PPHO), juntamente com o Sistema de Análise de Perigos e Pontos
Críticos de Controle (APPCC) formam os Programas de Autocontrole conforme as
Circulares Nº 175 e Nº 176 de 2005 [17,18], para indústrias de alimentos. A
implantação desses programas é capaz de controlar muitos dos perigos identificados
(Pontos de Controle – PC). Já, os perigos que não são controlados através dos
programas de BPF e PPHO, e não passarão por etapas subsequentes capazes de
colocá-los sob controle, são nomeados de Ponto Crítico de Controle – PCC. Estes
devem ser mantidos sob controle através da aplicação de medidas preventivas.
Estes conceitos são igualmente aplicados para fluxogramas de produção em
indústrias de difusão de material genético animal.
26
No fluxograma de processo e nas planilhas, os PCCs devem estar
representados numa sequência numérica de acordo com a ordem em que são
detectados, com indicação, entre parênteses, se o perigo é de natureza biológica
(B), química (Q) ou física (F). Ressaltando que, mais de um perigo pode ser
controlado em um mesmo PCC.
No quadro 1 encontra-se um exemplo das perguntas que devem ser respondidas
no momento da elaboração do formulário para a identificação e registro das etapas
onde os perigos podem ser controlados com base nos pré-requisitos (PC) e/ou
aqueles considerados como PCCs.
Dois exemplos podem ser citados como possíveis PCCs em um fluxograma de
coleta, avaliação e congelamento de sêmen, sendo eles a avaliação do status
sanitário do rebanho e a etapa de diluição final. Caso o diagnóstico de alguma
enfermidade não tenha sido realizado (perigo biológico), nenhuma etapa posterior
corrigirá, podendo ela ser transferida através da dose de sêmen para outros
rebanhos. Da mesma forma, se a medição do volume de diluente (perigo físico) na
etapa de diluição final for efetuado de forma equivocada, nenhuma etapa posterior
corrigirá esse desvio. Nesse caso, poderão ser produzidas doses com uma
concentração abaixo do que estará descrito (excesso de diluente adicionado) ou
acima (escassez de diluente adicionado), sendo que neste último caso o CCPS
deixará de produzir o número possível de doses.
2.8 Procedimentos de Monitoração e estabelecimento das Ações
Corretivas
A monitoração é uma sequência planejada de observações e mensurações
utilizada para avaliar se o (s) perigo (s) da (s) etapa (s) considerada (s) PCC (s) está
27
(ão) sob controle. Caso um desvio ocorra, ações corretivas devem ser
imediatamente aplicadas.
Para esse processo são utilizados métodos de monitoração como observação
visual do processo nas etapas correspondentes aos perigos, medição de volumes e
aferições de temperaturas, como por exemplo, temperatura da estufa ou banho-
maria onde o diluente é mantido e do balcão refrigerado onde é realizada a curva de
resfriamento das amostras.
No processo de monitoração deve ser descrito o que está sendo monitorado, a
forma e frequência de monitoramento e o responsável, conforme quadro 2.
2.9 Procedimentos de Verificação
São procedimentos que somados a monitoração evidenciam se o sistema
APPCC está funcionando corretamente, sendo realizados para assegurar que os
PCCs estão sob controle e que o plano está sendo cumprido, validar as mudanças
implementadas no plano original, assim como a modificação do plano devido a
mudanças no processo, equipamento, e outras.
Esta etapa é realizada com a adoção de processo técnico ou científico através
de uma revisão do processo e/ou de literatura, no que se refere aos limites críticos
nos PCCs verificando se os mesmos são adequados ao controle dos perigos,
processo de validação do plano assegurando que o sistema APPCC está
funcionando efetivamente e/ou processo de auditoria interna avaliando
conformidades ou não-conformidades do sistema.
A frequência de verificação do plano deve ser suficiente para confirmar que o
sistema está funcionando de forma eficaz [9], podendo em um primeiro momento,
ser realizada mensalmente. A verificação deve ser arquivada juntamente com todos
28
os registros de monitoração dos PCCs, desvios e ações corretivas, relatórios de
treinamentos de atualização dos colaboradores e, qualquer alteração que for
realizada no plano e/ou fluxograma do processo.
2.10 Procedimentos de Registros
Os registros devem ser realizados em toda linha de processamento. As tarefas
correspondentes aos POPs são informadas nas planilhas de utilização de
equipamentos e/ou tarefas realizadas, limpeza das instalações e equipamentos,
calibração de equipamentos e aferição das temperaturas. Além desses registros, o
relatório de verificação atualizado a cada 12 meses também deverá ser arquivado.
Por fim, registros das auditorias informando conformidades e não conformidades do
processo. Todos esses registros devem ser mantidos arquivados para controles
futuros.
2.11 Resumo do Plano
No resumo do plano devem ser informados: identificação dos perigos, pontos de
controle, pontos críticos de controle, limites críticos e limites de segurança (avaliados
para cada CCPS), procedimentos de monitoração, ações corretivas, procedimentos
de verificação e sistemas de registro.
No quadro 3 segue um exemplo de como elaborar o resumo do plano.
3. Histórico de Revisão do Plano
A validação do plano fica condicionada ao resultado de auditoria específica,
realizada por profissional capacitado, executada preferencialmente no prazo de 30
dias após a comunicação da implantação do plano por parte da empresa [2]. Deve
29
ser elaborado um histórico de revisão do plano, onde a implantação representa o
início das atividades e cada revisão numerada progressivamente com identificação
das alterações, caso essas existam.
30
Referências
[1] Brasil. Instrução Normativa Nº 53, de 27 de setembro de 2006. Aprova o
Regulamento para registro e fiscalização de Centro de Coleta e Processamento
de Sêmem (CCPS) bovino, bubalino, caprino e ovino. Ministério da Agricultura
Pecuária e Abastecimento
[2] Brasil. Portaria Nº 48, de 10 de fevereiro de 1998. Instituir o Sistema de Análise
de Perigos e Pontos Críticos de Controle - APPCC a ser implantado,
gradativamente, nas indústrias de produtos de origem animal sob o regime do
Serviço de Inspeção Federal – SIF.
[3] World Health Organization. Application of Hazard Analysis and Critical Control
Point (HACCP) methodology to pharmaceuticals. In: WHO Technical Report
Series. Geneva, Nº. 908, Anexo 7, 2003;99-110.
[4] Ribeiro-Furtini LL, Abreu LR. Utilização de APPCC na indústria de alimentos.
Ciênc. agrotec 2006;30:358-363.
[5] Spexoto AA, Oliveira CAF, Olival AA. Application of hazard analysis and critical
control points system in a grade A dairy farm. Ciência Rural 2005;35:1424-1430.
[6] Lupin HM, Parin MA, Zugarramurdi A. HACCP economics in fish processing plants.
Food Control 2010;21:1143–1149.
[7] Horchner PM, Pointon AM. HACCP-based program for on-farm food safety for pig
production in Australia. Food Control 2011;22:1674-1688.
[8] Depósito de Pedido de Patente NºPI1106687-3. Sistema de análise de perigos e
pontos críticos de controle (APPCC) para centros de coleta e processamento de
sêmen (CCPS) animal 2011.
31
[9] Fao and Who. Food Hygiene. World health organization and Food and agriculture
organization of the United Nations. Fourth edition, Rome, 2009, 136p.
[10] Thibier M, Guerin B. Hygienic aspects of storage and use of semen for artificial
insemination. Animal reproduction science 2000;62:233–251.
[11] Office International des Epizooties. Toma y Tratamiento del semen. In: Código
Zoosanitário Internacional. Décima edición, França 2001;315-323.
[12] Maia MS. Tecnologia do Sêmen e Inseminação Artificial em Caprinos e Ovinos.
VII Circuito de tecnologias adaptadas para a agricultura familiar, Governo do
Estado do Rio Grande do Norte. ISSN 1983-280 X, 2010.
[13] Reichenbach HD, Moraes JCF, Neves JP. Tecnologia do Sêmen e Inseminação
Artificial em Bovinos. In: Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo:
Ed. Roca; 2008, p.57-82.
[14] Watson PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal
Reproduction Science 2000;60–61:481–492.
[15] Holt WV. Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction
Science 2000;62:3–22.
[16] Vandemark NL, Miller WJ, Kinney WCJr, Rodriguez C, Friedman ME.
Preservation of Bull Semen at Sub-Zero Temperatures.
http://www.gutenberg.org/files/37041/37041-h/37041-h.htm#Ch3. 2011; pp. 49
[17] Brasil. Circular Nº 175, de 16 de maio de 2005. Coordenador geral de
programas especiais / Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Anima.
Procedimentos de verificação dos programas de autocontrole.
[18] Brasil. Circular Nº 176, de 16 de maio de 2005. Coordenador geral de
programas especiais / Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal.
Modificação das instruções para a verificação do PPHO, encaminhados pela
32
Circular Nº 201/97 DCI/DIPOA e aplicação dos procedimentos de verificação dos
Elementos de Inspeção previstos na Circular Nº 175/2005 CGPE/DIPOA.
33
Figura 1: Modelo de um fluxograma para centro de coleta e processamento de
sêmen animal.
Avaliação do status sanitário dos machos doadores de
sêmen e das manequins utilizadas para a coleta (PCC1)
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Toalete na região prepucial do macho doador de sêmen e na
região do quarto da manequim
Coleta do sêmen
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Entrega do ejaculado na janela de duplo óculo
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Avaliações e diluição inicial
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Curva de resfriamento
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Diluição final (PCC2)
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Estabilização 1
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Envase
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Estabilização 2
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Curva de congelamento
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Armazenamento
Rebanho residente - Início do regime de coleta
Avaliação para liberação das doses para comercialização
Rebanho residente - Início do regime de coleta
34
Quadro 1: Determinação do PCC.
Etapa do processo
Perigos Significativos
(F, Q e B)
O perigo é controlado pelo programa de pré-
requisitos?
Existem medidas preventivas para o perigo?
Esta medida elimina ou reduz o perigo a níveis
aceitáveis?
O perigo pode aumentar a níveis inaceitáveis?
Uma etapa subsequente eliminará ou reduzirá o
perigo a níveis aceitáveis?
PCC / PC
35
Quadro 2: Monitoramento do(s) PCC(s).
Etapa / PCC Diluição final – PCC1
O que? Volume de diluente
Limite crítico 5% para mais ou para menos do volume final a ser
adicionado
Como? Observação visual do processo, Aferir o volume das
diferentes porções do diluente em outra proveta.
Quando? Sempre que for realizada a diluição final.
Quem? O funcionário responsável pela diluição final.
Ação corretiva:
PCC1 – aquisição de provetas novas;
Treinamento dos colaboradores.
36
Quadro 3: Resumo do plano APPCC.
Etapa PC/
PCC
Perigos Medidas Preventivas Limite crítico Monitoração Ação
corretiva
Registro Verificação
Pré-
coleta
PC Maravalha,
terra;
Resíduo do
desinfetante;
microrganism
os
Aplicação do
procedimento referente
a higiene pessoal dos
colaboradores;
Realização da toalete
conforme descrito no
Procedimento
Operacional Padrão.
Resíduo de
desinfetante =
ausente
O que? A realização da
toalete nos touros
Como? Observação visual
da toalete
Quando? Semanalmente
durante a toalete
Quem? Colaborador do
controle de qualidade
Realizar a
toalete
novamente.
Registro
diário das
coletas
Mensal
37
3.2 Artigo 2
Artigo formatado de acordo com as normas da revista Veterinary
Microbiology (ISSN: 0378-1135)
Impacto da implantação do sistema APPCC em um centro de
coleta e processamento de sêmen bovino
Goularte, Karina Lemos1*; Duval, Eduarda Hallal2; Mondadori, Rafael
Gianella1,3; Vieira, Arnaldo Diniz1; Ferreira, Carlos Eduardo Ranquetat1;
Lucia, Thomaz, Jr1
1ReproPEL, Faculdade de Veterinária,2LIPOA, Faculdade de
Veterinária,3Instituto de Biologia
Universidade Federal de Pelotas, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil
* Autor para correspondência: ReproPel, Faculdade de Veterinária,
Universidade Federal de Pelotas,
Campus Capão do Leão, 96010-900, Pelotas, RS, Brasil;
Tel./fax: (55) 53-32759161. E-mail address: [email protected]
38
Impacto da implantação do sistema APPCC em um centro de
coleta e processamento de sêmen bovino
Goularte, Karina Lemos1; Duval, Eduarda Hallal2; Mondadori, Rafael Gianella1,3;
Vieira, Arnaldo Diniz1; Ferreira, Carlos Eduardo Ranquetat1; Lucia, Thomaz, Jr. 1
1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2LIPOA, Faculdade de Veterinária,
3Instituto de Biologia
Universidade Federal de Pelotas, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil
Resumo
Ainda que 53,3% das doses de sêmen bovino comercializadas no Brasil sejam
produzidas em Centros de Coleta e Processamento de Sêmen (CCPS) nacionais,
estes sistemas de produção não possuem metodologia padronizada. O objetivo
deste trabalho foi avaliar a influência da implantação de um sistema de análise de
perigos e pontos críticos de controle (APPCC) sobre a eficiência de produção e a
qualidade do sêmen produzido em um CCPS bovino. Inicialmente, foi realizado o
acompanhamento das atividades e a descrição do fluxograma do processo, com
elaboração de manuais necessários à implantação do sistema APPCC,
descrevendo: boas práticas de processamento; procedimentos padrão de higiene
operacional; e procedimentos operacionais padronizados. O impacto da adoção do
sistema foi avaliado mediante a realização de duas avaliações, com intervalo de oito
meses, considerando parâmetros de viabilidade espermática, níveis de
contaminação microbiológica e a produtividade do sistema. Após a adoção do
sistema APPCC, houve melhoria na motilidade espermática e na integridade da
membrana plasmática e do acrossoma pós-descongelamento (P < 0,0001), redução
39
dos níveis de contaminação microbiológica (P = 0,0004) e queda no número de
doses de sêmen rejeitadas (P < 0,05). A implantação do sistema APPCC padronizou
o processamento das doses de sêmen, incrementando a qualidade das doses
produzidas.
Palavras-chave: APPCC, controle microbiológico, qualidade, sêmen bovino.
1. Introdução
No Brasil, a comercialização de sêmen bovino aumentou 51,1% de 2009 até
2012, sendo o sêmen produzido no Brasil responsável por 53,3% do movimento
comercial (Asbia, 2012). O Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
(MAPA) regulamenta essa atividade no Brasil através de: Lei Nº 6.446 de
05/10/1977; Decreto Nº 187 de 09/08/1991; IN Nº 48 de 17/06/2003; IN Nº 2 de
14/01/2004; IN Nº 8 de 10/03/2006 e a IN Nº 53 de 27/09/2006. No decreto 187
(1991, Art.7◦) consta a seguinte redação: “O Ministério da Agricultura e Reforma
Agrária (atual MAPA) estabelecerá padrões tecnológicos e higiênico-sanitários para
sêmen destinado à comercialização, inclusive quanto à garantia de identidade e
qualidade”. Porém, a legislação não define uma metodologia padronizada para
orientação dos Centros de Coleta e Processamento de Sêmen (CCPS) para
comercialização de doses de sêmen congelado, com padrões similares e com
qualidade certificada.
Existem muitas fontes de variabilidade (fisiológicas, metodológicas e
operacionais) que podem influenciar a qualidade final do sêmen produzido em um
CCPS, o que justifica o estabelecimento de um sistema de controle (Álvarez et al.,
2005). O sistema de análise de perigos e pontos críticos de controle (APPCC) foi
originalmente desenvolvido para identificar, avaliar e controlar perigos significantes
40
para a segurança alimentar (FAO & WHO, 2009). Entretanto, seus princípios vêm
sendo amplamente utilizados em outros ramos industriais (WHO, 2003), uma vez
que o emprego de medidas preventivas adequando o controle dos processos,
acompanhado por verificações periódicas e ações corretivas, é considerado mais
efetivo do que a inspeção de problemas no produto final (Ropkins & Beck, 2000).
Portanto, a aplicação do sistema APPCC em um CCPS bovino permitiria maior
controle do processo de produção de doses de sêmen congelado, identificando os
perigos e aplicando medidas preventivas, visando diminuir perdas no
processamento, para incrementar a qualidade do produto final.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da implantação de um sistema
APPCC, com suas adequações, em um CCPS, sobre a viabilidade espermática, os
níveis de contaminação microbiológica e a eficiência de produção do sistema.
2. Metodologia
Coleta de dados e elaboração de documentos
O trabalho foi realizado em um CCPS localizado no município de Delta-MG.
Inicialmente, foi feito o acompanhamento da rotina de trabalho no CCPS, com a
descrição das tarefas realizadas, desde a higienização no prepúcio dos touros
previamente a coleta até a liberação das doses de sêmen congeladas para
comercialização.
Durante um período de 30 dias, foram levantados os dados para elaboração dos
manuais de Boas Práticas de Processamento (BPP) e Procedimentos Padrão de
Higiene Operacional (PPHO), visando a padronização da produção e a redução de
perdas. Ainda, todas as tarefas e o funcionamento e manutenção dos equipamentos
foram descritos, dando origem aos Procedimentos Operacionais Padronizados
41
(POPs). Esse conjunto de documentos foi empregado na composição do sistema de
Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), formando os Programas
de Autocontrole (BrasilA, BrasilB 2005).
Durante o levantamento dos dados para a elaboração dos documentos, foram
coletadas amostras para avaliar a contaminação bacteriana em algumas etapas
identificadas como potencialmente perigosas para a qualidade das amostras
produzidas. Também foram colhidas amostras de sêmen congelado, para análise de
qualidade seminal. Os pontos de coleta foram: lavado da vagina artificial (VA);
sêmen puro (SP); diluente pré-diluição (DP); fração A do diluente de congelamento
do sêmen (DA); fração B do diluente de congelamento do sêmen (DB); sêmen
resfriado (SR); lavado do tubo flexível da máquina de envase (TF); sêmen envasado
(SE); e sêmen congelado (SC).
Para a coleta de amostras da VA e do TF, foi realizada uma lavagem com 10mL de
água peptonada tamponada autoclavada. Para avaliar a carga microbiana presente
no SP, SR, SE, DP, DA e DB, as amostras foram diluídas em água peptonada
tamponada autoclavada, realizando-se diluições seriadas, quando necessário, ou
semeando as amostras puras. O cultivo em duplicata foi realizado em Plate Count
Agar (PCA) conforme metodologia recomendada pela OIE (2001), utilizando-se
500µL da amostra em cada placa semeada pelo método “Plour Plate”, e incubadas a
37oC por 72h. Após esse período, foram selecionadas as placas cuja diluição
apresentava o intervalo entre 30 e 300 colônias para a realização da contagem. Os
resultados foram expressos em unidades formadoras de colônia (UFC/mL).
Após a confecção dos manuais, foi conduzido um treinamento, para conscientização
dos colaboradores. Posteriormente, foi realizado o acompanhamento da adoção das
práticas recomendadas para alguns procedimentos.
42
Análise da qualidade seminal
As amostras de SC foram analisadas antes e após a implantação do sistema
APPCC. As palhetas foram descongeladas em banho-maria a 37oC durante 30s.
Foram avaliadas: a motilidade espermática progressiva; a integridade da membrana
plasmática através das sondas diacetato de carboxifluoresceína e iodeto de propídio
(Harrison & Vickers, 1990) e a integridade do acrossoma com a utilização da sonda
Lectin pisum sativum (Kawamoto et al., 1999).
Avaliação da eficácia do sistema APPCC
Oito meses após a implantação dos manuais, foi realizada uma nova coleta de
amostras, nos mesmos locais, para análise microbiana, com o objetivo de avaliar a
eficácia da implantação do sistema APPCC na padronização das tarefas e redução
da contaminação das doses produzidas.
Dados de produção do CPPS
A eficiência de produção do CPPS foi avaliada através da comparação do número
de ejaculados, de partidas e de doses de sêmen rejeitadas, antes e após a
implantação do sistema APPCC. Também foi feita uma simulação do impacto
econômico da implantação do sistema APPCC, considerando um custo médio de
R$2,50 por dose produzida (custos fixos + custos variáveis). Para o cálculo do valor
que o CCPS deixou de ganhar com a venda das doses de sêmen, ou custo de
oportunidade (Polson et al, 1993), foi considerado um valor médio de R$20,00 por
dose (valor médio de comercialização).
Análise estatística
O número de UFC/mL nos diferentes pontos de coleta foi comparado entre os
períodos antes e após a implantação do sistema APPCC, através de análise de
variância, com comparação entre médias pelo teste de Tukey. Em função da
43
ausência de normalidade, detectada pelo teste de Wilk-Shapiro, o número de
UFC/mL foi submetido à transformação para a escala logarítmica. A motilidade
espermática e a integridade da membrana espermática e do acrossoma pós-
descongelamento foram comparados entre os períodos através do teste de soma
dos rankings de Wilcoxon, para dados não paramétricos, pois também não
apresentaram normalidade. As frequências de rejeição de ejaculados, partidas e
doses de sêmen foram comparadas entre os períodos, através do teste de qui-
quadrado. Todas as análises foram conduzidas com Statistix® (2008).
3. Resultados
A implantação do sistema APPCC promoveu uma redução da contaminação
microbiana (P < 0,05) nas amostras de VA, SP e TF (Tabela 1). Também ocorreu um
aumento na contaminação do sêmen resfriado (SR) após a implantação do sistema
APPCC (P < 0,05).
A contaminação das amostras de SE não diferiu entre os período anterior e o
período posterior à implantação do sistema APPCC (P > 0,05), porém houve um
aumento no SR até o momento do envase no período pós-implantação (P < 0,05).
Apesar disso, houve redução da população bacteriana no SC (P < 0,05).
A motilidade, a integridade da membrana espermática e a integridade do acrossoma
nas amostras de sêmen produzidas e descongeladas após a implantação do sistema
APPCC foram superiores (P < 0,05) às observadas no período anterior (Tabela 2).
No período de 4 meses antes da implantação do sistema APPCC, foram coletados
2.916 ejaculados, dos quais 1.039 (35,0%) foram rejeitados (Tabela 3). Já no
período posterior, 731 dos 2.117 ejaculados coletados foram rejeitados (34,5%), o
que representou uma porcentagem semelhante à observada no período anterior (P <
44
0,05). Porém, houve uma redução de mais de 12 pontos percentuais na rejeição de
partidas de sêmen e de 10 pontos percentuais na rejeição de doses de sêmen (P <
0,05), após a implantação do sistema APPCC, em comparação com o período
anterior (Tabela 3).
De acordo com a simulação financeira, antes da implantação do sistema APPCC, o
descarte de 70.429 doses representaria uma perda de R$ 176.072,50, durante o
período analisado. O custo de oportunidade associado à rejeição destas doses seria
de R$ 1.408.580,00. Após a implantação do sistema APPCC, as perdas por rejeição
de doses seriam de R$ 68.685,00 e o custo de oportunidade foi reduzido para
R$549.480,00. Assim, o CCPS reduziria suas perdas financeiras em R$ 107.387,50.
4. Discussão
No Brasil, existem atualmente 27 CCPS bovinos registrados no MAPA, que é
responsável pela fiscalização desses estabelecimentos, bem como pela inscrição
dos animais doadores de sêmen. Segundo o Código Terrestre de Saúde Animal
(OIE, 2013), os objetivos do controle sanitário oficial da produção de sêmen são:
manter a saúde dos animais dos CCPS em um nível que permita a distribuição
internacional desse produto, com risco desprezível de infectar outros animais ou ao
homem; e garantir que o produto seja coletado, processado e armazenado
higienicamente. Porém, nem o MAPA nem a OIE indicam adequadamente a maneira
correta e/ou eficaz de se obter um produto seguro e com qualidade. A utilização do
sistema APPCC na indústria de coleta e processamento de sêmen permitiu uma
abordagem sistemática do processamento, identificando etapas potencialmente
prejudiciais à segurança e qualidade do produto, bem como a utilização de medidas
preventivas que contribuam para a qualidade do produto final. Apesar de sistemas
45
desta natureza já serem utilizados na indústria de alimentos (Ribeiro-Furtini & Abreu,
2006; Wang et al., 2010), o presente trabalho é o primeiro a relatar o impacto da
implantação de um sistema APPCC em um CCPS comercial.
A obtenção de um ejaculado estéril não é viável do ponto de vista fisiológico, pois
microrganismos estão presentes na microflora do prepúcio ou na genitália externa do
touro (Thibier & Guerin, 2000), ou podem ser introduzidos durante a coleta ou o
processamento do sêmen, no ambiente da sala de coleta ou no laboratório (Kaproth
& Krick, 2004). Porém, a identificação dos perigos através do sistema APPCC
permitiu que fossem estabelecidas medidas preventivas para controlá-los. Com a
realização de procedimentos padronizados na toalete dos touros, no preparo da VA
e com a suspensão do reaproveitamento dos tubos flexíveis da máquina de envase,
foi possível reduzir a carga microbiana oriunda dessas etapas, o que resultou na
diminuição do nível de contaminação, tanto do sêmen puro, como do sêmen
congelado. As contagens de UFC nos diluentes DP, DA e DB após a implantação do
APPCC foram superiores às observadas no período anterior. Na avaliação do
processo de elaboração do diluente, com seus respectivos pontos de controle,
observou-se a ineficácia do antibiótico tilosina, utilizado no coquetel de antibióticos.
É importante ressaltar que essa constatação somente foi possível porque o sistema
APPCC estava implantado. Os diluidores prolongam a viabilidade do sêmen, mas
também proporcionam a oportunidade para certas bactérias contaminantes
alcançarem seu limiar necessário para provocar um efeito negativo sobre a
fertilidade do sêmen preservado (Althouse, 2008). Após a identificação da origem do
problema, a partida do antibiótico tilosina foi substituída e as contagens microbianas
subsequentes foram reduzidas (dados não publicados). A preparação do diluente
deve enfatizar a utilização de produtos com qualidade, higiene pessoal e limpeza de
46
equipamentos e utensílios (Hueston & Sivula, 1988), sendo todos esses aspectos
abordados no sistema APPCC. O aumento nas contagens microbianas no SR no
momento pós-implantação foi consequência do aumento nas contagens nas
amostras das frações do diluente, pois se considerada a redução das contagens no
SP, o SR consequentemente apresentaria menor contaminação.
Os CCPS devem produzir doses inseminantes livres de contaminantes, na medida
do possível (Hueston & Sivula, 1988). Nesse sentido, o acompanhamento e a
revisão do fluxo de produção com a utilização do sistema APPCC mantém os
perigos sob controle, permitindo a imediata correção dos desvios, preferencialmente
através de ações preventivas. Antes da implantação do sistema, os tubos flexíveis
da máquina de envase (TF) foram identificados como fonte de contaminação para as
doses produzidas, pois o processo de lavagem e a tentativa de esterilização eram
ineficazes para reduzir ou eliminar a sua contaminação interna. A suspensão do
reaproveitamento dos TF propiciou a ausência de contaminação microbiana após a
implantação do sistema. Portanto, se o equipamento e as instalações não são
adequadas para o processamento e limpeza, provavelmente serão fontes constantes
de contaminação (Kaproth & Krick, 2004), sendo os mesmos monitorados e
avaliados constantemente no sistema APPCC.
A OIE, (2001) preconiza uma carga microbiana de no máximo 5.000 UFC/ml de
sêmen processado, buscando-se com a utilização do sistema APPCC a adequação
das doses produzidas a essa norma internacional. Um crescimento excessivo de
bactérias pode resultar em aglutinação espermática e diminuição da motilidade e
viabilidade (Althouse, 2008), podendo provocar infecção uterina na fêmea que
receber a dose inseminante (Kaproth & Krick, 2004). Com a adoção do sistema
APPCC, houve uma redução na contaminação microbiana no SC, em comparação
47
com o período anterior. Apesar das contagens microbianas ainda continuarem acima
do preconizado pela OIE, a redução nas contagens no SC após a implantação do
sistema provavelmente não foi marcante devido à ineficácia do antibiótico tilosina.
Porém, com as adequações realizadas no fluxograma de produção das doses de
sêmen congeladas, conseguiu-se uma redução significativa nessas contagens e,
consequentemente, a qualidade das doses produzidas.
A avaliação isolada de um parâmetro espermático não apresenta sensibilidade
suficiente para a determinação da fertilidade, porém, a combinação de diversos
métodos tem agregado maior precisão para a estimativa do potencial de fertilização
das amostras de sêmen bovino (Maziero et al., 2009). No presente trabalho foram
avaliados a motilidade progressiva e a integridade das membranas plasmática e
acrossomal das amostras após sofrerem as crioinjúrias do congelamento e
descongelamento. Houve um incremento na qualidade seminal, observada nos três
parâmetros, após a implantação do sistema APPCC, podendo este estar relacionado
a diminuição das contagens microbianas encontradas nessas amostras (SC), no
mesmo período. A contaminação bacteriana excessiva em amostras de sêmen
reduz a viabilidade espermática (Althouse, 2008), principalmente pela indução de
apoptose e necrose, que podem ser parcialmente responsáveis pela redução da
motilidade espermática (Moretti et al., 2009). Alguns agentes patogênicos podem
afetar diretamente a fertilidade do touro por causar doença do trato reprodutivo ou
por se associarem aos espermatozoides, impedindo a fecundação (Givens & Marley,
2008). Em suínos, o aumento na concentração de E. coli em amostras de sêmen foi
associado com redução no tamanho da leitegada (Martín et al., 2010).
Como qualquer empresa comercial, um CCPS tem por objetivo a produção de um
número de amostras suficiente para abastecer o mercado, com máxima qualidade e
48
com custo mínimo de produção. Nos períodos avaliados, o número de ejaculados
rejeitados não diferiu, indicando que o sistema APPCC não interferiu nos parâmetros
inerentes ao touro, que podem ter sido influenciados pela época do ano, com um
grande número de rejeições de ejaculados devido ao estresse térmico. No entanto,
as modificações realizadas desde a coleta do ejaculado até seu envase e
congelamento, a partir da implantação do sistema APPCC, tiveram reflexo na
redução no número de partidas e doses rejeitadas. Considerando um custo de
produção de R$2,50 por dose, a redução de 10 pontos percentuais na rejeição de
doses representou uma redução nas perdas financeiras de R$ 107.387,50, nos
quatro meses avaliados. Se o CCPS vendesse cada dose rejeitada por R$20,00,
após a implantação do sistema APPCC o custo de oportunidade seria reduzido em
R$859.100,00, em comparação com o período anterior, o que indica que o
incremento na qualidade seminal e a redução no nível de contaminação das doses
se refletiu também em impacto econômico. Assim, medidas preventivas para
adequar o controle do processo, acompanhado por verificações periódicas e ações
corretivas são mais efetivas do que inspecionar defeitos de cada lote final do produto
(Ropkins & Beck, 2000). A indústria de pescado demonstrou uma diminuição
significativa nos custos totais de qualidade após a implantação do APPCC (Lupin,
Parin & Zugarramurdi, 2010), reforçando os benefícios advindos da implantação
desse sistema na indústria de sêmen bovino congelado.Portanto, o sistema APPCC
é uma ferramenta de gestão importante para os CCPS, bem como para os órgãos
fiscalizadores, que deve ser implementada com a maior brevidade possível.
49
5. Conclusão
A implantação do sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle no
Centro de Coleta e Processamento de Sêmen bovino identificou as etapas que
representam risco para as amostras de sêmen, padronizou o processo e permitiu o
estabelecimento de medidas de controle para os perigos identificados. Como
consequência, houve melhoria na qualidade seminal e redução na contaminação
microbiológica e na rejeição de doses, com impacto na redução dos custos de
produção da indústria.
Agradecimentos
À Capes pelo suporte financeiro ao primeiro autor e ao MAPA-CNPq pelo
financiamento do projeto.
50
5. Referências
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fiscalização obrigatórias do sêmen destinado à inseminação artificial em
animais domésticos, e dá outras providências. Ministério da Agricultura.
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6.446, de 05 de outubro de 1977, que dispõe sobre a inspeção e fiscalização
obrigatórias do sêmen destinado à inseminação artificial em animais
domésticos. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária.
BRASIL. Instrução Normativa SDA Nº. 48 de 17 de junho de 2003. Somente
poderá ser distribuído no Brasil o sêmen bovino ou bubalino coletado em
centros de coleta e processamento de sêmen - CCPS, registrados no
Ministério da agricultura pecuária e Abastecimento - MAPA, que cumprem os
requisitos sanitários mínimos para a produção e comercialização de sêmen
bovino e bubalino no país. Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento, Secretaria de Defesa Agropecuária.
BRASIL. Instrução Normativa Nº 2, de 14 de janeiro de 2004. Aprovar as
normas que dispõem sobre a fiscalização da produção, do comércio de
51
material genético de animais domésticos e da prestação de serviços na área
de reprodução animal. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento.
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ordenamento jurídico nacional os Requisitos Zoossanitários para Intercâmbio
entre os Estados Partes de Sêmen Bovino e Bubalino. Ministério da
Agricultura Pecuária e Abastecimento.
BRASIL. Instrução Normativa Nº 53, de 27 de setembro de 2006. Aprova o
Regulamento para registro e fiscalização de Centro de Coleta e
Processamento de Sêmem (CCPS) bovino, bubalino, caprino e ovino.
Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento.
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encaminhados pela Circular Nº 201/97 DCI/DIPOA e aplicação dos
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54
Tabela 1: Contagens microbianas médias (UFC/mL) nos diferentes pontos de coleta em um CCPS bovino, antes e após a
implantação do sistema APPCC*
Amostra n Pré-implantação n Pós-implantação
Vagina artificial 13 81,1 ± 19,5A 10 19,5 ± 19,5B
Sêmen puro 35 41,8 x 103 ±19,8 x 103A 21 9,8 x 103 ± 4,1 x 103B
Diluente P 10 115 ± 6 9 1,9 x 103 ± 8
Diluente A 10 56 ± 3 9 2,4 x 103 ± 1,0 x 103
Diluente B 10 78 ± 6 9 873 ± 6
Sêmen resfriado 35 240 ± 10A 21 1,5 x 103 ± 5B
Tubo flexível 21 2,5 x 106 ± 5,2 x 105A 15 0B
Sêmen envasado 35 1,2 x 106 ± 6,6 x 102 21 1,7 x 103 ± 4
55
Sêmen congelado 35 23,3 x 103 ± 4,1 x 103A 21 7,3 x 103 ± 3,5 x 103B
A,BMédias ± EPM com expoentes distintos indicam diferença significativa nas linhas (P < 0,05)
*Comparações feitas com dados transformados para a escala logaritimica
56
Tabela 2: Parâmetros de qualidade do sêmen bovino após o descongelamento,
antes e após a implantação do sistema APPCC*
Parâmetro (%) Pré-implantação Pós-implantação
Motilidade progressiva 33,7 ± 1,3A 57,7 ± 1,3B
Integridade da membrana 47,9 ± 1,6A 85,3 ± 1,4B
Integridade do acrossoma 61,4 ± 3,0A 81,6 ± 3,6B
n 35 21
A,BMédias ± EPM com expoentes distintos indicam diferença significativa nas linhas (P < 0,0001).
*Comparações através do teste de soma de rankings de Wilcoxon para dados não paramétricos
57
Tabela 3: Produção do Centro de Coleta e Processamento de Sêmen bovino,
durante o período de 4 meses antes e 4 meses após a implantação do sistema
APPCC
Produção Pré-implantação Pós-implantação
Ejaculados rejeitados 1.039/2.916 (35,0%) 731/2.117 (34,5%)
Partidas rejeitadas 209/1.197 (17,5%)A 46/944 (4,9%)B
Doses rejeitadas 70.429/407.766 (17,3%)A 27.474/ 378.520 (7,3%)B
A,BExpoentes distintos indicam diferença significativa nas linhas (P < 0,01)
58
3.3 Artigo 3
Artigo formatado de acordo com as normas da revista Molecular,
Reproduction and Development (ISSN: 1098-2795)
Bovine angiotensin-converting enzyme testis specific is neither required for
sperm capacitation nor released during this phenomenon
Karina L. Goularte1*, Rafael G. Mondadori1,2, Thomaz Lucia Jr. 1
and Jacob Thundathil3
1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2Instituto de Biologia
Universidade Federal de Pelotas, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil
3Department of Production Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine,
University of Calgary, Calgary, AB, Canada
*Corresponding author at: ReproPel, Faculdade de Veterinária, Universidade
Federal de Pelotas, Campus Capão do Leão, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil.
Tel./fax: (55) 53-32759161. E-mail address: [email protected]
59
Bovine angiotensin-converting enzyme testis specific is neither required for
sperm capacitation nor released during this phenomenon
Karina L. Goularte1*, Rafael G. Mondadori1,2, Thomaz Lucia Jr. 1
and Jacob Thundathil3
1ReproPEL, Faculdade de Veterinária, 2Instituto de Biologia
Universidade Federal de Pelotas, 96010-900, Pelotas-RS, Brazil
3Department of Production Animal Health, Faculty of Veterinary Medicine,
University of Calgary, Calgary, AB, Canada
SUMMARY
Germinal angiotensin converting enzyme (gACE) is expressed exclusively on haploid
germ cells in the testis and it is probably involved in fertilization. The objectives of this
study were: to investigate the requirement of testis specific isoform of ACE activity for
sperm movement; to examine the role of gACE in phosphorylation of bull sperm
proteins; and the shedding of gACE during capacitation. In the first experiment,
samples of fresh sperm from 3 bulls were incubated in: Sp-TALP (control); Sp-TALP
+ 100 µM ouabain (capacitation stimulator); Sp-TALP + 10 µM captopril (ACE
inhibitor); and Sp-TALP + 10 µM captopril + 100 µM ouabain (captopril added 30 min
before ouabain) for 4.5 h. The second experiment evaluated the need of gACE
activity for sperm tyrosine phosphorylation and its shedding during sperm incubation
in capacitation conditions. In the third experiment, cumulus-oocyte complexes
(COCs) were inseminated with sperm incubated with or without captopril. Blocking
gACE by captopril reduced total, progressive and linear sperm motility (P < 0.05).
The tyrosine phosphorylation pattern was not influenced by gACE inhibition and the
gACE content was not altered before and after capacitation, regardless of the
60
presence of captopril. Inhibition of gACE had no influence on cleavage and
blastocyst rates (P > 0.05). In conclusion, the present study suggests that gACE
activity may not be necessary for protein tyrosine phosphorylation, not involved in
capacitation of bull spermatozoa and not required for in vitro fertilization.
Keywords: sperm capacitation, ACE, bovine.
INTRODUCTION
Angiotensin converting enzyme (ACE; EC 3.4.15.1) is an ectoenzyme
anchored to the plasma membrane that catalyzes the conversion of angiotensin I to
the active octapeptide angiotensin II (Corvol et al., 1995). ACE exists in two isoforms:
somatic; and testicular (or germinal). Both such isoforms are transcribed from a
single gene at different initiation sites (Sibony et al., 1993). The somatic ACE (sACE)
isoform has molecular weight of 150-180 kDa (Sibony et al., 1993), is expressed in
somatic tissues and is widely distributed in Leydig cells, epididymis and prostate
(Nassis et al., 2001). On the other hand, the germinal form (gACE), with nearly 110
kDa, is expressed exclusively on haploid germ cells in the testis, being characterized
by a specie-specific N-terminal region sharing the same C-terminal region with
somatic ACE (Sibony et al., 1993; 1994).
Spermatozoa from homozygous mutant (stst) mice showed inability to migrate
into the oviduct and deficiencies in binding to the zona pellucida (ZP) (Hagaman et
al., 1998). More recently, it was hypothesized that, in mice, ACE may act shedding
GPI-anchored proteins from the sperm, contributing to spermatoza-ZP binding
(Kondoh et al., 2005) or that gACE acts by dicarboxypeptidase activity allowing
sperm-ZP binding (Fuchs et al., 2005). Nevertheless, the contribution of gACE for
fertilization in mice may follow a dual mode: as a dipeptidase in sperm modification in
61
the epididymis; and as a GPIase in binding of mature spermatozoa to ZP (Deguchi et
al., 2007), concluding that dideptidase activity of ACE indirectly supports its GPIase
activity by maintaining a suitable pH necessary to GPIase activity (Watanabe and
Kondoh, 2011). However, the role of gACE in bull sperm capacitation or during in
vitro fertilization is still unknown.
Captopril was the first ACE inhibitor approved for treatment of human
hypertension (Cushman and Ondetti, 1991). Captopril interacts directly with catalytic
Zn2+ ion deep inside the channel at the active site of gACE (Natesh et al., 2004). The
use of ACE inhibitor in fertilization studies is somewhat controversial and related to
specie-specific findings, since it does not impair in vitro fertilization and sperm ZP-
binding in ovine (Métayer et al., 2001), but reduces oocyte penetration in humans
(Foresta et al., 1991). To our knowledge, no information is available about gACE
involvement in in vitro or in vivo fertilization in bovine.
The fertilization-competent state of spermatozoa is achieved after
capacitation, a process derived from physiological and functional modifications that
occur either in vivo, in the female reproductive tract, or in vitro, under defined
conditions (Yanagimachi, 1994). The phosphorylation of sperm proteins is important
for capacitation, especially tyrosine, which may be the primary or even the exclusive
indicator of a signal transduction pathway at cell level (Naz and Rajesh, 2004). The
incubation of sperm with ouabain induced tyrosine phosphorylation and capacitation
in bovine sperm (Thundathil et al., 2006). Therefore, if gACE is involved in sperm
capacitation, when its activity is blocked, both the signal transduction pathway and
phosphorylation of sperm proteins will also be blocked.
The aims of the present study were: to investigate the requirement of testis
specific isoform of ACE activity for normal sperm movement; and to examine the role
62
of gACE in phosphorylation of bull sperm proteins and its shedding during
capacitation.
RESULTS
Experiment 1
Mean parameters of sperm motility after incubation for 4.5 h were: total = 75.9
± 12.7%; progressive = 70.9 ± 14.4%; hyperactive = 10.4 ± 7.9%; linear = 55.1 ±
12.2%; nonlinear = 0.6 ± 0.4%; and curvilinear = 2.2 ± 1.5%.
Blocking gACE by captopril (10 µM) reduced total, progressive and linear
sperm motility (P < 0.05). The presence of captopril and the capacitating agent
ouabain (100 µM) reduced (P < 0.05) progressive and linear motility, although those
agents had no effect on sperm motility when combined (Table 1). However, with
gACE inhibitor captopril and ouabain, total motility, progressive and linear motility
were similar to that of the control group (P > 0.05). Bull B presented lower linear
motility than the other tested bulls (P < 0.05), whereas both progressive and total
motility were greatest for bull C, intermediate for bull A and lowest for bull B (P <
0.05). No effects of the treatments were observed on non linear, curvilinear and
hyperactive sperm motility (P > 0.05).
Experiment 2
The incubation of bull sperm with ouabain and captopril was associated with
the tyrosine phosphorylation of a subset of proteins of Mr = 30 000 – 240 000, and
the tyrosine phosphorylation pattern was not influenced by gACE inhibition (Figure 1).
The gACE content was unaltered before and after capacitation, regardless of the
presence of the ACE inhibitor (Figure 2).
63
Experiment 3
The inhibition of gACE had no influence (P > 0.05) on either cleavage or
blastocyst rate (Table 2).
DISCUSSION
In the present study, incubation of bull sperm in medium containing captopril
impaired total progressive and linear motility. So, gACE or another component of the
renin angiotensin system (RAS) may be involved with sperm movement.
Nonetheless, captopril is a potent inhibitor of both the N and C domains of somatic
ACE and gACE (Natesh et al., 2004) and impairs both the conversion of angiotensin I
to angiotensin II and the kinin hydrolysis (Peng et al., 2005). Angiotensin II type 1
(AT1) receptors were found in the tails of rat, human and non-capacitated stallion
spermatozoa (Vinson et al., 1995; Sabeur et al., 2000) and over the entire head of
spermatozoa of bulls and stallions during capacitation (Gur et al., 1998; Sabeur et al.,
2000). Sperm motility would be inhibited by the specific AT1 inhibitor, DuP 753
(Vinson et al., 1995), indicating involvement of angiotensin II in sperm motility (Ball et
al., 2003). Therefore, the reduced motility observed for bull sperm incubated with
captopril may be attributed to shortage of angiotensin II, which would not be
converted from angiotensin I since gACE activity was blocked.
Ouabain was also associated with reduced progressive and linear motility, but
using a different route. Although ouabain does not affect the total bull sperm motility
(Thundathil et al., 2006; Newton et al., 2010), incubation with ouabain reduced
progressive motility, velocity average path and curvilinear velocity of spermatozoa in
a dose-dependent manner (Thundathil et al., 2006). This could be due to the fact that
ouabain binds to the Na+/K+ ATPase, inhibiting its activity (James et al., 1999) and
64
blocking the α1 and α4 isoforms present on spermatozoa (Wagoner et al., 2005). The
α4 isoform was found in the flagellum of spermatozoa of rats (Woo et al., 2000),
although in bulls, it was uniformly distributed over the head of uncapacitated
spermatozoa, but confined to the post-acrosomal region of capacitated spermatozoa
(Newton et al., 2010). The inhibition of the α4 isoform increases intracellular H+
concentrations, causing a pH decline of the sperm cytoplasm that results in the loss
of motility (Woo et al., 2000; 2002; Jimenez et al., 2010) and in a difficulty to control
Na+ and K+ gradients that are important for maintenance of the sperm membrane
potential in concert with K+ channels (Jimenez et al., 2010).
When gACE was blocked, the pattern of protein tyrosine phosphorylation was
similar to that observed with ouabain (positive control) and similar gACE content was
observed before and after capacitation, suggesting that gACE is not necessary for
protein tyrosine phosphorylation and is not released during sperm capacitation.
Inside the channel at the active site of gACE, captopril makes a direct interaction with
the catalytic Zn2+ ion deep, which is anchored solely at the central carbonyl group
and the proline carboxylate group, being positioned by two strong hydrogen bonds
from the two histidines (His 513 – His 353) (Natesh et al., 2004). Thus, the captopril-
gACE interaction may inhibit only the gACE activity, but not the tyrosine
phosphorylation. ACE is tyrosine phosphorylated at the ectodomain (Santhamma et
al., 2004) and also phosphorylated on a specific serine residue of the cytoplasmic
domain (Chattopadhyay et al., 2005). Protein tyrosine phosphorylation is related to
bovine sperm capacitation (Galantino-Homer et al., 2004) and considered as a
hallmark event of capacitation (Galantino-Homer et al., 1997), a maturational
processes leading to the development of the fertilization-competent state, either in
vivo or in vitro (Yanagimachi, 1994). The inhibition of gACE does not prevent bull
65
spermatozoa to phosphorylate its tyrosine residues, an important phenomenon
occurring during capacitation, which lead us to conclude that gACE activity is not
necessary for bull spermatozoa capacitation.
ACE bound to germ cell membranes was only found on testicular spermatozoa
of mice and rats (Métayer et al., 2002). On normal human spermatozoa, ACE was
present in cytoplasmic droplets and in the acrosome and on the plasma membrane of
the post-acrosomal region, the neck and midpiece, but widely distributed on defective
cells (Köhn et al., 1998b; Nikolaeva et al., 2006). In ejaculated bull spermatozoa, it
was present over the entire acrosome (Costa and Thundathil, 2012). The release of
ACE may happen in vivo, in a soluble active form, as sperm pass through the
proximal caput of the epididymis (Gatti et al., 1999; Métayer et al., 2002). In contrast,
gACE can be released during capacitation (Köhn et al., 1995; 1998a) or at a specific
stage of spermatozoa maturation, appearing in the seminal fluid (Balyasnikova, et al.,
2005). In the present study, gACE content in fresh spermatozoa and after incubation
with or without inhibitor was similar, with no release during capacitation, which
perhaps occurred after capacitation or during acrosome reaction. Ectodomain
shedding is a universal phenomenon that affects a wide range of ectoproteins, such
as enzymes, receptors and cell adhesion molecules (Balyasnikova, et al., 2005).
Sheddase binds to a “recognition domain” in the target protein before cleaving the
stalk, shedding of gACE is much more efficient than somatic ACE (Ehlers et al.,
2012), likely because gACE is smaller, less complex and more easily shed to the
plasma membrane. ACE secretion is enhanced by tyrosine phosphorylation, which
presumably takes place in the endoplasmic reticulum and is promoted by the action
of the p38 MAP kinase pathway (Santhamma et al., 2004). As gACE content was not
released during sperm capacitation and tyrosine phosphorylation pattern was not
66
influenced by incubation of bull sperm with captopril, we conclude that gACE is not
involved in capacitation, at least on in vitro conditions.
As the inactivation of gACE by captopril did not prevent IVF, cleavage and
blastocyst rates were similar for oocytes inseminated with or without incubation with
captopril. Thus, gACE is apparently not involved in spermatozoa-oocyte recognition.
As the absence of gACE is detrimental for spermatozoa transport in the oviducts and
binding to ZP, it plays a relevant role in the fertilization process (Hagaman et al.,
1998; Ramaraj et al., 1998), which may occur through two modes: GPIase activity for
spermatozoa egg-binding ability (Kondoh et al., 2005); and dicarboxypeptidase
activity, (Fuchs et al., 2005). However, gACE may act as a dipeptidase in sperm
modification in the epididymis and as a GPIase in binding of mature spermatozoa to
ZP, contributing for fertilization in a dual mode (Deguchi et al., 2007). However, the
gACE inhibition by captopril did not impair IVF (Métayer et al., 2001; 2002) and
sperm binding to the ZP (Köhn et al., 1998a), contradicting reports of reduced oocyte
penetration rate after gACE inhibition (Foresta et al., 1991). Additionally, gACE
showed no involvement in human fertilization, especially in ZP binding (Mustapha et
al., 2013). The lack of effect of captopril in IVF, also reported elsewhere (Métayer et
al., 2001; 2002; Mustapha et al., 2013), may be due to its relevant antioxidant role in
vitro (Benzie and Tomlinson, 1998), protecting endothelium against injuries from free
radicals and scavenging superoxide anions (Kim et al., 2013).
In summary, the gACE inhibition by captopril was associated with reduced
total, progressive and linear bull sperm motility. However, as gACE activity is not
necessary for protein tyrosine phosphorylation, gACE may not be involved in
capacitation of bull spermatozoa and not required for in vitro fertilization.
67
MATERIALS AND METHODS
Reagents and Media
Glycine, Tris, NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, bromophenol blue, methanol, and
Tween-20 were purchased from Fisher Scientific (Edmonton, AB, Canada);
Ammonium persulfate, 10× Tris/Glycine/SDS Buffer, 30% Acrylamide/Bis Solution
and gel electrophoresis apparatus were purchased from Bio-Rad (Mississauga, ON,
Canada). The Kodak scientific imaging film was purchased from Mandel Scientific
(Guelph, ON, Canada). The remaining chemicals were purchased from Sigma Aldrich
(Oakville, ON, Canada), unless stated otherwise.
Experiment 1: Effect of inhibition of gACE on sperm motility
Ejaculates were collected from three mature Holstein bulls from an artificial
insemination center (Alta Genetics, Calgary, AB, Canada). Semen samples were
immediately diluted 1:4 with Sp-TALPH (Galantino-Homer et al., 1997) and
centrifuged at 1,400 rpm x 12 min, to remove the seminal plasma. Samples were
washed twice more with Sp-TALPH discarding the supernatant. The sperm pellet was
resuspended in 1 ml of Sp-TALPH and transported to the laboratory within 30 min, in
thermic containers at 20 oC. Only samples with at least 70% motility were further
processed. Sperm concentration in the resulting pellet was determined using a
hemocytometer and adjusted to 100 x 106/ml with Sp-TALP.
Sperm pellets were split into a series of 1.5 ml microtubes. Samples with 25 x
106 spermatozoa/ml were incubated in water bath at 39oC (5% CO2 and high
humidity) with: Sp-TALP (control); Sp-TALP + 100 µM ouabain (capacitation
stimulator); Sp-TALP + 10 µM captopril (ACE inhibitor); and Sp-TALP + 10 µM
captopril + 100 µM ouabain (captopril added 30 min before ouabain) for 4.5 h.
68
At 0 and 4.5 h of incubation, 4 µl of the sperm preparation were drawn from
each group and parameters of sperm motility were recorded by computer assisted
semen analysis (CASA), using the Sperm Vision® software (Minitube).
As four repeats were conducted across treatments, a total of 150 sperm
samples were evaluated. Among those, 75 were from bull A, 35 were from bull B, and
40 were from bull C.
Experiment 2: Effect of inhibition of gACE on tyrosine phosphorylation and
gACE content
Sperm samples were processed as described in experiment 1, except for the
group including only captopril. The tyrosine phosphorylation and the gACE content
were measured as described elsewhere (Thundathil et al., 2006) with the following
modifications. Sperm were washed in 1 ml of TALPH including phosphatase
inhibitors (1 mM sodium vanadate; 1 mM glycerophosphate; and 1 mM sodium
fluoride) and then centrifuged at 10,000 x G, for 5 min at room temperature. The
supernatant was discharged and the pellet was re-suspended in 50 µl of Sp-TALP
containing inhibitors and 12.5 µl of 5X sample buffer (containing dithiothreitol, SDS
and inhibitors – 1 mM). The preparation was mixed and boiled for 5 min at 100oC,
then centrifuged at 10,000 x g, for 5 min, at room temperature. The supernatants
were used for SDS-PAGE and immunoblotting. Samples were subject to
electrophoresis in duplicate: one gel for tyrosine phosphorylation; and the other for
the gACE content.
For SDS-PAGE and immunoblotting, sperm extracts prepared as described
above were subject to electrophoresis on 10% polyacrylamide gels at 100 V, until the
running front reached the bottom of the gel. The gels were equilibrated in transfer
69
buffer (tris-glycine pH 8.5, containing 20% methanol) for 30 min and
electrotransferred to nitrocellulose membrane (Bio TraceTM NT), using the same
buffer. Blots were rinsed in distilled water and Ponceau stained (Galantino-Homer et
al., 1997) to ascertain that the transfer worked. After a quick wash with distilled water,
the membranes were incubated with a solution of skim milk (5%, w/v) in Tris (20mM,
pH 7.8)-buffered saline containing Tween 20 (TTBS; 0,1% v/v, 1h), washed with
TTBS and then treated with a monoclonal antibody developed in mouse against
phosphotyrosine proteins (clone 4G10, Millipore®, which recognizes tyrosine-
phosphorylated proteins from all species) (1:10,000 in TTBS) or with a monoclonal
antibody (clone 3C5, MAB5228, Abnova®, which react with bovine ACE) developed
in mouse against angiotensin converting enzyme (1:3,000 in TTBS) overnight at 4◦C.
After washing with TTBS three times during 10 min (anti-angiotensin converting
enzyme or 5 X for 10 min – anti-phosphotyrosine), membranes were incubated with
goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (secondary antibody
purchased from Upstate Technologies®, Temecula, CA) (1:5000 in TTBS) for 1 h, at
room temperature, and then washed again with TTBS. Immunoreactive bands were
detected using enhanced chemiluminescence system. Membranes were reprobed
with anti-B-tubulin antibody (Sigma®) (1:10,000) as loading control.
Experiment 3: Effect of inhibition of gACE on in vitro fertilization
Ovaries obtained from a slaughterhouse, after transported to laboratory within
2 hours, were washed with warmed saline and kept in a beaker containing saline in
water bath at 35◦C until oocyte aspiration. Follicles from 3 to 9-10 mm were aspirated
with a vacuum system. The follicular content was kept in the aspiration tube for 15
minutes to decant. Thereafter, the supernatant was discharged. The cumulus-oocyte
70
complexes (COC) were recovered under stereomicroscope, in a petri dish, and
transferred to a 200 µl of flushing media (tissue culture medium 199 -TCM with
Hepes plus 1 mg/ml gentamicin, and 3 mg/ml BSA), maintained on heated plate at
39◦C. The selected COCs were transferred to a maturation medium drop (TCM-199
containing 25 mM sodium pyruvate, 1 mg/ml gentamicin, 0.5 mg/ml FSH, 5 mg/ml
LH, 2 mg/ml estradiol-17b, and 10% fetal calf serum) in a small petri dish to remove
flushing media. Afterwards, the COCs were transferred to a multiwell dish (20 COCs
per 500 µl/well), under mineral oil to mature for 24 h.
Straws containing frozen sperm from 5 bulls with known fertility were thawed in
a water bath for 30 s at 37°C. Sperm were washed twice by centrifugation (500 x g
for 5 min) and the pellet re-suspended in 200 µl of fertilization medium. The final
sperm pellet was then overlaid with 100 μL of fertilization medium in two treatments:
one including 10 µM of captopril and incubated at 39°C and 5% CO2 for 30 min with
lid open (n = 365 oocytes); and a control treatment with no captopril (n = 386
oocytes). Both treatments had heparin for sperm capacitation.
Then, the upper two-thirds of the medium, which contained actively motile
sperm (1 x 106 sperm/mL), were used for inseminating matured COC in 20 μL drop of
fertilization medium containing 10 bovine oocytes. After 18 h, the presumptive
zygotes were denuded of their cumulus cells by vortexing and cultured for 8 d in 40
μL drops (20 presumptive zygotes per drop) of synthetic oviduct fluid (SOF; 107.7
mM NaCl, 7.16 mM KCl, 1.19 mM KH2PO4, 25.06 mM NaHCO3, 0.3 mM sodium
pyruvate, 2.5 mM sodium lactate 60% syrup, 1 mM glutamine, 8 mg/mL bovine
serum albumin, 1 X BME essential amino acids, and 1X MEM non-essential amino-
acids). Cleavage was evaluated 48 h after fertilization and embryo development was
recorded every 48 h.
71
Statistical analyses
In Experiment 1, parameters of sperm motility were compared across distinct
treatments using analysis of variance, including the effects of the bulls and potential
interaction, with comparisons of means conducted with the Tukey’s test. In
Experiment 3, the average rates of cleavage and embryo development to the
blastocyst stage were compared between treatments using a two-sample t test. All
analyses were conducted with Statistix® (2008).
Acknowledgements
To CAPES foundation, for the financial support of the first author, and to professor
Jacob Thundathil from University of Calgary-Canada for the opportunity of having an
exchange programme with him and his university doing my PhD.
72
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78
Table 1: Total, progressive and linear motility of bull spermatozoa after incubation for
4.5 h (n = 150 sperm samples)
Treatments* Sperm motility
Total (%) Progressive (%) Linear (%)
Control 77.7 ± 1.5A 73.8 ± 1.7A 59.5 ± 1.7A
Ouabain 73.2 ± 1.5AB 67.4 ± 1.7BC 51.5 ± 1.7BC
Captopril 67.5 ± 1.8B 61.4 ± 2.0C 45.5 ± 2.0C
Captopril +
ouabain
77.1 ± 1.5A 72.3 ± 1.7AB 55.5 ± 1.7AB
A,B,CMeans ± SEM with distinct superscripts indicate significant differences in the
columns (P < 0.05).
*Control – Sp-TALP;
Ouabain – Sp-TALP + 100 µM ouabain;
Captopril – Sp-TALP + 10 µM;
Captopril + ouabain – Sp-TALP + 100 µM ouabain + 10 µM captopril added 30 min
before ouabain
79
Table 2: Rates of cleavage and embryo development to the blastocyst stage after in
vitro fertilization using bull sperm with or without (Control) captopril prior to exposition
to cumulus-oocyte complex.
Treatment* Oocytes (n) Cleavage (%) Blastocysts (%)
Control 365 75.2 ± 3.2 37.1 ± 4.5
Captopril 386 67.3 ± 5.0 28.5 ± 3.3
Mean rates ± SEM in 18 routines did not differ (P > 0.05).
*Control: sperm incubated with fertilization medium
Captopril: sperm incubated with fertilization medium + 10 µM captopril
80
Figure 1: Tyrosine phosphorylation before (1) and after incubation for 4.5 h in Sp-
TALP (2), 100 µM of ouabain (3) or 100 µM of ouabain + 10 µM of captopril (4). PL =
protein marker ladder - kDa.
PL 1 2 3 4
ß-tubulin ~ 50 kDa
81
Figure 2: Germinal ACE content before (1) and after incubation for 4.5 h in Sp-TALP
(2), 100 µM of ouabain (3) or 100 µM of ouabain + 10 µM of captopril (4). PL =
protein marker ladder - kDa.
PL 1 2 3 4
ß –tubulin ~ 50 kDa
82
4 CONCLUSÃO GERAL
Os benefícios obtidos com a implantação do Sistema APPCC em uma
indústria, por si só justificam sua utilização. Para CCPS bovino esse é o primeiro
modelo elaborado e aplicado, sendo inegáveis os proveitos obtidos. Com a utilização
do sistema houve melhoria na qualidade seminal e redução na contaminação
microbiológica e na rejeição de doses, com impacto na redução dos custos de
produção da indústria. Assim, além de padronizar o processo incrementando a
qualidade do produto oferecido, o sistema permite, através de uma manipulação
correta de produtos e equipamentos, treinamento dos colaboradores com
padronização das tarefas realizadas e identificação das etapas potencialmente
danosas para a qualidade do produto, manter todos os perigos sob controle através
da aplicação de medidas preventivas, diminuindo com isso o custo final devido à
redução na rejeição de doses. Portanto, a implantação do sistema nos centros de
coleta e processamento de sêmen bovino traz benefícios não somente para o
produtor que adquire um produto com qualidade certificada, mas também para a
indústria, que pode reduzir suas perdas com rejeições de doses e para o MAPA na
realização de auditorias, confirmando assim, a hipótese do presente trabalho.
Porém, o estudo realizado com a ECA teve sua hipótese negada. Após o
bloqueio de sua atividade, o padrão de fosforilação da tirosina e as taxas de
clivagem e blastocisto foram similares ao grupo controle, sugerindo-se assim, que a
enzima conversora da angiotensina não é necessária para o processo de
capacitação e não está envolvida no processo de fertilização em bovinos, ao menos
in vitro.
83
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86
6 ANEXO
87
88
7 APÊNDICE
Manual de Boas Práticas de Processamento (BPP) e Procedimentos
Padrão de Higiene Operacional (PPHO), bem como os Procedimentos
Operacionais Padronizados (POPs) elaborados e implantados no Centro de
Coleta e Processamento de sêmen bovino onde o estudo foi realizado.
Revisado por: Data:____/____/2012
Karina Lemos Goularte
Revisado por: Data:____/____/2012
Sumário
Manual de Boas Práticas de Processamento (BPP)
Etapa 1 – Identificação da empresa...................................... 04 Etapa 2 – Recursos Humanos............................................... 05
Etapa 3 – Instalações, edificações e saneamento.................... 10 Etapa 4 – Equipamentos...................................................... 15
Etapa 5 – Sanitização.......................................................... 21
Etapa 6 – Produção............................................................. 22 Etapa 7 – Embalagem e rotulagem....................................... 27
Etapa 8 – Controle de qualidade........................................... 29 Procedimentos Padrão de Higiene Operacional (PPHO)
PPHO 1 – Potabilidade da água............................................. 38 PPHO 2 – Higiene das instalações, equipamentos e utensílios... 40
PPHO 3 – Prevenção da contaminação cruzada....................... 52 PPHO 4 – Higiene pessoal dos colaboradores.......................... 55
PPHO 5 – Proteção contra contaminação do produto................ 59 PPHO 6 – Agentes tóxicos.................................................... 62
PPHO 7 – Saúde dos colaboradores....................................... 64 PPHO 8 – Controle integrado de pragas................................. 67
Procedimento Operacional Padronizado (POP) Autoclave........................................................................... 82
Balança analítica de precisão................................................ 84
Balança eletrônica............................................................... 86 Balança para pesagem do sêmen.......................................... 88
Balcão refrigerado............................................................... 90 Banho-maria...................................................................... 92
Coleta de sêmen................................................................. 94 Container de nitrogênio líquido da máquina de congelamento de
sêmen...........................................................................
97
Controle de pulverização para controle para controle de moscas 99
Deionizador de água............................................................ 100 Destilador de água.............................................................. 103
Diluidor automático de sêmen............................................... 105 Envase e identificação......................................................... 108
Estufa de aquecimento das vaginas artificiais.......................... 111 Estufa de aquecimento de material........................................ 113
Estufa de secagem de material............................................. 115
Estufa de secagem e esterilização......................................... 117 Fotômetro........................................................................... 119
Máquina de congelamento.................................................... 121
Revisado por: Data:____/____/2012
Lista de figuras
Figura 1: Organograma das instalações do CCPS.................... 11
Figura 2: Imagem aérea do CCPS......................................... 12
Lista de Quadros
Quadro 1: Limpeza de equipamentos.................................... 42
Quadro 2: Limpeza de utensílios........................................... 44
Quadro 3: Limpeza de instalações......................................... 45
Anexos
Anexo 1: Atestado de saúde ocupacional............................... 31
Anexo 2: Responsáveis pela CIPA......................................... 32
Anexo 3: Laudo do controle de pragas................................... 33
Anexo 4: Fórmula do diluente.............................................. 36
Anexo 5: Laudo de higienização das caixas d’água.................. 72
Anexo 6: Laudo de avaliação físico-química e bacteriológica da
água.................................................................................
74
Anexo 7: Check list para realização de auditoria de interna...... 75
Anexo 8: Cartaz indicando como lavar as mãos...................... 80
Revisado por: Data:____/____/2012
Manual de BPP
Etapa 1 – Identificação da empresa
Cód: 01
Seção: 1
Revisão: 10/08/2012
Página: 04
1. IDENTIFICAÇÃO DA EMPRESA
1.1 Razão Social
ABS Pecplan – American Breeders Services Planejamento Pecuário
1.2 Endereço
Rodovia BR 050, Km 196
Delta, Minas Gerais
CEP: 38108-000
1.3 Responsável Técnico
Fernando Vilela Vieira
CRMV-MG: 3466
1.4 Autorização de Funcionamento
O Centro de Coleta e Processamento de Sêmen bovino (CCPS) ABS -
Pecplan está registrado no Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento (MAPA) sob o número MG05197-7.
Horário de Funcionamento
Área administrativa: das 8:30 às 17:30 horas;
Área de Produção: das 7:00 às 16:00 horas.
1.5 Produto final processado e forma de comercialização
Sêmen bovino processado e congelado em palhetas de 0,5 mL armazenadas
em nitrogênio líquido.
Revisado por: Data:____/____/2012
2. RECURSOS HUMANOS
2.1 Procedimento na admissão dos colaboradores
Os colaboradores admitidos em sua grande maioria são provenientes
de outras centrais ou tem experiência no trabalho com bovinos, sendo
selecionados em caso de demanda da empresa.
Para sua inserção na rotina de trabalho o novo colaborador passa por
uma semana de treinamento sob orientação do Médico veterinário,
acompanhando as atividades dos funcionários do setor de sua alocação.
Durante este período são repassadas todas as informações referentes ao
uso de equipamento de proteção individual (EPI), as normas internas e a
padronização das tarefas através da utilização dos procedimentos
operacionais padronizados (POPs) e do manual de boas práticas de
processamento (BPP).
2.2 Treinamento e orientação dos colaboradores
Em virtude da característica de sua atividade a empresa dispõe de
instalações adequadas como vestiários e sanitários feminino e masculino
para garantir adequadas condições de higiene e saúde dos colaboradores. O
detalhamento das condições e controle dessas instalações está descrito no
PPHO 4.
Colaboradores da área laboratorial: Neste setor o treinamento se dá
por acompanhamento e realização dos procedimentos efetuados pelos
responsáveis de cada setor. O colaborador é orientado a seguir os
procedimentos padrão de higiene operacional (PPHO 4), de acordo com
cartazes fixados no local de trabalho.
Manual de BPP
Etapa 2 – Recursos Humanos
Cód: 02
Seção: 2
Revisão: 10/08/2012
Página: 05
Revisado por: Data:____/____/2012
Orientações principais:
- Uso do EPI (jaleco azul e sapato branco) exclusivamente dentro do
laboratório.
- Fazer a higienização das mãos antes, durante e após a rotina de trabalho.
- Não se alimentar e usar equipamentos para acondicionar alimentos, não
usar adornos e espirrar ou tossir sobre o produto ou equipamentos para
evitar contaminações.
Colaboradores da área externa: Como área externa entende-se os
setores de quarentenário (unidade I) e de manejo geral dos touros. Nestes
setores o treinamento se dá por acompanhamento e realização dos
procedimentos efetuados pelos demais colaboradores de cada setor sob
orientação do Médico Veterinário. O colaborador é orientado a seguir os
procedimentos padrão de higiene operacional (PPHO 4), de acordo com
cartazes fixados no local de trabalho.
Orientações principais:
- Uso do EPI (calça, camisa, botas com ponteira de aço e luvas descartáveis
durante o trabalho no quarentenário e no momento da coleta do ejaculado).
- Atenção a atitudes que possam reduzir a qualidade do sêmen como: tossir
e/ou espirrar sobre os produtos e equipamentos; expor o ejaculado a
luz solar direta.
- Não fumar, não se alimentar e não utilizar adornos que possam
apresentar risco dentro da rotina de trabalho.
- Não utilizar a geladeira da sala de apoio para armazenar materiais que
não os da rotina.
- Higienizar as mãos sempre que utilizar o sanitário ou executar uma tarefa
contaminada (levar ou trazer um touro do piquete, manipular cabrestos de
touros ou manequins) ou sempre que julgar necessário de acordo com a
sistemática descrita no PPHO 3 e no PPHO 4.
Revisado por: Data:____/____/2012
2.3 Procedimento para avaliação médica
O controle da condição de saúde clínico dos colaboradores é realizado
através de um convênio com empresa especializada contratada.
São realizados exames admissionais, periódicos e demissionais em todos os
colaboradores da área de produção:
Admissional: avaliação clínica;
Periódico: realizado anualmente
Colaboradores da área externa: avaliação clínica, audiometria, colinesterase
plasmática e colinesterase eritrocitária. Para os operadores de máquinas é
realizado também o exame de acuidade visual.
Colaboradores da área interna: avaliação clínica, audiometria, colinesterase
plasmática e colinesterase eritrocitária.
Demissional: avaliação clínica e os demais exames solicitados para
colaboradores das áreas externa ou interna, conforme a área específica de
trabalho de cada um.
No Anexo 1 está o modelo do laudo emitido pela empresa,
considerando o colaborador apto ou não para a função.
Os colaboradores, quando acometidos por qualquer alteração na
condição de saúde são afastados conforme a prescrição médica, havendo
para isso a necessidade de comprovação através de um atestado médico
com a respectiva indicação da doença.
A sistemática especificando o controle deste requisito está descrita no PPHO
7.
2.4 Fornecimento e uso de uniformes
Na admissão os colaboradores recebem dois conjuntos de uniformes,
sendo calça e camisa de cor bege para os da área externa e jaleco azul e
sapato branco para os da área interna. A medida que houver desgaste os
uniformes serão repostos pela empresa.
Revisado por: Data:____/____/2012
Cada colaborador é responsável pela conservação e lavagem do
uniforme seguindo as normas do PPHO 4. A troca por uniforme limpo deve
ser diária e semanal para os colaboradores da área externa e interna,
respectivamente.
2.5 Procedimento para capacitação dos funcionários
As reciclagens ocorrem anualmente abordando as tarefas realizadas
rotineiramente, ressaltando sua importância para a obtenção de um produto
de qualidade com total segurança dos colaboradores. São realizadas
também, palestras semestralmente sobre assuntos diversos como a
importância da quarentena, zoonoses e pontos que podem afetar a
qualidade do produto final. A comprovação da realização das palestras
ficará arquivada junto aos registros de realização das tarefas (POP) para
controle futuro.
2.6 Procedimento em relação à segurança do trabalho
A prevenção de acidentes é executada pela Comissão Interna de
Prevenção de Acidentes (CIPA). Esta comissão reune-se uma vez por mês
para discutir assuntos relacionados a rotina de trabalho. Semestralmente
são realizadas palestras ressaltando a importância e orientando quanto ao
uso dos EPIs e da atenção no momento de manejar os touros e trabalhar
com as máquinas agrícolas. A comprovação da realização das reuniões da
CIPA ficará arquivada junto aos registros de realização das tarefas (POP)
para controle futuro. Os responsáveis pela CIPA com seus respectivos
cargos apresentam-se no Anexo 2.
Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Cada colaborador da área externa recebe junto com os uniformes na
admissão: um par de botas de borracha, um par de botinas com ponteira de
aço, um par de botinas de couro, um par de caneleiras, um protetor
Revisado por: Data:____/____/2012
auricular e um par de óculos de proteção. Conforme a necessidade esses
equipamentos são repostos.
Os colaboradores que realizam a aplicação de herbicida, ou qualquer
outro produto químico que possa trazer riscos à saúde do manipulador
utilizam máscaras, macacão especial e botas.
Revisado por: Data:____/____/2012
Manual de BPP
Etapa 3 – Instalações, Edificações e
Saneamento
Cód: 03
Seção: 1
Revisão: 10/08/2012
Página: 10
3. Instalações, Edificações e Saneamento
A empresa possui área total de 250 hectares destinados a abrigar
touros de diversas raças, laboratórios e escritórios.
As instalações como alojamento dos animais, laboratório e
quarentenário estão cercadas por tela com dois metros de altura e cerca
perimetral com no mínimo 25 m de distância garantindo isolamento dos
criatórios vizinhos e da rodovia.
O CCPS está instalado em área drenada e em perfeitas
condições para manter a saúde e o bem-estar dos animais alojados e
a boa qualidade do produto, possuindo entradas e saídas controladas,
com rodolúvio automático para desinfecção de veículos que entram
na área isolada.
As instalações identificadas nas figuras 1 e 2 constam de: unidade
laboratorial; unidade de coleta de sêmen; unidade de apoio (constituída por
sala de preparação de material de coleta, laboratório de apoio sanitário,
escritório veterinário e vestiário masculino); unidade de alojamento do
rebanho residente; unidade de quarentena; oficinas, depósitos de ração e
feno; unidade administrativa; unidade comercial e de estocagem de sêmen,
residências dos funcionários.
Revisado por: Data:____/____/2012
Figura 1: Organograma das instalações do CCPS.
QUARENTENÁRIO (1)
28 dias para exames sanitários
TRONCO DE CONTENÇÃO (10)
Lavagem prepúcio
ÁREA COBERTA DE COLETA (11)
Coleta dos touros europeus
ÁREA EXTERNA DE COLETA (10)
Coleta touros zebuínos
UNIDADE LABORATÓRIAL (12)
Avaliações e congelamento do sêmen
BLOCO DE APOIO (12)
Sala do veterinário
Sala de preparação vaginas artificiais
Sala de apoio sanitário
Vestiário masculino
REBANHO RESIDENTE (2)
117 piquetes
ENFERMARIA (3)
Possui 6 baias para
touros em tratamento veterinário
UNIDADE DE CASQUEAMENTO
PEDILÚVIO E PESAGEM DOS TOUROS (5)
OFICINA (4)
Armazenamento e manutenção dos equipamentos
CAPINEIRAS (6) UNIDADE ADMINISTRATIVA (7)
ESTOQUE
REFEITÓRIO (8) CASAS DOS FUNCIONÁRIOS (9)
Revisado por: Data:____/____/2012
Figura 2: Imagem aérea do CCPS. Os números identificam as unidades
citadas na figura 1.
3.1 Tipo de construção
Todos os prédios que fazem parte da empresa são de alvenaria,
incluindo os abrigos dos piquetes dos touros.
As condições das instalações prediais (conservação de portas,
janelas, telas, estruturas e revestimentos das paredes, estrutura das casas
dos touros bem como dos bebedouros e comedouros) são verificadas
mensalmente pelo funcionário responsável pela manutenção.
3.2 Abastecimento de água
A água utilizada no CCPS é proveniente de poço artesiano,
abastecendo as caixas d’água de cada setor (quarentenário, laboratório e
área administrativa). A água para limpeza geral e banho dos touros é em
01
02
03
04
05
06
07 09
10
11 12
07
08
Revisado por: Data:____/____/2012
parte captada da chuva ou de represa própria, ficando armazenada em duas
caixas d’água auxiliares (no quarentenário e próximo a área coberta de
coleta). O controle de qualidade da água utilizada na empresa é descrita no
PPHO 1.
3.3 Sistema de esgotos
As águas servidas do laboratório, banheiros sanitários e provenientes
da limpeza em geral são captadas para fossas sépticas distantes dos pontos
de captação. Quando cheias, as fossas são esvaziadas desprezando-se o
conteúdo no depósito para lixo.
A água utilizada na lavagem dos touros e na área do tronco de
contenção é armazenada em fossa de decantação. Desta fossa é feito o
bombeamento da fração líquida para as capineiras.
3.4 Lixo e dejetos
O material com risco biológico (laboratório e área externa) é
armazenado em recipientes plásticos específicos ou caixas de descarte de
material perfuro cortante que são recolhidos mensalmente por empresa
terceirizada.
O lixo comum é descartado em lixeiras com tampa dispostas em
vários locais da empresa. O recolhimento destes resíduos é feito em carreta
tracionada por trator da ABS três vezes por semana seguindo o fluxo: das
lixeiras da área de produção, refeitório, logística e administração e
residências dos funcionários até o depósito de lixo. Duas vezes por semana
esses resíduos são recolhidos por um caminhão da prefeitura do município.
As embalagens de produtos agrícolas são devolvidas aos
fornecedores, conforme legislação em vigor.
Os dejetos animais (esterco e camas) coletados nos abrigos dos
touros, locais de coleta e quarentenário são armazenados em composteiras
para fermentação e posterior uso como adubo orgânico nas capineiras.
Revisado por: Data:____/____/2012
Higienização das Lixeiras
Uma vez a cada quinze dias, ou mais frequentemente se necessário,
as lixeiras são lavadas com água, detergente neutro e escova. As lixeiras da
área interna são ainda desinfetadas com álcool 70%.
Revisado por: Data:____/____/2012
Manual de BPP
Etapa 4 – Equipamentos
Cód: 04
Seção: 1
Revisão: 10/08/2012
Página: 15
4. Equipamentos
4.1 Equipamentos existentes e suas especificações
Sala 1
- Sistema de filtração de água
- Destilador de Água
Modelo 724 FANEM LTDA®
São Paulo – Brasil
- Deionizador de água
PURITECH PT 0020
- Autoclave Vertical modelo 415
FANEM LTDA® São Paulo – Brasil
- Osmômetro eletrônico digital 3122
LAKTRON
- Máquina seladora
Imap – Ribeirão Preto – SP
Série 72
- Balança Analítica de Precisão
GEHAKA BK 500
Revisado por: Data:____/____/2012
Sala 2
- Estufa de cultivo modelo 002 CB
FANEM LTDA® - São Paulo – Brasil
- Máquina de Análise Computadorizada de Sêmen
Programa Casa – IMV®
Hamilton Thorne Ivos
- Bloco térmico BT 02
KACIL Indústria e Comércio Ltda
- Agitador Biomixer
QL 901
- Descongelador eletrônico de sêmen
FERTILIZE LTDA 220 V
Belo Horizonte – MG
- Placa aquecedora
NEOVET
- Centrífuga
FANEM® - São Paulo
- Centrífuga
Damon / IEG Division
- Geladeira
Brastemp®
- Armário ultra-violeta
Esterilização dos ovos
Revisado por: Data:____/____/2012
Sala 3
- Estufa de secagem e esterilização
Modelo 315 SE FANEM®-SP
- Estufa retilínea
FANEM® LTDA-SP
Sala 4
- Estufa retilínea
FANEM®- LTDA SP
- Balança eletrônica
Bioprecisa JA3003N B345
- Bloco térmico
Kacil Indústria e Comércio Ltda
- Pipeta eletrônica
Rainin®
- Fotômetro
IMV® Technologies
Bovine protometer n° 694
- Diluidor de sêmen
Equilab® Microlab 530B diluter
Siemens distribuidor CA 810
- Computador
Dell®
Revisado por: Data:____/____/2012
Quantidade: 2
- Banho Maria: Modelo 102
FANEM® LTDA-SP
- Placa aquecedora
Eletrovet®
- Microscópio óptico
Nikon® Labophot
- Maquina de envase de sêmen
IMV Technologies®
- Máquina identificadora de palhetas
IMAJE 7S
Impressora INK JET
- Botijões de nitrogênio líquido
MVE Cryogenios
- Máquina de congelamento
Digitcool 5300 3T
Computador acoplado
- Reservatório para nitrogênio líquido
- Split
Split totaline
Quantidade: 2
- Microscópio óptico
Olympus® Modelo BH
Revisado por: Data:____/____/2012
- Balcão Refrigerado
- Microscópio Óptico
Zeiss®
4.2 Programa de manutenção preventiva e calibração dos
equipamentos
A descrição da operação a ser realizada quando o equipamento for
utilizado está escrita no procedimento operacional padronizado (POP),
específico de cada equipamento.
O programa de manutenção preventiva e calibração dos equipamentos
é executado pelo funcionário responsável pelo equipamento, conforme
descrito no POP, ou por empresa responsável como no caso da balança de
precisão, por exemplo.
Estufas (n=6), balcão refrigerado e bloco térmico: A manutenção
preventiva e a calibração das estufas, do balcão refrigerado e do bloco
térmico são realizadas pelo acompanhamento de suas temperaturas através
da utilização de um termômetro para cada equipamento. No balcão
refrigerado deve ser utilizado termômetro de máxima e mínima mantendo o
sensor imerso em água a fim de evitar flutuações bruscas de medição.
Havendo a impossibilidade da correção de desvios na temperatura de
qualquer equipamento a assistência técnica deve ser acionada.
Balanças de precisão (n=2): o perfeito funcionamento das balanças
depende de sua correta utilização: (1) nivelando e não movimentando o
equipamento; (2) limpando delicadamente após o uso utilizando pincel de
cerdas macias; (3) removendo a base de pesagem para completa limpeza.
A verificação da calibração deve ser realizada semanalmente utilizando-se o
peso padrão. Caso alguma das balanças apresente alteração em relação ao
padrão, a assistência técnica deve ser acionada.
Pipetador de volume ajustável: o pipetador deve ser higienizado com
álcool 70% antes e após o uso, permanecendo em suporte apropriado na
posição vertical evitando agregação de partículas em seu interior. Seu
adequado funcionamento deve ser monitorado avaliando-se a constância do
Revisado por: Data:____/____/2012
volume ou formação de gotas. Em caso de suspeita efetuar teste
hidrostático: (1) fixar a ponteira ao pipetador; (2) pipetar água destilada
até o primeiro estágio da pipeta; (3) obstruir a abertura da ponteira com
um dedo; (4) acionar o êmbolo até o segundo estágio durante 20
segundos; (5) liberar o acionador do êmbolo lentamente até sua posição
original; (6) desobstruir a abertura da ponteira. Caso seja observado
deslocamento da água é confirmada a existência de problema no
acoplamento com a ponteira ou de vedação do pipetador. Caso não seja
possível corrigir o problema, o pipetador deve ser encaminhado a
assistência técnica.
Geladeiras (n=3): devem ser monitoradas quanto a temperatura
observando-se os termômetros internos. No caso de acúmulo de gelo
superior a 01 cm o equipamento deve ser descongelado e limpo com água e
detergente neutro. Caso haja alteração de temperatura fazer a verificação
das borrachas de vedação das portas e do funcionamento do termostato. Se
houver problema, encaminhar o equipamento para manutenção
Microscópios ópticos (n=3): devem ser mantidos com as lentes
(objetivas e oculares) limpas usando papel absorvente macio e solução de
etanol/éter etílico (60/40). Limpar a poeira do condensador e da mesa do
microscópio com pincel e manter os equipamentos cobertos com capa de
tecido após o uso. Quando for detectada contaminação fúngica ou
desalinhamento de componentes, encaminhar o equipamento para
manutenção.
Autoclave: manter o cesto e a câmara de autoclavagem limpos e com
água destilada cobrindo totalmente a resistência. Em caso de detecção de
vazamento de vapor na tampa ou na válvula de segurança tentar ajustar.
Caso não seja possível controlar o vazamento ou houver alteração de
funcionamento do manômetro, encaminhar o equipamento para
manutenção.
Fotômetro e diluidor automático: a calibração do fotômetro deve ser
aferida semanalmente mediante utilização de cubetas padronizadas
(próprias do equipamento). Já a calibração do sistema de diluição e
determinação da concentração espermática deve ser aferida mediante
realização de avaliações sucessivas da mesma amostra seguida da aferição
no sistema CASA. Em caso de inconstância dos resultados rever o
Revisado por: Data:____/____/2012
procedimento. Se não for detectada a origem do problema, solicitar
orientação da assistência técnica.
Máquina de envase e impressão nas palhetas: verificar o nível do
reservatório de tinta e testar a velocidade de impressão observando a
adequada impressão das informações (usar palhetas de teste). Conectar as
agulhas e tubos de preenchimento das palhetas de forma higiênica. Caso o
preenchimento das palhetas não esteja adequado, conferir a montagem do
sistema. Se não for possível ajustar a impressão e/ou o preenchimento das
palhetas solicitar orientação ou a antecipação da visita anual da assistência
técnica para calibração.
Osmômetro: verificar o nível da solução de resfriamento (trocar
mensalmente) e calibrar o osmômetro com as soluções padrão. Caso não se
obtenha calibração, encaminhar o equipamento para manutenção.
Não havendo possibilidade de calibração e/ou reparo de algum
equipamento ou utensílio deve-se proceder sua substituição.
Revisado por: Data:____/____/2012
Manual de BPP
Etapa 5 – Sanitização
Cód: 05
Seção: 1
Revisão: 10/08/2012
Página: 21
5. Sanitização
A descrição da frequência, produto utilizado e procedimento de
higienização de equipamentos, utensílios e de ambiente estão descritos no
PPHO 2 – Higiene das instalações, equipamentos e utensílios.
5.1 Controle de pragas
No ambiente da empresa podem ocorrer infestações de moscas,
formigas, ratos e carrapatos. A entrada de insetos no laboratório é
prevenida por barreiras físicas (portas e janelas com telas) associada a
aplicação quinzenal de inseticida a base de piretróides (usar EPI durante a
aplicação). A aplicação deve ser monitorada (data, freqüência e colaborador
responsável) mediante registro em planilha arquivada junto aos demais
registros gerados (POP, etc).
O controle de roedores é feito mediante emprego de armadilhas
estrategicamente distribuídas e inspecionadas quinzenalmente por empresa
especializada terceirizada (Anexo3).
O controle de carrapatos é realizado mediante pulverizações nos
touros com produto carrapaticida de acordo com recomendação do médico
veterinário.
Revisado por: Data:____/____/2012
Manual de BPP
Etapa 6 – Produção
Cód: 06
Seção: 1
Revisão: 10/08/2012
Página: 22
6. Produção
6.1 Matéria-Prima
Entende-se por matéria-prima o sêmen obtido dos touros que fazem
parte do plantel residente do CCPS. Para entrarem no plantel residente os
animais passam por um período de quarentena em que são sanitariamente
testados de acordo com a regulamentação do MAPA. Segundo a INSTRUÇÃO
NORMATIVA Nº 48, de 17 de junho de 2003 (MAPA), os touros somente
poderão ingressar no rebanho residente para iniciarem o regime de coleta
após submetidos à quarentena por um período mínimo de 28 dias onde
serão testados para as seguintes doenças: brucelose, tuberculose,
campilobacteriose genital bovina, tricomonose e diarréia viral bovina (BVD).
O status de produção é avaliado a cada rotina de coleta enquanto a
condição sanitária é reavaliada semestralmente para as seguintes doenças:
brucelose, tuberculose, campilobacteriose genital bovina e tricomonose.
Para o processamento da matéria-prima são utilizados compostos
químicos (antibióticos e reagentes) e biológicos (gema de ovo pasteurizada)
provenientes de fornecedores com reconhecida capacidade técnica e
higiênico-sanitária. No recebimento dos compostos são verificadas data de
fabricação/produção, data de validade e condições da embalagem.
6.2 Etapas de processamento
1 - Preparação da solução base de diluente
Inicialmente são pesados/medidos os antibióticos (pó ou solução comercial
mantido em geladeira) preparando soluções base para adição ao sêmen ou
diluente pronto. Em seguida os componentes químicos (mantido no
Revisado por: Data:____/____/2012
almoxarifado) são pesados e diluídos em uma proveta usando água
destilada, constituindo a solução base de citrato de sódio.
2 - Preparação do diluente para processamento do sêmen
O diluente é preparado a cada dois dias usando uma proveta de um litro
misturando a solução base de citrato de sódio, gema de ovo e antibiótico
para constituição do diluente (frações A1 e B1) (anexo 4). Os componentes
são homogeneizados e mantidos sob refrigeração de 5°C por 12 horas para
decantação. Após esse período, descarta-se o sedimento e prepara-se as
duas frações de diluente: fração A2 (sem glicerol) e Fração B2 (com glicerol
e corante alimentício verde) (anexo 4).
3 - Processamento da matéria-prima
A partir do recebimento da matéria-prima na janela de duplo óculo o
coletador repassa a identificação do touro doador do sêmen para o
laboratorista. Após identificar e registrar o horário de entrada o
laboratorista coleta uma amostra para determinação da concentração, pesa
o tubo de coleta e adiciona 2% de solução de antibióticos ao ejaculado. O
material é mantido em incubação no bloco térmico por cinco minutos até
ser realizada a primeira diluição (1:1 ou 1:2) com a fração A2 do diluente. A
partir do material diluído procede-se a avaliação da motilidade da amostra
(apto ou não ao congelamento), determinando-se o grau de diluição final a
que será submetido, de acordo com o registro programado para cada touro
(programa PecTouro). As amostras aptas ao congelamento são levadas ao
compartimento do balcão refrigerado a 9°C onde permanecerão por uma
hora. Ao final deste período a amostra será levada ao compartimento
principal do balcão refrigerado para atingir 5°C (uma hora) para então
completar a diluição (PCC1) com a fração A do diluente isotérmico e a
fração B2 correspondente, sendo a última de modo escalonado a fim de
evitar choque osmótico. Trinta minutos após a diluição final, as amostras
são submetidas ao envase em palhetas de 0,5 mL. As palhetas prontas são
então inspecionadas quanto ao correta preenchimento, contadas e
Revisado por: Data:____/____/2012
acondicionadas em recipientes a granel. Os recipientes contendo as
palhetas de cada touro são então acondicionadas em caixa térmica a 5°C
para transporte ao setor de congelamento (PC1).
No setor de congelamento as palhetas são raqueadas dentro da câmara fria
antes de serem levadas ao túnel de congelamento, onde ocorrerá a curva
de congelamento para posterior imersão em nitrogênio líquido (-196°C) e
acondicionamento em botijões criogênicos (PCC2).
Após ser atestada a viabilidade espermática pós-descongelamento (analise
da concentração e motilidade através do sistema Computer Assisted Semen
Analysis - CASA) a partida será liberada para expedição.
5 – Distribuição
As amostras de sêmen são distribuídas em botijões criogênicos.
6.3 Fluxograma de processamento da matéria-prima
REVISAR PLANILHAS DA COLETA DIÁRIA
IDENTIFICAR TOUROS
TRAZER TOUROS PARA ÁREA DE COLETA
REALIZAR HIGIENIZAÇÃO DOS TOUROS SOMENTE NO MOMENTO DA COLETA
PEGAR A MANEQUIM DE PREFERÊNCIA DO TOURO, HIGIENIZANDO SEU
POSTERIOR COM A SOLUÇÃO DESINFETANTE ANTES DE CADA COLETA
DESVIAR O PÊNIS DO TOURO NOS TRÊS PRIMEIROS SALTOS
PREPARAR A VAGINA ARTIFICIAL
REALIZAR A COLETA DO SÊMEN E ENTREGAR O TUBO COM ETIQUETA DE
IDENTIFICAÇÃO NA JANELA DE DUPLO ÓCULO
Revisado por: Data:____/____/2012
AMOSTRA NA JANELA DUPLO ÓCULO: VERIFICAR NOME DO TOURO, COLETADOR E
HORÁRIO - REGISTRAR NA PLANILHA
PESAR, ADICIONAR ANTIBIÓTICO, VERIFICAR CONCENTRAÇÃO E REALIZAR A PRÉ-
DILUIÇÃO
AVALIAR MOTILIDADE E ANOTAR TODOS OS DADOS NO PROGRAMA PECTOURO,
LIBERANDO OU NÃO A AMOSTRA PARA CONGELAMENTO
LEVAR AMOSTRA PARA O COMPARTIMENTO A 9°C NO BALCÃO REFRIGERADO
DEIXANDO POR 1 HORA
AMOSTRA NO BALCÃO A 5°C POR 1 HORA E EM SEGUIDA REALIZAR A DILUIÇÃO
FINAL DEIXANDO A AMOSTRA ESTABILIZAR POR 30 MIN (PCC1)
IDENTIFICAR AS PALHETAS
ENVASAR AS AMOSTRAS NAS PALHETAS REVISANDO-AS APÓS ENVASE
(CONTROLE DE QUALIDADE)
COLOCAR AS PALHETAS EM CAIXA TÉRMICA COM GELO RECICLÁVEL –
TRANSPORTE PARA A ÁREA DE CONGELAMENTO (PC1)
RAQUEAMENTO NO INTERIOR DA CÂMARA FRIA
CONGELAMENTO NO TÚNEL DE CONGELAMENTO
ARMAZENAR AS PALHETAS NOS BOTIJÕES ATÉ LIBERAÇÃO (PCC2)
Revisado por: Data:____/____/2012
6.4 Etapas críticas do processo
Ponto Crítico de Controle (PCC)
Etapa: Diluição Final - PCC1
Medidas de controle: Medir corretamente o volume de diluente que deverá
ser adicionado a amostra. Para isso, usar provetas graduadas previamente
testadas quanto a medição correta de líquidos.
Etapa: Armazenamento – PCC2
Medidas de controle: Manter o nível de nitrogênio líquido adequado nos
botijões de armazenamento.
Ponto de Controle (PC)
Etapa: Transporte – PC1
Medida de controle: Utilizar gelo do tipo reciclável suficiente para manter a
temperatura no interior da caixa térmica em 5°C.
Revisado por: Data:____/____/2012
Manual de BPP
Etapa 7 – Embalagem e Rotulagem
Cód: 07
Seção: 1
Revisão: 10/08/2012
Página: 27
7. Embalagem e Rotulagem
7.1 Procedimento de armazenamento e manipulação das palhetas
de envase
Para o envase da matéria-prima processada são utilizadas palhetas
de cloreto de polivinil (IMV®) brancas com vedantes de cor vermelha e azul
e capacidade para 0,5 mL. As palhetas vazias são armazenadas no
almoxarifado do laboratório dentro de sua embalagem original lacrada,
preservando sua condição sanitária. No momento do uso a embalagem e as
mãos do laboratorista devem ser limpas com álcool 70%. A manipulação
das palhetas deve ser restrita a sua colocação no reservatório do
equipamento de rotulagem e posterior envase para evitar contaminação.
7.2 Sistema de envase e rotulagem
A matéria-prima processada é envasada através de sistema
automatizado (IMV®) que lacra as palhetas previamente rotuladas em
sitema automatizado (IMV®) com identificação do CCPS, nome do touro,
raça do touro, partida e data de congelamento (sentido plug de vedação
para ponta).
7.3 Armazenamento e distribuição
O produto final envasado e congelado é mantido em condições
criogênicas em nitrogênio líquido sendo liberado para expedição após
avaliação da viabilidade pós-descongelamento. O produto é mantido
armazenado na área de estoque onde é preservada a condição de higiene e
Revisado por: Data:____/____/2012
o favorecimento logístico de facilidade de acesso para expedição em
botijões criogênicos de transporte.
Revisado por: Data:____/____/2012
Manual de BPP
Etapa 8 – Controle de Qualidade
Cód: 08
Seção: 1
Revisão: 10/08/2012
Página: 29
8. Controle de qualidade
A qualidade da matéria-prima é garantida através de
acompanhamento da motilidade e vigor espermático no sêmen recém-
coletado em cada rotina. Somente são considerados para processamento os
ejaculados com mínimo de 70% de motilidade progresiva e vigor ≥3 (0 -5)
com mínimo de 70% de células normais determinado em espermograma
semanal. As avaliações de motilidade e vigor de rotina são realizadas pelos
laboratoristas treinados enquanto o espermograma e a decisão final pela
liberação ou condenação do ejaculado é de responsabilidade do médico
veterinário do laboratório.
Após o processamento e congelamento são avaliadas amostras de
todas as partidas através do sistema Computer Assisted Semen Analysis
(CASA). Nesta avaliação é feita a aferição da concentração e motilidade
espermática na dose de sêmen para liberação ou rejeição das partidas. O
resultado destas análises fica arquivado no laboratório para registro do
desempenho dos touros.
O controle de qualidade microbiológico do material processado é
realizado mensalmente (ou no caso de troca de partida de antibióticos)
mediante envio de amostras para laboratório terceirizado equipado para
realização de espermocultura. Para o teste são enviadas 10 palhetas de três
touros e 10 palhetas preparadas somente com diluente (sem sêmen)
identificadas como VET TESTE dia/mês/ano raqueadas com identificação de
controle de qualidade (CQ).
Revisado por: Data:____/____/2012
Preparação das palhetas VET TESTE:
Pesar 5,0 mL de água destilada autoclavada;
Acrescentar 0,1 mL do coquetel de antibióticos (100 µg);
Misturar 5,0 mL de diluente A2;
Resfriar e equilibrar até 5°C;
Após 2 horas adicionar 36 mL de diluente A2 e 44 mL de
diluente B2.
O resultado de número de unidades formadoras de colônia (UFC) serve para
acompanhamento do controle da higiene de processamento e eficiência dos
antibióticos usados no diluente, como também, ao cumprimento da norma
internacional estabelecida pela OIE (organização internacional de saúde
animal), de até 5.000 UFC/mL de sêmen processado.
Revisado por: Data:____/____/2012
ANEXO 1 – Atestado de saúde ocupacional
Revisado por: Data:____/____/2012
ANEXO 2 – Comissão interna de prevenção de acidente - CIPA
NOME FUNÇÃO
Desimar Pereira Cerqueira Presidente
Edson Filiace Suplente
Érsio Estênio Lindenmayer Vice-Presidente
Edmar de Souza Suplente
Érico de Almeida Junior Secretário
Marina da Glória Caldas Santos Suplente
Revisado por: Data:____/____/2012
ANEXO 3 – Modelo de laudo de controle de pragas
Revisado por: Data:____/____/2012
Revisado por: Data:____/____/2012
Revisado por: Data:____/____/2012
ANEXO 4 – Diluente citrato-gema
Preparação do diluente: frações A1 e B1.
A1 B1
VOLUME (mL) 500 1000 500 1000
Citrato de sódio dihidratado (g) 29 58 50 100
H2o destilada/autoclavada (ml) 385 770 325 650
*Antibiótico solução estoque (ml) 0,5 1,0 0,5 1,0
Gema de ovo (ml) 100 200 100 200
Total 485,5 971 425,5 851
Osmolaridade 218 a 242mOsm 398 a 420mOsm
30% de tilosina (Tylan 200), 40% de gentamicina (Gentocin) e 30% de
lincomicina + espectinomicina (LincoSpectin).
As frações A1 e B1 preparadas devem permanecer sob refrigeração de 5°C por 12 horas para decantação (o sedimento deve ser desprezado);
As frações A2 e B2 do diluente devem ser preparados na manhã do
dia do congelamento, sendo imediatamente colocados no balcão refrigerado;
Preparação do diluente: frações A2 e B2.
Produto (ml) A2 B2
500 1000 500 1000
Frações A1 ou B1 qsp (ml) 488,5 971 430 860
Tylan 200 (ml) 3 6 - -
Gentocin (ml) 2 4 - -
LincoSpectin (ml) 3 6 - -
Glicerol PA (99%) - - 70 140
Corante alimentício verde - - 0,5 1,0
Revisado por: Data:____/____/2012
PROCEDIMENTOS PADRÃO
DE
HIGIENE OPERACIONAL (PPHO)
Revisado por: Data:____/____/2012
PPHO 1 Potabilidade da água
Cód: PPHO 1
Revisão: 10/08/2012
Página: 38
1. Objetivo
Estabelecer procedimentos a serem adotados para manter a potabilidade da
água utilizada dentro do CCPS para consumo animal, humano e laboratorial.
2. Campo de aplicação
Aplicação nas três caixas d’água distribuídas no CCPS: uma na área do
laboratório, uma no quarentenário e outra na área administrativa.
3. Definições
- Seguro: que não oferece risco químico ou biológico aos animais, humanos,
processos laboratoriais e a qualidade do produto final;
- Contaminado: oferece risco químico ou biológico aos animais, humanos,
processos laboratoriais e a qualidade do produto final;
- Limpeza: procedimentos de lavagem mediante uso de água e
sabões/detergentes para eliminação de matérias indesejáveis (terra,
matéria orgânica, outros);
- Sanitização: aplicação de produtos químicos com propriedades de destruir,
remover ou reduzir a concentração de microrganismos patogênicos até
níveis considerados seguros, mantendo a água potável.
4. Responsabilidades
O gerente da produção será responsável por implantar, acompanhar e
assegurar o cumprimento do PPHO 1 pelos responsáveis de cada setor.
Os reparos dos reservatórios e linhas de distribuição de água serão
realizados por uma empresa terceirizada também responsável pela limpeza
Revisado por: Data:____/____/2012
e sanitização dos reservatórios. O anexo 5 mostra um laudo emitido por
empresa responsável por realizar a limpeza e sanitização das caixas d’água.
5. Monitorização
5.1 Controle da potabilidade da água
É realizado através de análise físico-química e bacteriológica da água. O
anexo 6 mostra o laudo emitido após avaliação da qualidade da água.
Frequência: semestral através de auditoria realizada por empresa
responsável pelo plano APPCC.
5.2 Limpeza e manutenção das caixas d’água e reservatórios
A monitorização é feita através do acompanhamento dos laudos arquivados.
Frequência: semestral através de auditoria realizada por empresa
responsável pelo plano APPCC.
6. Ação Corretiva
6.1 Controle da potabilidade da água
Segundo o laudo e indicações emitidas pela empresa responsável por essas
análises, o CCPS providencia as medidas necessárias para correção.
6.2 Limpeza e manutenção das caixas d’água e reservatórios
A ação corretiva necessária é realizada pela empresa responsável pela
limpeza e manutenção.
Revisado por: Data:____/____/2012
PPHO 2
Higiene das instalações, equipamentos e
utensílios
Cód: PPHO 2
Revisão: 10/08/2012
Página: 40
1. Objetivos
Estabelecer procedimentos e requisitos de higiene de instalações e
superfícies envolvidas no processamento da matéria prima que possam
trazer algum risco de contaminação do produto final.
2. Campo de aplicação
Este procedimento aplica-se a toda área de quarentenário e de produção
incluindo piquetes dos touros, tronco de preparação para coleta, áreas de
coleta, sala de preparação das vaginas atificiais, laboratório de
processamento, laboratório de apoio sanitário, enfermaria, tronco
hidráulico, pedilúvio e balança de pesagem.
3. Responsabilidades
O gerente da produção é responsável por implantar, acompanhar e
assegurar o cumprimento do PPHO 2 pelos responsáveis de cada setor.
Todos os colaboradores são responsáveis por aplicar os requisitos de
higiene descritos neste procedimento.
4. Descrição
4.1 Disponibilização de produtos e utensílios para higienização de
materiais e instalações
- O CCPS disponibiliza detergentes e sanitizantes em quantidade suficiente
para a realização dos procedimentos de limpeza e sanitização. Detergentes
específicos são mantidos na área de lavagem de material no laboratório e
na sala de preparação de material de coleta. Os demais produtos de limpeza
Revisado por: Data:____/____/2012
são armazenados em local específico para estocagem no banheiro feminino
da unidade laboratorial.
- As instalações são providas de água fria e quente em quantidade
suficiente.
- Os utensílios (baldes, esponjas, rodos) estão disponíveis em quantidade
suficiente, sendo armazenados no local de estocagem.
4.2 Limpeza e sanitização de equipamentos, utensílios e
instalações
O CCPS possui um programa de higienização para instalações,
equipamentos e utensílios, contemplando informações como: instalação /
equipamento / utensílio; frequência; produto e procedimento de
higienização.
Revisado por: Data:____/____/2012
Quadro 1: Limpeza e sanitização de equipamentos
EQUIPAMENTO FREQUÊNCIA PRODUTO PROCEDIMENTO DE HIGIENIZAÇÃO
Balanças digitais , Placa aquecedora, Bloco térmico, Fotômetro,
Balcão refrigerado
Após o uso
(diária)
Álcool 70%
Nas Balanças digitais remover produtos secos com pincel antes de limpar com gaze embebida em álcool 70%. Placa aquecedora, Bloco térmico, Fotômero devem ser limpos com álcool 70% e secos com papel toalha.
Microscópios Após o uso
(diária)
Álcool-éter
Álcool 70%
Limpar lentes (oculares e objetivas) com algodão embebido em álcool-
éter e outras superfícies com álcool 70%.
Estufa de secagem de
material, Estufa de esterilização, Estufa de
aquecimento do diluente, Estufas de aquecimento das VAs
Semanal Álcool 70%
Borrifar álcool 70% no interior das estufas passando em seguida papel
toalha.
Estufa de secagem de material, Estufa de
esterilização, Estufa de aquecimento do diluente,
Estufas de aquecimento das VAs
Mensal Detergente neutro
álcool 70%
Desligar as estufas. Lavar as grades em uma pia usando esponja e detergente neutro e em seguida enxaguar em água corrente. Lavar os
equipamentos interna e externamente com esponja e detergente neutro, tomando o cuidado para não danificar a resistência no interior dos
mesmos. Retirar o excesso de detergente com esponja ou pano úmido. Borrifar álcool 70% nas grades, no interior e exterior das estufas secando com papel toalha. Colocar as grades no lugar e ligar as estufas
controlando se a temperatura correta foi alcançada.
Autoclave
Semanal Detergente neutro
álcool 70%
Lavar o cesto em uma pia usando esponja e detergente neutro e em
seguida enxaguar em água corrente. Lavar a caldeira internamente usando esponja e detergente neutro. Drenar a água e enxaguar até
remover todo o detergente. Borrifar a caldeira e o cesto com álcool 70% secando a seguir com papel toalha. Abastecer a caldeira com água destilada até cobrir a resistência, recolocar o cesto e fechar a tampa do
equipamento.
Armário UV Semanal Álcool 70% Borrifar álcool 70% no interior do armário secando com papel toalha em
Revisado por: Data:____/____/2012
seguida.
Armário UV
Quinzenal Detergente neutro
álcool 70%
Lavar as grades em uma pia usando esponja e detergente neutro
retirando o excesso com esponja e em seguida enxaguar em água corrente. Higienizar o interior do armário com esponja úmida e
detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja e secando em seguida com papel toalha. Borrifar álcool 70% nas grades e no interior
do armário secando-os com papel toalha.
Balcão refrigerado
Mensal Detergente neutro
álcool 70%
Usar esponja úmida e escova de cerdas macias (para os cantos) com detergente neutro para higienização interna e externa. Remover o
detergente com esponja úmida, borrifar álcool 70% e secar com papel toalha.
Deionizador Mensal Álcool 70%
Manter superfície externa limpa com uso de álcool 70% e papel toalha. Limpar a coluna nova com álcool 70% no momento da troca.
Destilador Mensal
Ácido Acético Álcool 70%
Abastecer a caldeira com ácido acético para remoção de crostas de sais. Após 15 minutos drenar o ácido e enxaguar com água corrente. Limpar
externamente com álcool 70% e papel toalha.
Geladeiras
A cada 2 meses
Detergente neutro, Álcool 70%
Esvaziar e desligar o equipamento forçando o degelo com ventilador.
secar com pano e higienizar interna e externamente com esponja e detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja úmida. Após, borrifar álcool 70% e secar com papel toalha.
Armários e gavetas Mensal
Detergente neutro, Álcool 70%
Esvaziar e higienizar interna e externamente com esponja e detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja úmida. Após, borrifar álcool
70% e secar com papel toalha.
Revisado por: Data:____/____/2012
Quadro 2: Limpeza e sanitização de utensílios
UTENSÍLIO FREQUÊNCIA PRODUTO PROCEDIMENTO DE HIGIENIZAÇÃO
Vidraria
Após o uso
Álcool 96°GL
Detergente neutro
água deionizada
Remover marcas de caneta higroscópica com álcool 96°GL, enxaguar em água
corrente e colocar de molho em água com detergente neutro específico para
vidraria na diluição recomendada pelo fabricante. Após uma hora, lavar com
esponja/escova e detergente neutro e enxaguar dez vezes em água corrente e
duas vezes em água deionizada. Remover o excesso de água por agitação e
colocar na estufa de alta temperatura para secagem. Após a secagem verificar a
qualidade da limpeza e lacrar a abertura dos frascos adequadamente limpos
com papel alumínio antes da esterilização. Relavar os insatisfatórios.
Lâminas para microscopia
Após o uso Detergente neutro
Álcool 96°GL
Enxaguar em água corrente e colocar de molho em água com detergente neutro
específico para vidraria na diluição recomendada pelo fabricante. Após uma
hora, lavar com esponja macia e enxaguar dez vezes em água corrente e
mergulhar em álcool 96°GL. Remover do álcool, secar com papel macio e
embrulhar (20 em 20) em papel alumínio.
Tubos de coleta de sêmen
Após o uso
Detergente neutro
Água deionizada
Enxaguar em água corrente e colocar de molho em água com detergente neutro
específico para vidraria na diluição recomendada pelo fabricante. Após uma
hora, lavar com escova e enxaguar dez vezes em água corrente e duas vezes
em água deionizada. Remover o excesso de água por agitação e colocar na
estufa de secagem de material. Após verificação da qualidade da limpeza,
embalar os tubos (6-8) em papel pardo selado com fita marcadora e autoclavar.
Vaginas artificiais (VAs) Após o uso
Detergente neutro
Kilol e Água
destilada
Enxaguar em água corrente e lavar mucosas e cones com escova de cerdas
macias usando detergente neutro específico para vidraria na diluição
recomendada pelo fabricante. Enxaguar as mucosas e os cones cinco vezes em
água corrente e colocar de molho em solução de Kilol (1:250) por 15 minutos.
Enxaguar com água destilada e colocar para secar na secadora durante 30
Revisado por: Data:____/____/2012
Quadro 3: Limpeza sanitização de instalações
INSTALAÇÃO FREQUÊNCIA PRODUTO PROCEDIMENTO DE HIGIENIZAÇÃO
Laboratório Diária Álcool 70%
Ao final da rotina as bancadas devem ser borrifadas com álcool 70% e limpas
com papel toalha e as lixeiras esvaziadas
Laboratório
Três vezes por
semana
Hipoclorito de sódio
detergente neutro
álcool 70%
Após o final da rotina, limpar o chão com pano umedecido em água com
hipoclorito de sódio na diluição recomendada pelo fabricante. Limpar as
bancadas com esponja úmida e detergente neutro e em seguida, borrifar álcool
70% secando com papel toalha.
Laboratório
Mensal Propanol
Ao final da rotina antes do final de semana, conectar o equipamento de
nebulização ao sistema de ar condicionado e abastecer com o bactericida e
fungicida HSW Premiun (saBesto, Wurth). Manter o sistema ligado por 15
minutos. Sala de preparação das VAs
Diária Hipoclorito de sódio
álcool 70%
Após a colocação das VAs na estufa de aquecimento, varrer e lavar o chão com
água e hipoclorito de sódio na diluição recomendada pelo fabricante, e usar
rodo para secagem. Limpar as bancadas com álcool 70% e papel toalha.
Sala de preparação das VAs
Mensal Detergente neutro
álcool 70%
Esvaziar e higienizar os armários (interna e externamente) com esponja e
detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja úmida. Após, borrifar
álcool 70% secando com papel toalha
Laboratório de apoio sanitário
Semanal
Hipoclorito de sódio
detergente neutro
álcool 70%
Limpar o chão com pano umedecido em água com hipoclorito de sódio na
diluição recomendada pelo fabricante. Limpar as bancadas com esponja úmida e
detergente neutro e em seguida, borrifar álcool 70% secando com papel toalha.
Laboratório de apoio sanitário
Mensal Detergente neutro
álcool 70%
Esvaziar e higienizar os armários (interna e externamente) com esponja e
detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja úmida. Após, borrifar
álcool 70% secando com papel toalha.
Farmácia Semanal Hipoclorito de sódio Higienizar o chão com água e hipoclorito de sódio na diluição recomendada pelo
minutos antes de remontar as VAs e armazená-las em sua estufa de
aquecimento.
Capas de proteção das VAs Após o uso Detergente neutro Lavar em pia com escova e detergente neutro. Enxaguar e deixar secar ao ar.
Revisado por: Data:____/____/2012
álcool 70% fabricante e secar com o auxílio de um rodo. Borrifar álcool 70% na estante e
secar com papel toalha.
Almoxarifado Mensal Hipoclorito de sódio
Esvaziar a sala lavando com água e hipoclorito de sódio na diluição
recomendada pelo fabricante. Secar com o auxílio de um rodo.
Balança e tronco hidráulico Após o uso
Remover fezes da balança a seco, no restante utilizar água sob pressão para
remoção dos dejetos (fezes e urina).
Pedilúvio Conforme a
frequência de
uso
Sulfato de cobre
Drenar e remover sólidos com pá antes de limpar com vassoura e água sob
pressão. Após, reabastecer (20 cm de lâmina d’água e 5 kg de sulfato de
cobre).
Tronco hidráulico Conforme a
frequência de
uso
Hipoclorito de sódio
Remover dejetos e lavar com água sob pressão e em seguida enxaguar com
solução de hipoclorito de sódio na diluição recomendada pelo fabricante.
Área coberta de coleta Diária Remover fezes.
Tronco de preparação para
coleta Diária
Quaternário de
amônio
Remover as fezes com auxílio de pá e água sob pressão e em seguida aplicar
solução de quaternário de amônio na diluição recomendada pelo fabricante.
Área de apoio do tronco de
preparação para coleta Quinzenal Detergente neutro
álcool 70%
Esvaziar e higienizar os armários (interna e externamente) com esponja e
detergente neutro, retirando o resíduo com a esponja úmida. Após, borrifar
álcool 70% e secar com papel toalha.
Enfermaria Conforme a
frequência de
uso
Quaternário de
amônio
Durante a permanência do animal, manter a cama de maravalha sem acúmulo
de fezes. Após a saída do animal, remover a cama de maravalha e higienizar o
chão e as paredes com água sob pressão e aplicar solução de quaternário de
amônio na diluição recomendada pelo fabricante.
Abrigos dos touros Diária
Remover restos de alimento do cocho antes de reabastecer. Verificar o
bebedouro, drenando e limpando no caso de haver alimento na água.
Abrigos dos touros
Semanal Quaternário de
amônio
Remover dejetos e terra com pá e vassoura. Drenar o bebedouro e limpar com
escova. Higienizar o chão e as paredes com solução de quaternário de amônio
na diluição recomendada pelo fabricante. Rodolúvio
Semanal Cresóis Remover resíduos com pá e vassoura e acionar o sensor para desinfecção do
rodolúvio
Quarentenário
Diária Quaternário de
amônio
Diariamente (manhã e tarde), remover restos de alimento dos cochos e fezes
da cama de maravalha. A tarde lavar o corredor central com água sob pressão e
usar solução de quaternário de amônio (na diluição recomendada pelo
fabricante) se houver trânsito de animais.
Quarentenário Conforme a Quaternário de Na área de apoio para exames e curativos, as bancadas devem ser limpas com
Revisado por: Data:____/____/2012
frequência de
uso
amônio
Álcool 70%
álcool 70% e papel toalha. O tronco de contenção e o chão devem ser limpos
com pá e água sob pressão antes da aplicação de solução de quaternário de
amônio na diluição recomendada pelo fabricante
Quarentenário
Mensal Quaternário de
amônio
A sala das cordas deverá ser varrida e higienizada com solução de quaternário
de amônio na diluição recomendada pelo fabricante. As cordas e cabrestos
deverão ser lavados em solução de quaternário de amônio na diluição
recomendada pelo fabricante assim que o touro deixar o quarentenário ,e em
seguida, deixados secar ao sol.
Quarentenário Conforme a
frequência de
liberação
Quaternário de
amônio
Ao ser liberada, cada baia deve ser completamente limpa (paredes, chão,
canos, porteiras e cochos) com pá, vassoura, escova e água sob pressão e em
seguida desinfetada com solução de quaternário de amônio na diluição
recomendada pelo fabricante.
Revisado por: Data:____/____/2012
Fluxo no Quarentenário
O colaborador responsável (portador da chave de acesso) entra pelo
portão (sempre trancado) e acessa o vestiário onde troca de roupa
(macacão, bota e luva) antes de ter contato com os animais alojados ou
receber novos animais.
Durante o recebimento de animais, o colaborador responsável dá
acesso ao veículo de carga (após desinfecção no rodolúvio) até a rampa de
descarregamento e brete de contenção (identificação, exame clínico, coleta
de amostras, tratamentos). Durante este processo o colaborador
responsável se assegura de que pessoas estranhas ao setor estarão usando
botas descartáveis e não acessarão a instalação principal.
Durante o manejo diário (alimentação e limpeza) o colaborador
responsável deve trocar de luvas ou higienizar as mãos entre os
procedimentos com animais diferentes.
Ao deixar a instalação principal o colaborador deve tomar banho e
trocar de roupa e se assegurar do fechamento das vias de acesso da
instalação. Ao sair pelo portão o colaborador deve desinfetar seu calçado
com spray de cresol usando bomba manual.
O colaborador responsável deve se assegurar que materiais e
equipamentos utilizados no quarentenário não sejam levados as instalações
do rebanho residente sem a adequada desinfecção.
5. Monitorização
5.1 Disponibilização e manutenção de instalações, produtos e
utensílios para higienização
Através de observação visual e do Check list (anexo 7).
Frequência: a cada dois meses.
5.2 Limpeza e sanitização de equipamentos, utensílios e
instalações
Através da verificação das planilhas de realização das atividades e do Check
list (anexo 7).
Revisado por: Data:____/____/2012
Frequência: a cada dois meses.
6. Ação Corretiva
6.1 Disponibilização e manutenção de instalações, produtos e
utensílios para higienização
Reposição de produtos (detergentes e sanitizantes).
Solicitação de manutenção.
6.2 Limpeza e sanitização de equipamentos, utensílios e
instalações
Treinar novamente os colaboradores nos procedimentos de higienização.
7. Verificação
O quê? Como? Quando? Quem?
Registros das
planilhas de
realização das
atividades
Observação
visual
Mensal Responsável por
cada setor
Auditoria interna
através do check
list
Observação
visual
A cada dois
meses
Funcionário da
gerência
Registro de
treinamentos
Observação
visual
A cada dois
meses
Funcionário da
gerência
Registros em
geral
Observação
visual
Semestral Empresa
responsável pelo
plano APPCC
Revisado por: Data:____/____/2012
Procedimento Padrão de Higiene Operacional - PPHO
LIMPEZA DAS VAGINAS ARTIFICIAIS
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Lavagem e desinfecção das vaginas
artificiais (VAs) utilizadas na coleta de sêmen
RESPONSÁVEL: Funcionário da área externa
ATIVIDADES
Preparação: vestir avental plástico (usando roupas limpas) e calçar luvas de borracha;
Enxaguar as VAs em água corrente e a seguir esfregar externa e internamente as peças (tubo rígido, mucosa e cone) usando escova de cerdas flexíveis e detergente neutro;
Enxaguar as peças 5-7 vezes com água corrente para remoção do detergente;
Mergulhar as peças em solução de Kilol® (1:250 preparada diariamente) por 15 minutos;
Enxaguar as peças 3-5 vezes em água destilada;
Após breve escorrimento, levar as peças à secadora por 30 minutos;
Após a secagem, remontar as VAs e embalar em saco plástico antes de acondicioná-las na estufa de aquecimento.
AÇÃO CORRETIVA
Enxaguar as peças das VAs maior número de vezes caso ainda seja observado espuma do detergente;
ACÃO PREVENTIVA
Usar água destilada na preparação da solução de Kilol® (40ml/10litros);
Trocar a solução de água com detergente na qual as VAs são deixadas de molho até serem lavadas.
Trocar mucosas danificadas;
Elaborado por: Verificado por: Aprovado por:
MONITORAMENTO
Planilha de limpeza, montagem e verificação mensal de integridade das vaginas artificiais.
Data Nome Atividade Troca de mucosa
Observação Limpeza x Montagem Látex Neoprene
Revisado por: Data:____/____/2012
PPHO 3
Prevenção de Contaminação Cruzada
Cód: PPHO 3
Revisão: 10/08/2012
Página: 52
1. Objetivo
Estabelecer os procedimentos a serem adotados para prevenir a
contaminação cruzada (biológica, física ou química) do produto final (sêmen
congelado).
2. Campo de aplicação
Este documento aplica-se a toda área de produção.
3. Definições
- Contaminação: presença de substâncias ou agentes estranhos (origem
biológica, física ou química) que sejam prejudiciais à qualidade do produto
final;
- Contaminação cruzada: contaminação do produto final com substâncias ou
agentes estranhos (origem biológica, física ou química). Pode ser
considerada contaminação cruzada a mistura inadvertida de sêmen de
touros diferentes por falha durante o processamento.
4. Responsabilidades
- O gerente da produção é responsável por implantar, acompanhar e
assegurar o cumprimento deste procedimento.
- Todos os colaboradores são responsáveis por aplicar os requisitos para
prevenção de contaminação cruzada constante neste procedimento.
Revisado por: Data:____/____/2012
- Os colaboradores responsáveis pela monitorização são encarregados de
auxiliar o responsável técnico na implantação e cumprimento deste
procedimento.
5. Descrição
5.1 Prevenção através de procedimentos de higiene
- Os colaboradores responsáveis pela preparação do diluente utilizado no
congelamento de sêmen realizam esta atividade após higienização das
mãos com água e detergente neutro desinfetando-as em seguida com álcool
70%.
- O colaborador responsável pela lavagem e higienização das vaginas
artificiais usa roupas limpas, avental plástico e luvas e segue as
recomendações de higienização dos materiais.
- Os colaboradores responsáveis pela preparação dos touros para coleta
lavam adequadamente (externa e internamente) o prepúcio dos touros;
- Os colaboradores responsáveis pela atividade de coleta de sêmen evitam
que o pênis dos touros toque no manequim e realizam a troca de luva e
higienizam as mãos a cada etapa do processo (desvio do prepúcio do touro
e preparação da vagina artificial).
5.2 Prevenção da contaminação por superfície de equipamentos e
utensílios
- Todos os equipamentos, utensílios e instalações físicas são higienizados
conforme o PPHO 2.
6. Monitorização
6.1 Prevenção através de procedimentos de higiene
Revisado por: Data:____/____/2012
Através da observação visual durante as auditorias internas realizadas pela
gerência da empresa guiadas pelo Check list e, através de auditoria
realizada por empresa responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
6.2 Prevenção da contaminação por superfície de equipamentos e
utensílios
Através da verificação das planilhas de realização das atividades e do Check
list e, através de auditoria realizada por empresa responsável pelo plano
APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
7. Ações Corretivas
7.1 Prevenção através de procedimentos de higiene
- Promover treinamento básico para os novos colaboradores e manter
programa de capacitação e educação continuada.
- Rejeitar ejaculados contaminados com terra, maravalha ou fezes.
7.2 Prevenção da contaminação por superfície de equipamentos e
utensílios
- Proceder nova higienização dos equipamentos ou utensílios conforme
procedimentos específicos (PPHO 2).
- Promover treinamento básico para os novos colaboradores e manter
programa de reciclagem periódica.
Revisado por: Data:____/____/2012
8. Verificação
O quê? Como? Quando? Quem?
Registros nas
planilhas de
realização das
atividades
Observação
visual
Mensal Responsável por
cada setor
Registro da
auditoria interna
através do check
list
Observação
visual
A cada dois
meses
Funcionário da
gerência
Registros em
geral
Observação
visual
Semestral Empresa
responsável pelo
plano APPCC
Revisado por: Data:____/____/2012
PPHO 4
Higiene Pessoal dos Colaboradores
Cód: PPHO 4
Revisão: 10/08/2012
Página: 55
1. Objetivos
Manter as instalações para lavagens de mãos e os serviços sanitários em
boas condições de manutenção e providos com solução detergente e
sanitizante.
Estabelecer procedimentos e requisitos de higiene pessoal a serem
adotados por todos os colaboradores que direta ou indiretamente podem
influenciar na qualidade do produto final (sêmen bovino congelado).
2. Campo de aplicação
Este documento aplica-se a toda área de produção.
3. Definições
- Contaminação: presença de substâncias ou agentes estranhos (origem
biológica, física ou química) que sejam prejudiciais à qualidade do produto
final (sêmen congelado);
- Higienização: procedimentos de limpeza e sanitização;
- Antisséptico ou sanitizante ou desinfetante: produto de natureza química,
que em condições de adequada diluição, é utilizado para reduzir a carga
microbiana até níveis aceitáveis;
- Limpeza: procedimentos de lavagem mediante uso de água e
sabões/detergentes para eliminação de matérias indesejáveis (pó, terra,
maravalha, outros);
- Desinfecção ou sanitização: ação de reduzir a concentração de
microrganismos contaminantes até níveis considerados aceitáveis;
Revisado por: Data:____/____/2012
- Não-conformidade: não atendimento de qualquer um dos requisitos
especificados.
4. Responsabilidades
- O gerente da produção é responsável por implantar, acompanhar e
assegurar o cumprimento deste procedimento junto aos responsáveis de
cada setor.
- Todos os colaboradores são responsáveis por aplicar os requisitos de
higiene descritos neste procedimento.
5. Descrição
5.1 Colocação e manutenção de cartazes educativos
Os cartazes educativos “Como Lavar suas Mãos” (anexo 8) estão fixados e
mantidos em todos os locais onde se realizam atividades durante a coleta e
o processamento do sêmen, como também em todos os sanitários.
5.2 Disponibilidade e manutenção de instalações, produtos e
utensílios
Todas as saboneteiras dos sanitários e instalações são mantidas com
solução detergente.
Os porta-toalhas de papel são mantidos abastecidos através de reposição
periódica.
Todas as instalações sanitárias (vasos, pias, chuveiros) estão funcionando.
Os coletores de resíduos da área interna possuem tampa, acionamento por
pedal e os sacos descartáveis são trocados diariamente.
5.3 Conduta e comportamento dos colaboradores
Os colaboradores da área interna usam uniformes limpos (jaleco e sapato) e
são instruídos a higienizá-los semanalmente.
Revisado por: Data:____/____/2012
Os colaboradores da área externa usam uniformes limpos (calça, camisa e
bota) e são instruídos a higienizá-los diariamente ou a cada dois dias.
6. Monitorização
6.1 Colocação e manutenção de cartazes educativos
Através da realização de auditoria interna realizada pela gerência da
empresa para avaliar as condições de higiene e conduta pessoal e, através
de auditoria realizada por empresa responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
6.2 Disponibilidade e manutenção de instalações, produtos e
utensílios
Através da realização de auditoria interna realizada pela gerência da
empresa para avaliar as condições de higiene e conduta pessoal e, através
de auditoria realizada por empresa responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
6.3 Conduta e comportamento dos colaboradores
Através da realização de auditoria interna realizada pela gerência da
empresa para avaliar as condições de higiene e conduta pessoal e, através
de auditoria realizada por empresa responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
7. Ações corretivas
7.1 Colocação e manutenção de cartazes educativos
- Colocação de cartazes instrutivos para adequada higienização das mãos
em locais onde ainda não existam e reposição dos cartazes danificados ou
ilegíveis;
Revisado por: Data:____/____/2012
- Correção de problemas relacionados às não conformidades detectadas na
avaliação das condições de higiene e conduta pessoal.
7.2 Disponibilidade e manutenção de instalações, produtos e
utensílios
- Reposição de produtos (detergente, sanitizante, papel toalha);
- Solicitação de manutenção (saboneteiras, torneiras, válvulas e válvulas de
descarga);
- Correção de problemas relacionados às não conformidades detectadas na
avaliação das condições de higiene e conduta pessoal.
7.3 Conduta e comportamento dos colaboradores
- Ajustar o programa de capacitação e educação continuada.
- Correção de problemas relacionados às não conformidades detectadas na
avaliação das condições de higiene e conduta pessoal.
Revisado por: Data:____/____/2012
PPHO 5
Proteção contra contaminação
química do produto final
Código: PPHO 5
Revisão: 10/08/2012
Página: 59
1. Objetivo
Estabelecer os procedimentos a serem adotados para prevenir que o
produto final (sêmen congelado) seja contaminado com agentes químicos.
NOTA: Os perigos biológicos serão controlados pelos demais PPHO.
2. Campo de aplicação
Este procedimento aplica-se a toda área de produção.
3. Definições
- Contaminação: presença de substâncias ou agentes químicos prejudiciais
à qualidade do produto final (sêmen congelado);
- Perigo: contaminação inaceitável de natureza química que pode afetar a
qualidade do produto, a saúde/integridade da fêmea inseminada ou dos
ovócitos inseminados em processo de fecundação in vitro.
4. Responsabilidades
O gerente da produção é responsável por implantar, acompanhar e
assegurar o cumprimento deste procedimento junto aos responsáveis de
cada setor.
Todos os colaboradores são responsáveis por aplicar os requisitos descritos
neste procedimento.
5. Descrição
Revisado por: Data:____/____/2012
5.1 Proteção contra contaminação por constituintes químicos
presentes no diluente de congelamento
- O colaborador responsável pela preparação do diluente deve se certificar
de estar usando os reagentes adequados (identificação e volume);
- O colaborador responsável pela pesagem dos constituintes do diluente
deve verificar a calibração da balança e fazer a aferição semanal com pesos
padrão.
- O colaborador responsável pela diluição do sêmen deve usar
equipamentos calibrados (pipetas ou provetas);
5.2 Identificação, estocagem e manuseio dos agentes químicos
Conforme PPHO 6.
5.3 Proteção contra contaminação por produtos de limpeza e
sanitização
Conforme PPHO 2.
6. Monitorização
6.1 Proteção contra contaminação por constituintes químicos
presentes no diluente de congelamento
Através do acompanhamento da rotina de formulação do diluente durante
as auditorias internas e, através de auditoria realizada por empresa
responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
6.2 Identificação, estocagem e manuseio dos agentes químicos
Conforme PPHO 6.
Revisado por: Data:____/____/2012
6.3 Proteção contra contaminação por produtos de limpeza e
sanitização
Conforme PPHO 2.
7. Ações corretivas
7.1 Proteção contra contaminação por constituintes químicos
presentes no diluente de congelamento
- Utilizar apenas reagentes grau para análise (PA) na confecção do diluente;
- Utilizar água destilada esterilizada por autoclavagem na preparação do
diluente;
- Utilizar vidraria esterilizada e sem traços de agentes químicos na
preparação do diluente, tendo o cuidado de enxaguar os frascos com água
destilada e esterilizada antes de iniciar a preparação;
- Descartar o diluente em caso de não conformidade na osmolaridade
obtida;
- Encaminhar a balança de precisão para calibração em caso de detecção de
alteração na leitura.
7.2 Identificação, estocagem e manuseio dos agentes tóxicos
Conforme PPHO 6.
7.3 Proteção contra contaminação por produtos de limpeza e
sanitização
Conforme PPHO 2.
Revisado por: Data:____/____/2012
PPHO 6
Agentes químicos
Código: PPHO 6
Revisão: 10/08/2012
Página: 62
1. Objetivo
Estabelecer os procedimentos a serem adotados no armazenamento e
utilização dos agentes químicos.
2. Campo de aplicação
Este procedimento aplica-se às áreas de almoxarifado do laboratório e
estoque de produtos de higiene e sanitização.
3. Definições
- Armazenamento: conjunto de tarefas e requisitos para a correta
conservação de insumos e produtos elaborados;
- Higienização: procedimentos de limpeza e sanitização;
- Limpeza: procedimentos de lavagem mediante uso de água e
sabões/detergentes para eliminação de matérias indesejáveis (pó, terra,
maravalha, outros);
- Desinfecção ou sanitização: ação de reduzir a concentração de
microrganismos até níveis considerados seguros;
- Não conformidade: não atendimento de qualquer um dos requisitos
especificados.
4. Responsabilidades
O gerente da produção é responsável por implantar, acompanhar e
assegurar o cumprimento deste procedimento junto aos responsáveis de
cada setor.
Revisado por: Data:____/____/2012
5. Descrição
5.1 Recepção, estocagem e manuseio de produtos de limpeza e
sanitização
O colaborador da administração responsável pela área interna recebe todos
os produtos de higienização e realiza uma conferência do pedido com a nota
fiscal, o rótulo do produto e o prazo de validade.
Os produtos são armazenados:
- área interna – no vestiário feminino;
- área externa – na sala de preparação de material de coleta e no
almoxarifado do quarentenário.
6. Monitorização
6.1 Recepção, estocagem e manuseio de produtos de limpeza e
sanitização
Através da observação visual durante as auditorias internas realizadas pela
gerência da empresa guiadas pelo Check list e, através de auditoria
realizada por empresa responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
7. Ações corretivas
7.1 Recepção, estocagem e manuseio de produtos de limpeza e
sanitização
- Não receber produtos não constantes no pedido e/ou com prazo de
validade ultrapassado;
- Encaminhar para o local adequado os produtos específicos de cada setor,
realocando produtos armazenados em local irregular;
- Proceder a adequada diluição dos produtos de acordo com a
recomendação do fabricante usando máscaras e/ou luvas de acordo com a
necessidade.
Revisado por: Data:____/____/2012
PPHO 7
Saúde dos Colaboradores
Código: PPHO 7
Revisão: 10/08/2012
Página: 64
1. Objetivos
Estabelecer os procedimentos a serem adotados na manutenção da saúde
dos colaboradores, identificando e prevenindo problemas de saúde
referentes a atividade profissional. Estabelecer os procedimentos a serem
adotados para preservação da qualidade do produto final.
2. Campo de aplicação
Este procedimento aplica-se a toda área de produção.
3. Definições
- Comissão Interna de Prevenção de Acidentes (CIPA): comissão formada
por funcionários da empresa responsável por reduzir o número de acidentes
de trabalho mediante conscientização dos colaboradores.
- Equipamento de Proteção Individual (EPI): todo dispositivo de uso
individual de fabricação nacional ou estrangeira destinado a proteger a
saúde e a integridade física dos colaboradores.
4. Responsabilidades
O encarregado do Departamento Pessoal é responsável por encaminhar os
colaboradores para a realização dos exames admissionais, periódicos e
demissionais, bem como, pelo controle e arquivamento de todos
documentos relativos ao histórico médico do colaborador na empresa.
O médico veterinário da área de produção é responsável por distribuir e
controlar a utilização dos EPIs na empresa.
Revisado por: Data:____/____/2012
5. Descrição
5.1 Controle da condição de saúde dos colaboradores
- A empresa contratada realiza exames médicos admissionais, periódicos
(anual) e demissionais segundo plano de saúde específico para cada setor
de atuação do colaborador.
Colaboradores da área externa: avaliação clínica, audiometria, colinesterase
plasmática e colinesterase eritrocitária. Para os operadores de máquinas é
realizado também o exame de acuidade visual.
Colaboradores da área interna: avaliação clínica, audiometria, colinesterase
plasmática e colinesterase eritrocitária.
- A empresa contratada emite relatórios com resultados parciais da situação
de saúde dos colaboradores à gerência da empresa, fazendo
recomendações caso necessário.
- A empresa contratada apresenta e discute os resultados do relatório anual
da situação de saúde dos colaboradores para a CIPA e a gerência da
contratante.
- Os colaboradores acometidos de alteração de saúde são afastados em
caso de prescrição médica.
6. Monitorização
6.1 Controle da condição de saúde dos colaboradores
- Verificação dos arquivos de relatórios da condição de saúde dos
colaboradores por ocasião da auditoria interna e, através de auditoria
realizada por empresa responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
Revisado por: Data:____/____/2012
- Durante a rotina de trabalho o responsável por cada setor é encarregado
de fiscalizar a utilização de EPIs.
7. Ações corretivas
7.1 Controle da condição de saúde dos colaboradores
- Por ocasião da auditoria interna, toda irregularidade nos relatórios da
condição de saúde dos colaboradores deve ser comunicado ao
departamento pessoal e gerência.
- Intervenção do gerente de produção caso o responsável do setor não
consiga convencer algum colaborador a usar adequadamente os EPIs.
- A qualquer momento, em caso de identificação de alteração de saúde de
algum colaborador fazer encaminhamento para avaliação médica.
Revisado por: Data:____/____/2012
PPHO 8
Controle integrado
de pragas
Código: PPHO 8
Revisão: 10/08/2012
Página: 67
1. Objetivos
Estabelecer uma sistemática para:
- assegurar um controle integrado e eficiente de pragas, prevenindo a
contaminação dos ingredientes, matéria-prima e produto final.
- evitar a proliferação de pragas nas demais instalações da empresa.
2. Campo de aplicação
Este procedimento aplica-se a todas as áreas internas e externas da
empresa.
3. Definições
Para a utilização deste procedimento são necessárias as seguintes
definições:
- Praga: todo agente animal ou vegetal que possa ocasionar danos
materiais ou contaminações que comprometam direta ou indiretamente a
qualidade do produto final.
- Iscas: objetos em que são colocados produtos específicos para atraírem
insetos e outros animais.
- Controle integrado: seleção de métodos de controle e desenvolvimento de
critérios que garantam resultados favoráveis sob o ponto de vista higiênico,
ecológico e econômico.
Revisado por: Data:____/____/2012
4. Responsabilidades
- O encarregado do setor é responsável por implantar, acompanhar e
assegurar o cumprimento deste procedimento.
- O gerente da empresa é responsável por autorizar formalmente a
execução dos serviços de desinsetização e desratização na empresa.
- O gerente da empresa é responsável por designar uma pessoa para
acompanhar os serviços de desinsetização e desratização.
- Todos os colaboradores são responsáveis por informar o responsável pelo
setor sobre qualquer indício de existência de pragas.
5. Descrição
5.1 Controle de instalações para evitar a entrada de insetos e
roedores
O colaborador responsável pela atividade de manutenção avalia as
condições das portas, janelas, telas e ralos.
5.2 Controle dos resíduos
- A empresa possui um programa de limpeza e sanitização de
equipamentos, utensílios e instalações (PPHO 2).
- Os resíduos produzidos são coletados e armazenados em lixeiras até sua
remoção. Na área interna da produção, a limpeza das lixeiras é diária e o
material é armazenado em local apropriado até o dia da coleta semanal dos
resíduos de acordo com o descrito no PPHO 2.
- Caixas de descarte de materiais perfurocortantes estão dispostas na área
interna (laboratório) e na área externa (nos locais onde são utilizados).
- O material biológico proveniente da área externa é armazenado em
recipientes plásticos específicos. Estes recipientes e as caixas de descarte
Revisado por: Data:____/____/2012
de material perfurocortante são recolhidos mensalmente por empresa
terceirizada.
- O lixo comum coletado nas lixeiras da área de produção, residências dos
funcionários, refeitório, logística e administração é recolhido três vezes por
semana por um funcionário da ABS usando trator e reboque para seu
transporte ao depósito de lixo.
- O depósito de lixo é esvaziado duas vezes por semana pelo serviço de
coleta de lixo da prefeitura do município.
5.3 Controle do ambiente
- Os colaboradores responsáveis pela manutenção avaliam as condições
externas da empresa quanto à presença de animais domésticos, acúmulo de
folhas, vegetação muito crescida, tomando as medidas cabíveis ou
comunicando os responsáveis para adequação.
5.4 Controles relacionados à empresa terceirizada
- Por ocasião da implantação do APPCC e após cada monitoração a empresa
terceirizada elaborará um relatório indicando os pontos de maior
vulnerabilidade da unidade que estejam favorecendo o acesso, abrigo e o
fornecimento de alimento às pragas.
- A empresa terceirizada realiza serviços de desinsetização e desratização
conforme frequência definida no contrato.
- A empresa contratada apresenta os seguintes documentos para consulta e
conhecimento:
Relação das áreas onde são realizados os serviços;
Produtos químicos utilizados, forma de aplicação e os antídotos
recomendados;
Revisado por: Data:____/____/2012
Nível de toxidade adequado a área de aplicação (baixa toxidade
nas áreas internas, estocagem, escritórios, vestiários e refeitório);
- Após a aplicação dos produtos químicos, a empresa terceirizada fornece os
seguintes dados sobre os serviços:
Certificado identificando os serviços prestados e as áreas onde estes
foram executados;
Produtos utilizados, composição química e forma de aplicação
(concentração e método);
Mapa de localização dos pontos onde foram colocadas as iscas
numeradas.
6. Monitoração
6.1 Controle de instalações para evitar a entrada de insetos e
roedores
Através da observação visual realizada durante as auditorias internas com
auxílio do check list e, através de auditoria realizada por empresa
responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
6.2 Controle dos resíduos
Através da observação visual realizada durante as auditorias internas com
auxílio do check list e, através de auditoria realizada por empresa
responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
Revisado por: Data:____/____/2012
6.3 Controle do ambiente
Através da observação visual realizada durante as auditorias internas com
auxílio do check list e, através de auditoria realizada por empresa
responsável pelo plano APPCC.
Frequência: a cada dois meses pela gerência e semestralmente por
empresa responsável.
6.4 Controles relacionados à empresa terceirizada
A empresa terceirizada é monitorada quanto a eficiência no controle das
pragas através do resultado das auditorias internas.
7. Ações corretivas
7.1 Controle de instalações para evitar a entrada de insetos e
roedores
Contatar o colaborador responsável por essa atividade quando evidenciado
problema na manutenção das barreiras físicas.
7.2 Controle dos resíduos
Contatar os colaboradores responsáveis pela atividade de coleta dos
resíduos quando evidenciado acúmulo por atraso em sua remoção. Havendo
atraso na remoção dos resíduos do depósito de lixo, contatar a secretaria
do muncípio.
7.3 Controle do ambiente
Contatar os responsáveis de cada setor quando evidenciado problema na
manutenção da área externa.
Revisado por: Data:____/____/2012
7.4 Controle relacionado à empresa terceirizada
Contatar os responsáveis para que seja realizado o ajuste, caso não seja
possível, buscar nova empresa com capacidade de prestar o serviço
requerido.
Revisado por: Data:____/____/2012
ANEXO 5 – Laudo de sanitização e higienização das caixas d’água
Revisado por: Data:____/____/2012
Revisado por: Data:____/____/2012
ANEXO 6 – Laudo da análise físico-química e bacteriológica da água
Revisado por: Data:____/____/2012
ANEXO 7 – Check list
ROTEIRO DE AUDITORIA INTERNA DE ESTABELECIMENTO
PRODUTOR DE SÊMEN BOVINO
1. Identificação do Estabelecimento 1.1 Razão Social: ABS Pecplan 1.2 Endereço: BR 050 Km 196 1.3 Município-UF: Delta-MG 1.4 Responsável Técnico: Fernando Vilela Vieira 1.5 CRMV-UF: 3466 -MG
2. Informações sobre a auditoria 2.1 Auditor Líder: 2.2 Data: 2.3 Data da última auditoria: 2.4 Objetivo da auditoria:
UNIDADE INTERNA
LABORATÓRIO S / N
1. O laboratório é mantido limpo e organizado?
2. Os equipamentos estão sendo operados conforme descrição anexada aos mesmos?
3. As planilhas de monitorização estão sendo preenchidas?
4. O funcionário responsável pela verificação das planilhas de monitorização está o fazendo?
OBSERVAÇÕES
SALA DE LAVAGEM DOS UTENSÍLIOS E ESTERILIZAÇÃO DA VIDRARIA S / N
5. As condições de higiene e manutenção da sala são adequadas?
6. A vidraria está sendo lavada e esterilizada conforme descrito?
7. Os tubos de coleta estão sendo lavados e esterilizados na autoclave conforme
descrito no manual?
Revisado por: Data:____/____/2012
8. A água deionizada utilizada para enxágue dos materiais após lavagem
está sendo descartada e reposta diariamente?
OBSERVAÇÕES
SALA DA AUTOCLAVE E DE DESTILAÇÃO/DEIONIZAÇÃO DA ÁGUA S / N
9. As condições de higiene e manutenção da sala são adequadas?
10. Os procedimentos para destilização/deionização e esterilização são aplicados?
OBSERVAÇÕES
SALA DE AVALIAÇÃO DE SÊMEN S / N
11. As condições de higiene e manutenção da sala são adequadas?
OBSERVAÇÕES
UNIDADE EXTERNA
PIQUETES DOS TOUROS S / N
12. Os abrigos e os piquetes dos touros são mantidos limpos?
13. Os abrigos dos touros são desinfetados semanalmente?
14. As planilhas de monitorização estão sendo preenchidas?
OBSERVAÇÕES
Revisado por: Data:____/____/2012
ENFERMARIA S / N
15. A enfermaria é mantida limpa e organizada?
16. O curral é desinfetado assim que o touro sai da enfermaria?
17. As planilhas de monitorização da limpeza e desinfecção estão sendo
preenchidas?
OBSERVAÇÕES
ÁREA DO TRONCO DE CONTENÇÃO E ÁREA COBERTA DE COLETA S / N
18. O tronco de contenção é mantido limpo e organizado?
19. A área do tronco e adjacências é desinfetada diariamente?
20. s armários na área do tronco estão sendo limpos a cada quinze dias?
21. O arquivo de monitoramento da limpeza dos armários existentes na área do
tronco de contenção esta sendo mantido atualizado?
22. A área coberta de coleta é limpa diariamente e a maravalha reposta?
23. A área coberta de coleta está sendo completamente limpa, desinfetada e
recebendo nova cama de maravalha a cada dois meses?
24. As planilhas de monitorização da limpeza e desinfecção estão sendo
preenchidas?
OBSERVAÇÕES
ÁREAS DO TRONCO HIDRÁULICO / PEDILÚVIO / BALANÇA S / N
Revisado por: Data:____/____/2012
25. A área do tronco hidráulico é mantida limpa e organizada?
26. A lavagem e higienização da área do tronco hidráulico está sendo realizada
mensalmente?
27. As áreas do pedilúvio e balança para pesagem dos touros são mantidas limpas?
28. A solução do pedilúvio está sendo trocada semanalmente?
29. A farmácia está sendo limpa e organizada semanalmente?
30. A geladeira da farmácia está sendo limpa mensalmente?
31. O almoxarifado está sendo limpo e organizado mensalmente?
32. As planilhas de monitorização de limpeza e higienização e troca de solução do
pedilúvio estão sendo preenchidas?
OBSERVAÇÕES
LABORATÓRIO DE APOIO SANITÁRIO / SALA DE REUNIÃO = VETERINÁRIO S / N
33. O laboratório de apoio sanitário está sendo limpo e higienizado semanalmente?
34. A geladeira do laboratório de apoio sanitário está sendo limpa mensalmente?
35. A sala de reunião/Veterinário é mantida limpa?
36. As planilhas de monitorização de limpeza e higienização estão sendo
preenchidas?
OBSERVAÇÕES
Revisado por: Data:____/____/2012
HIGIENIZAÇÃO DOS MANEQUINS / LAVAGEM DE PREPÚCIO S / N
37. A higienização dos manequins está sendo realizada com a pulverização de
aproximadamente 500 Ml da solução desinfetante?
38. Está sendo realizada a higienização dos manequins entre cada coleta de sêmen?
39. A lavagem do prepúcio dos touros está sendo realizada imediatamente antes da
coleta de sêmen?
40. A lavagem do prepúcio dos touros está sendo realizada com água e detergente
neutro externamente e solução salina internamente?
41. O prepúcio dos touros esta sendo secado com papel toalha após a lavagem?
42. O recipiente da solução salina está sendo retirado da área do tronco e guardado
diariamente na sala de preparação de material de coleta?
43. A solução salina concentrada está sendo armazenada na geladeira e sendo
diluída somente no momento de sua utilização?
OBSERVAÇÕES
SALA DE PREPARAÇÃO DE MATERIAL PARA COLETA S / N
44. O funcionário responsável pela higienização e montagem das vaginas artificiais
está realizando a troca de uniforme previamente ao ínício da atividade?
45. As vaginas artificiais e os cones estão sendo mantidos durante 15 minutos em
solução desinfetante?
46. As vaginas artificiais e os cones estão sendo enxaguados em água destilada
após permanecerem na solução desinfetante?
47. As capas das vaginas artificiais estão sendo lavadas diariamente ao final da
rotina de coleta de sêmen?
Revisado por: Data:____/____/2012
48. A sala é limpa diariamente após o término da rotina de coleta de sêmen
e lavagem das vaginas artificiais?
49. A sala bem como as bancadas, armários e as estufas estão sendo organizados e
higienizadas semanalmente com registro dessa atividade?
50. O funcionário responsável pela verificação das planilhas de monitorização
da área externa está o fazendo?
OBSERVAÇÕES
RODOLÚVIO E QUARENTENÁRIO S / N
51. O rodolúvio é mantido limpo, com os sensores funcionando e com desinfetante
freqüentemente reposto?
52. A entrada no quarentenário está sendo feita apenas pelo vestiário, com troca de
uniforme antes de iniciar a rotina?
53. O corredor central do quarentenário é desinfetado diariamente?
54. As cordas e cabrestos são lavados e desinfetados a cada troca de touro?
55. Os utensílios e equipamentos do quarentenário são de uso exclusivo dessa
unidade?
56. O quarentenário é mantido limpo e organizado?
57. O funcionário está tomando banho na saída do quarentenário?
58. As planilhas de monitorização estão sendo preenchidas?
OBSERVAÇÕES
Auditor Líder
Fernando Vilela Vieira
Responsável Técnico
Revisado por: Data:____/____/2012
ANEXO 8 – Cartaz indicando como lavar suas mãos
Revisado por: Data:____/____/2012
PROCEDIMENTO
OPERACIONAL
PADRONIZADO (POP)
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
AUTOCLAVE
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Esterilização de materiais (calor úmido)
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Abrir a tampa e verificar a qualidade (troca semanal) e o nível
de água destilada (deve cobrir a resistência ficando abaixo do nível do suporte de descanso do cesto);
Introduzir o material no cesto (mais leves acima);
Fechar a tampa apertando os manipuladores por igual;
Ligar a chave comutadora no calor máximo (MAX) mantendo o
registro de liberação de vapor fechado;
Atingida a pressão de trabalho (1 atm e 121°C), girar a chave comutadora para calor médio (MED);
Iniciar a contagem de tempo para esterilização (20 minutos);
Terminado o tempo, desligar a chave comutadora;
Abrir o registro de liberação do vapor, soltando os manipuladores somente após o manômetro marcar ZERO;
Abrir a tampa tomando cuidado para evitar queimaduras pelo
vapor;
Retirar o material após estar frio, transferindo-o para estufa
de secagem.
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma das etapas não seja
cumprida;
Caso os valores desejados sejam ultrapassados (pressão = ou > 1 atm e temperatura = ou > 121°C), mudar chave
comutadora para calor mínimo (MÍN) e regular a válvula de segurança.
ACÃO PREVENTIVA
Revisão da borracha de vedação, regulagem da válvula de segurança e da rotina de utilização;
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Planilha para controle da limpeza e troca da água da autoclave:
Data Responsável Observação
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
BALANÇA ANALÍTICA DE PRECISÃO
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Pesar componentes do diluente e da
solução salina.
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Aferir o nivelamento da balança;
Conectar a balança a rede elétrica e pressionar a tecla
Liga/Desliga;
Antes da pesagem, aguardar a estabilização do sistema (30 minutos);
Colocar o recipiente para pesagem sobre o prato da balança e em seguida pressionar a tecla TARA;
Pesar o constituinte necessário repetindo a operação (tara) a cada troca de recipiente;
Após a utilização, desligar a balança pressionando a tecla
Liga/Desliga e desconectar a balança da rede elétrica;
Remover resquícios de material que tenha caído no interior da
região de pesagem usando um pincel (movimentos suaves);
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma das etapas não seja
cumprida;
Em caso de aderência do material, remover o prato da balança e efetuar sua limpeza com gaze e álcool 70%.
ACÃO PREVENTIVA
Revisão do equipamento através da rotina de utilização e calibração semanal utilizando-se o peso padrão. Apresentando
desvio em relação ao padrão, acionar a assistência técnica;
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através das planilhas de limpeza e calibração semanal.
Planilha de limpeza e calibração da Balança Analítica de Precisão:
Data Responsável Atividade
Observação Limpeza Calibração
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
BALANÇA ELETRÔNICA
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Pesagem dos touros
RESPONSÁVEL: Funcionário da área externa
ATIVIDADES
Posicionar as barras de pesagem niveladas ao solo e alinhadas a plataforma de pesagem;
Colocar a plataforma sobre as barras nos devidos pontos de
apoio;
Ligar os cabos na conexão “BARRA” tomando cuidado para
que não haja falha no contato;
Conectar o equipamento a rede elétrica e pressionar a tecla “LIGA”;
Aguardar a rotina de calibração automática, leitura 0 kg no display e acendimento da luz vermelha. Caso a leitura seja
diferente de zero, pressionar a tecla “TARA” até que a leitura seja 0 Kg;
Para iniciar o uso, assim que o animal estiver sobre a
plataforma digitar sua identificação e pressionar a tecla “PESA” para que o resultado seja gravado no display;
Entre cada pesagem pressionar a tecla “LIMPA” ou a tecla “ZERO” para que a tara seja ajustada e o novo resultado seja
gravado;
Após o uso, desligar a balança pressionando a tecla “DESLIGA”, desconectar o equipamento da rede elétrica e em
seguida desconectar os cabos das barras;
Limpar a plataforma de pesagem.
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma das etapas não seja cumprida;
Enviar a balança para revisão no caso de erros de leitura ou qualquer alteração de funcionamento.
ACÃO PREVENTIVA
Revisão da tara do equipamento, da rotina de utilização e calibração.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Planilhas de utilização, limpeza e calibração da balança para pesagem dos touros.
Data Responsável Atividade (X)
Observação Pesagem Limpeza Calibração
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
BALANÇA PARA PESAGEM DO SÊMEN
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Pesagem dos ejaculados
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Verificar o nivelamento da balança e conectar a balança a rede elétrica;
Ligar o equipamento pressionando a tecla Liga/Deliga e aguardar a estabilização do sistema (30 min);
Calibrar o equipamento para pesar apenas o ejaculado
mediante a colocação de um tubo de coleta vazio (peso = 19g) na balança e em seguida pressionar a tecla TARA;
Retirar o tubo de calibração verificando a leitura de -19g no display = balança pronta para uso.
Ao final da utilização, desligar o equipamento pressionando a
tecla Liga/Desliga, desconectar o equipamento da rede elétrica e efetuar a limpeza com gaze embebida em álcool
70%.
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma amostra derrame na
balança e retornar o uso somente após limpeza e reinício de todo processo.
ACÃO PREVENTIVA
Revisão do equipamento através de checagem diária da TARA e calibração semanal utilizando-se o peso padrão. Apresentando desvio em relação ao padrão, acionar a
assistência técnica.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através das planilhas de checagem diária da TARA e calibração semanal.
Planilha de utilização, limpeza e calibração da Balança para Pesagem do Sêmen :
Data Responsável Atividade (X)
Observação Pesagem Limpeza Calibração
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
BALCÃO REFRIGERADO
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Resfriamento do sêmen, envase e
identificação das palhetas.
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Ligar o equipamento a rede elétrica;
Fechar as janelas de vidro do equipamento;
Ligar os ventiladores, as lâmpadas e o compressor;
Aguardar a estabilização em 9°C no interior da caixa de isopor
e 4-5°C na área de envase (em aproximadamente 30min);
Introduzir as amostras a serem refrigeradas;
Após o uso, desligar o compressor, os ventiladores, as lâmpadas e desconectar o equipamento da rede elétrica;
Abrir as janelas do equipamento e efetuar sua limpeza com
papel toalha e álcool 70%.
AÇÃO CORRETIVA
Aferir e ajustar a temperatura do equipamento na faixa
desejada.
ACÃO PREVENTIVA
Checagem do equipamento dentro da rotina de utilização;
Checagem diária da temperatura;
Calibragem do sensor de temperatura e checagem do gás do
compressor anualmente.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Planilhas de checagem diária da temperatura; limpeza mensal e calibragem e checagem anual do gás.
Data Responsável
Aferição da temperatura
Limpeza Calibração / gás Observação Início da
curva
Final da
curva
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
BANHO-MARIA
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: descongelamento de amostras de
sêmen e aquecimento de soluções.
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Abastecer o equipamento com água até que a grade do fundo
fique ± 5 cm abaixo do nível;
Conectar o equipamento a rede elétrica;
Ligar o equipamento pressionando a chave LIGA/DESLIGA;
Aguardar o aquecimento até a temperatura de trabalho (37°C);
Após o uso, desligar o equipamento pressionando a tecla LIGA/DESLIGA, desconectar o equipamento da rede elétrica e drenar a água;
Secar o equipamento e passar papel toalha com álcool 70%.
AÇÃO CORRETIVA
Ajustar a temperatura caso a leitura no termômetro seja
diferente de 37°C.
ACÃO PREVENTIVA
Conferir a temperatura da água mediante o uso de
termômetro calibrado;
Revisão do equipamento e da rotina de utilização.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através da planilha de limpeza e rotina de utilização.
Data Responsável Atividade (X)
Calibração Observação
Utilização Limpeza
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
COLETA DE SÊMEN
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Coletar sêmen bovino
RESPONSÁVEL: Funcionário coletor de sêmen
ATIVIDADES
Tomar conhecimento da relação de touros a ser coletados (lista de touros do dia);
Providenciar que as vacas manequins sejam encaminhadas e contidas nas proximidades da área de coleta;
Providenciar que os touros da lista sejam encaminhados e
contidos nas proximidades da área de coleta;
Posicionar e efetuar a limpeza (pulverização com solução a
1:4000 de amônia quaternária) da região posterior dos manequins antes da coleta de cada touro;
Imediatamente antes da coleta, efetuar a limpeza do prepúcio
do touro;
Usando luvas, lavar o prepúcio do touro externamente com
água corrente e detergente neutro para remover quaisquer sujidades;
Lavar o prepúcio do touro internamente mediante o uso de
solução fisiológica. Essa solução será introduzida no prepúcio através de uma pipeta plástica descartável conectada a um
frasco de 50 mL. Após a inserção da pipeta, o óstio prepucial será fechado para que a solução fique retida permitindo a limpeza do pênis e prepúcio durante breve massageamento
seguido da drenagem do líquido;
Solicitar ao auxiliar que encaminhe o touro até a manequim na
área de coleta (área externa – touros zebuínos e área coberta – touros europeus) e permitir que realize dois saltos sem
coleta;
Retirar as luvas, lavar as mãos com água e sabão, secar com papel toalha e passar álcool gel 70%;
Preparar a vagina artificial (VA) na sala de preparação: colocar água quente, conectar o tubo de coleta, o protetor do
tubo e a capa da vagina, passar o lubrificante e em seguida aferir a temperatura da VA (deve estar entre 42-44°C);
Calçar luvas e seguir para a sala de coleta onde será feito
desvio do pênis e o oferecimento da VA para que o touro ejacule;
Coletado o sêmen, o coletador deve se dirigir para o óculo do laboratório para entrega do tubo de coleta. Nesse momento o
Revisado por: Data:____/____/2012
coletador deverá se identificar e informar o nome do touro e o
número do ejaculado (1 ou 2);
Levar a VA para a sala de preparação onde deverá ser
enxaguada em água corrente e a seguir desmontada parcialmente (retirando o cone e soltando as tiras de um lado da mucosa). A VA será deixada de molho em água e
detergente neutro, seguindo recomendação do fabricante, até o momento de sua lavagem ao final da rotina de coleta (ver
POP lavagem da VA);
Ao final da rotina de coleta lavar a capa da VA e os protetores de tubo de coleta. Estes materiais serão lavados com escova e
detergente neutro, enxaguados em água corrente e deixados de molho em solução de Kilol a 0,9% por 15 minutos antes de
serem colocados para secar.
AÇÃO CORRETIVA
O responsável pela coleta deverá avisar ao funcionário que
não cumprir qualquer uma das etapas que deverá iniciar novamente a tarefa.
ACÃO PREVENTIVA
Revisar o processo de coleta caso algum passo esteja apresentando dificuldades de ser cumprido;
Higienizar o touro somente no momento da coleta diminuindo assim a carga contaminante no sêmen;
Usar sempre luvas ao trabalhar com o material biológico
evitando contaminação do pessoal e do sêmen;
Comunicar ao responsável pela área de coleta qualquer
anormalidade observada no touro ou na amostra de sêmen;
MONITORAMENTO
Através do acompanhamento da atividade de coleta pelo
responsável chamando a atenção de todos para o cumprimento das etapas estabelecidas no POP;
Preenchimento da planilha da coleta, identificando o touro,
coletador e horário.
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
CONTAINER DE NITROGÊNIO LÍQUIDO DA MÁQUINA DE
CONGELAMENTO DE SÊMEN
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Abastecer o container com nitrogênio
líquido (N2L) para utilização no congelamento.
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Antes de iniciar o abastecimento garantir que o manômetro esteja na posição 0;
Para abastecer, ligar o exaustor e conectar o tubo de N2L na válvula (entrada e saída) do container;
Controlar a abertura das válvulas de regulagem para não
ultrapassar 3 atm de pressão. No momento que sair N2L na válvula de escape o container estará cheio;
Fechar as válvulas de entrada e saída N2L e de escape de pressão;
Manter a pressão do container em 2,5 atm (ideal para o
congelamento).
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma das etapas não seja cumprida;
Caso a pressão alcance 3 atm de pressão, fechar a válvula de
entrada e saída de N2L e abrir a válvula de escape até que atinja 2,5 atm.
ACÃO PREVENTIVA
Revisão e manutenção do equipamento em caso de vazamento;
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Planilha de limpeza e utilização do equipamento.
Data Nome Atividade (X)
Manutenção Observação Utilização Limpeza
Revisado por: Data:____/____/2012
CONTROLE DE PULVERIZAÇÃO para controle de moscas
Data da pulverização Local Funcionário
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
DEIONIZADOR DE ÁGUA
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Eliminar sais inorgânicos da água usada
na limpeza de material e preparação de meios;
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Abrir o registro da água da rede de abastecimento de modo
que o fluxo de entrada e saída na torneira na célula
condutivimétrica se estabilizem evitando que o equipamento
transborde;
Conectar o equipamento a rede elétrica e acionar a tecla
LIGA/DESLIGA;
Iniciar a coleta da água no barrilete específico somente após o
acendimento da lâmpada piloto verde da célula
condutivimétrica;
Ao final do uso, fechar o registro de água, pressionar a tecla
LIGA/DESLIGA para desligar e desconectar o equipamento da
rede elétrica;
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma das etapas não seja
cumprida;
Não coletar a água caso a lâmpada piloto vermelha da célula
condutivimétrica esteja acesa;
ACÃO PREVENTIVA
Trocar a coluna de resina quando estiver próximo de
completar o ciclo de rendimento (900 litros);
Na troca do filtro de carvão ativado e/ou da coluna
deionizadora, abrir a torneira de saída localizada na célula
condutivimétrica para eliminar os traços da solução ativadora
das resinas de troca iônica (que falsamente indicam saturação
da coluna deionizadora);
Sempre que o deionizador ficar por mais de 10 dias sem uso,
ao reativá-lo desprezar a água contida dentro da carcaça,
Revisado por: Data:____/____/2012
retirando a coluna deionizadora e esvaziando o conteúdo
sobre uma pia. Depois, reinicie o processo de deionização
normalmente;
Limpeza interna e externa da coluna e barrilete: pano limpo
embebido em álcool 70%.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Planilha de utilização, limpeza, troca da coluna de resina e do carvão ativado.
Data Nome
Atividade (X) Troca (X)
Observação Utilização Limpeza
(int.= I; ext. =
E)
Coluna Filtro de carvão
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
DESTILADOR DE ÁGUA
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Destilar água
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Abrir o registro da água da rede de abastecimento de modo a gerar um fluxo de água pela válvula de escape;
Ligar a chave disjuntora da rede elétrica;
Acompanhar o início da destilação regulando o fluxo de vazão e temperatura da água que sai pela válvula de escape em
relação ao fluxo de água destilada;
Ao final do uso desligar a chave disjuntora e somente após
alguns minutos fechar o registro de água para que ocorra o resfriamento do equipamento.
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma das etapas não seja cumprida;
Caso ocorra transbordamento de água da caldeira do
destilador deve-se reduzir a vazão do registro de entrada;
Caso a água de escape esteja muito quente deve-se aumentar
a vazão do registro de entrada para evitar perda de eficiência de destilação e superaquecimento do equipamento (provocará o desligamento do sistema).
ACÃO PREVENTIVA
Limpeza da caldeira e remoção de sais aderidos a resistência de aquecimento da caldeira do destilador.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através da planilha de utilização e limpeza.
Data Nome Utilização Limpeza Observação
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
DILUIDOR AUTOMÁTICO DE SÊMEN
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: diluição de amostras para determinação
da concentração espermática no ejaculado.
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Preparar as palhetas previamente cortando a extremidade que possui algodão;
Conectar o equipamento a rede elétrica através de um estabilizador de tensão;
Ligar o equipamento pressionando a tecla POWER;
Posicionar uma palheta fina e o frasco com solução salina (NaCL 0,9%) nos locais indicados;
Selecionar o programa “Método Bovino”, pressionando a tecla 2 vezes para confirmar;
Para usar, executar o comando de aspiração de salina na
palheta (primeiro toque no pedal de acionamento) e em seguida posicionar a amostra de sêmen em contato com a
palheta e executar o comando de aspiração da amostra (segundo toque no pedal de acionamento);
Para determinar a concentração, executar o comando de liberação da amostra diluída na cubeta do fotômetro (terceiro toque no pedal de acionamento);
Colocar a cubeta com a amostra no fotômetro para leitura;
Repetir os passos trocando a palheta a cada amostra;
Ao final do uso, desligar o aparelho pressionando a tecla POWER e desconectar o estabilizador da rede elétrica;
Limpar o equipamento externamente com pano umedecido
com álcool 70%.
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso a palheta não seja
completamente preenchida ou alguma das etapas não seja cumprida;
ACÃO PREVENTIVA
Revisado por: Data:____/____/2012
Revisão do equipamento e da rotina de utilização;
Calibração semanal do equipamento com a utilização das cubetas próprias. Mensalmente realizar avaliação da
concentração de 5 touros na câmara de Neubauer e comparar o resultado com a avaliação do fotômetro. Havendo desvio no resultado das 5 amostras a assistência técnica deverá ser
chamada.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através das planilhas da rotina de utilização e calibração semanal do equipamento.
Data Nome Atividade (X)
Observação Utilização Calibração
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
ENVASE E IDENTIFICAÇÃO
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Envase do sêmen e identificação das
palhetas
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Recolocar a bigorna em sua posição;
Conectar a rede elétrica ao nobreak e pressionar a tecla LIGA/DESLIGA, ligar o sistema integrado, o computador e o monitor (nessa ordem);
Para iniciar o sistema, pressionar a tecla RESET do sistema integrado;
Para iniciar o computador, pressionar a tecla F2 do teclado (indicar USUÁRIO e SENHA);
Abrir o programa da máquina de envase - IS4 (indicar
CODE/PASSWORD);
Corrigir a data e horário do computador;
Lavar o canhão laser da impressora com metil etil cetona secando em seguida com papel toalha seguido de jatos de ar
produzidos com uma pera;
Abrir o registro da tinta (meia volta no sentido horário);
Ligar a máquina de impressão – clicar em PRINTING-IMAJE
S7 START e confirmar;
Aguardar a tinta sair no canhão cobrindo-o em seguida com a
tampa de proteção;
Clicar em PRINTING e selecionar o programa IS4-MEDIUM;
Conectar o distribuidor de palhetas (máximo 2000 palhetas);
Posicionar o recipiente de acrílico, usado para colocar a amostra a ser envasada, ao lado da máquina de envase;
Acoplar as quatro agulhas com os tubos de sucção posicionados de forma centralizada e de modo que permitam a aspiração de todo o sêmen do recipiente;
Homogeneizar o sêmen a ser envasado antes de depositá-lo no recipiente de acrílico para aspiração;
Selecionar o nome do touro;
Selecionar o formato de impressão (FORMAT – MÉDIO). Touros com nome composto usar o formato ABS;
Selecionar o número de palhetas (QUANTITY TO PRINT);
Revisado por: Data:____/____/2012
Selecionar a velocidade de impressão em 1100 (mm/s) (PRINTING SPREED);
Para iniciar, clicar em GO;
Concluído o número de palhetas da amostra do touro, clicar na tecla Espaço;
Substituir agulhas com os tubos e recipiente de envase para reiniciar com nova amostra;
Repetir o passo de seleção do nome do touro e iniciar novamente;
Encerrado a rotina de envase, clicar em PRINTING – IMAJE S7
– STOP para desligar a impressora e, INICIAR – DESLIGAR para desligar a máquina de envase;
Retirar e lavar a bigorna com água e sabão neutro, deixando-a secando para uso no dia seguinte;
Limpar a máquina externamente com papel toalha embebido em álcool 70%.
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma das etapas não seja cumprida;
Em caso de paralisação da impressão, verificar indicação da
falha no display (falta de tinta, falta de palheta, falta de sêmen ou palheta trancada). Após resolução do problema,
clicar no Y para reiniciar o processo;
Em caso de impressão borrada, desligar a máquina e lavar novamente o canhão da impressora com metil etil cetona,
secar e reiniciar o processo;
ACÃO PREVENTIVA
Controlar os níveis dos cartuchos de solvente e tinta.
Checar diariamente o volume envasado e a qualidade de impressão nas palhetas;
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Planilha de utilização e revisão do equipamento.
Data Nome
Atividade (X)
Calibração Observação Utilização
Abastecimento
da tinta
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
ESTUFA DE AQUECIMENTO DAS VAGINAS ARTIFICIAIS
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Aquecimento das vaginas utilizadas na
coleta de sêmen.
RESPONSÁVEL: Funcionário responsável pela lavagem das vaginas
artificiais
ATIVIDADES
Borrifar álcool 70% e secar com papel toalha previamente a
colocação das vaginas artificiais montadas;
Conectar o equipamento a rede elétrica e ligar acionando o
botão LIGA/DESLIGA;
Ajustar o termostato em 37°C;
Desligar o equipamento em caso de paralisação nas atividades
de coleta.
AÇÃO CORRETIVA
Ajustar a temperatura caso não esteja adequada.
Enviar o equipamento para manutenção caso não esteja aquecendo ou aquecendo de forma controlada.
ACÃO PREVENTIVA
Aferir diariamente a temperatura interna com auxílio de termômetro de máxima e mínima calibrado.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através das planilhas de checagem diária da temperatura, limpeza do equipamento e da rotina de
utilização.
Data Nome
Atividade (X)
Observação / Calibração Temperatura Limpeza
Máx Mín
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
ESTUFA DE AQUECIMENTO DE MATERIAL
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Aquecimento de lâminas utilizadas para
avaliação de sêmen e do diluente utilizado na pré-diluição das
amostras.
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Conectar o equipamento à rede elétrica e ligar pressionando o
botão LIGA/DESLIGA;
Regular o termostato de modo a manter a temperatura em 35°C;
Carregar o equipamento com o material a ser utilizado na avaliação de sêmen e aguardar que atinja a temperatura de
35°C;
Ao final do uso (depois de concluída a rotina de coleta e avaliação de sêmen), desligar o equipamento e efetuar a
limpeza com álcool 70% e papel toalha.
AÇÃO CORRETIVA
Ajustar a temperatura caso não esteja adequada.
Enviar o equipamento para manutenção caso não esteja aquecendo ou aquecendo de forma controlada.
ACÃO PREVENTIVA
Aferir diariamente a temperatura interna com auxílio de termômetro de máxima e mínima calibrado.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através das planilhas de checagem diária da temperatura, limpeza e calibração do equipamento.
Data Nome
Atividade (X)
Observação / Calibração Temperatura Limpeza
Máx Mín
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
ESTUFA DE SECAGEM DE MATERIAL
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Secagem de material
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Conectar o equipamento à rede elétrica e ligar pressionando o botão LIGA/DESLIGA. “Este equipamento deve permanecer
ligado permanentemente a não ser em caso de limpeza e períodos de feriado coletivo”;
Ajustar o termostato em 50°C;
Carregar com material embalado submetido a autoclavagem ou material molhado não embalado, posicionando-os de modo
a favorecer a evaporação da água (boca para cima);
Remover o material após secagem completa antes de nova recarga.
AÇÃO CORRETIVA
Ajustar a temperatura caso não esteja adequada;
Enviar o equipamento para manutenção caso não esteja
aquecendo ou aquecendo de forma controlada.
ACÃO PREVENTIVA
Avaliação semanal da temperatura com auxílio de termômetro
de máxima e mínima;
Remover as prateleiras e limpar o interior da estufa com
álcool 70% e papel toalha para evitar a queda de sujidades no interior do material colocado para secar.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através da planilha de checagem semanal da temperatura, limpeza e calibração do equipamento.
Data Nome
Atividade (X)
Observação / Calibração Temperatura Limpeza
Máx Mín
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
ESTUFA DE SECAGEM E ESTERILIZAÇÃO
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Secagem e esterilização de vidraria e
metais.
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Conectar o equipamento à rede elétrica e ligar pressionando o botão LIGA/DESLIGA;
Ajustar o termostato em 300°C;
Carregar com o material molhado e não embalado mantendo o equipamento ligado por uma hora para que ocorra a secagem;
Desligar o equipamento para resfriamento com a porta fechada;
Retirar o material do equipamento e proceder a embalagem (fechamento);
Carregar com o material embalado mantendo o equipamento
ligado por duas horas para que atinja a temperatura de esterilização (150°C);
Desligar o equipamento para resfriamento com a porta fechada;
Remover o material esterilizado e guardar em local adequado;
Passar gaze embebida em álcool 70% sempre que esvaziar a estufa.
AÇÃO CORRETIVA
Ajustar a temperatura caso não esteja adequada.
Enviar o equipamento para manutenção caso não esteja
aquecendo ou aquecendo de forma não controlada
ACÃO PREVENTIVA
Aferir diariamente a temperatura interna com auxílio de
termômetro calibrado para certificação de que tenha sido atingida a temperatura de esterilização;
Mensalmente, limpar a estufa internamente para evitar a queda de sujidades no interior dos materiais.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através das planilhas de checagem da temperatura, limpeza e calibração do equipamento.
Data Nome
Atividade (X)
Observação / Calibração Temperatura Limpeza
Máx Mín
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
FOTÔMETRO
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Avaliar a concentração espermática nos
ejaculados.
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Conectar o equipamento à rede elétrica através de Nobreak e ligar pressionando o botão “0/I”;
Apanhar as cubetas e se certificar que estão limpas;
Colocar uma cubeta vazia com a parte transparente posicionada para área de leitura do equipamento;
Pressionar a tecla VAL e configurar o equipamento para determinação da concentração usando as teclas “˄ ˅”;
Após a configuração, colocar uma cubeta com solução salina e pressionar duas vezes a tecla VAL para deixar o equipamento
pronto para uso;
Para determinar a concentração, colocar a cubeta com a
amostra diluída a ser lida e apertar duas vezes a tecla VAL;
O resultado será demonstrado no display do equipamento em 5 segundos;
Repetir a operação entre as amostras;
Ao final da rotina de determinação da concentração das
amostras, desligar o equipamento pressionando a tecla “0/I”.
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma das etapas não seja
cumprida;
Enviar o equipamento para revisão caso não seja possível
obter a calibração.
ACÃO PREVENTIVA
Calibração semanal do equipamento utilizando as cubetas de
calibração;
Revisão do equipamento e da rotina de utilização.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Através das planilhas de limpeza e calibração, como também da rotina de utilização.
Data Nome Atividade (X)
Revisão Observação Limpeza Calibração
Revisado por: Data:____/____/2012
POP – Procedimento Operacional Padrão
MÁQUINA DE CONGELAMENTO
OPERACIONAL
OPERAÇÃO A SER REALIZADA: Congelamento de palhetas de sêmen.
RESPONSÁVEL: Funcionário do laboratório
ATIVIDADES
Conectar o computador a rede elétrica através do transformador/estabilizador e ligar pressionando o botão
“0/I”);
Conectar a máquina de congelamento diretamente a rede elétrica (220 V) e ligar pressionando a tecla ON/OFF;
Abrir o programa “Digit Win 3T” e entrar com as informações de User Code/Password;
Clicar em freezing – Start a freezing – Standard – Start;
Preparar o sensor do termostato localizado no tanque de congelamento, colocando-o no interior de uma palheta de
descarte resfriada a 4°C;
Fechar a tampa do tanque da máquina de congelamento;
Verificar a temperatura do tanque mostrada na máquina de congelamento;
Ligar o circulador de ar clicando Start – FANS – Auto N2L
Manual – clicar em Start no programa;
Quando a temperatura do tanque atingir 4°C soara um alarme;
Desligar o circulador de ar (FANS), abrir a tampa do tanque e carregar com as estantes que contém as palhetas (carga máxima 3300);
Fechar a tampa do tanque e acionar o circulado de ar (FANS);
Acompanhar a curva de resfriamento na tela do monitor (4°a -
155°C em 10 minutos);
Ao final da curva soara um alarme, indicando que deve ser desligado o circulador de ar (FANS);
Após alguns minutos, abrir a tampa do tanque e iniciar a remoção das palhetas das estantes colocando-as diretamente
no N2L tomando cuidado para não misturar amostras de touros diferentes;
Durante a remoção das palhetas das estantes ocorrerá o
reaquecimento do sistema. Quando a temperatura alcançar -135°C deve-se fechar a tampa da máquina e acionar o
circulador de ar (FANS) até que a temperatura caia novamente até -155°C;
Revisado por: Data:____/____/2012
Após a temperatura ser atingida novamente (-155°C), desligar
o circulador de ar (FANS) e aguardar um minuto até abrir a tampa do tanque novamente;
Retomar o procedimento de remoção das palhetas e caso ocorra reaquecimento indesejável, repetir o procedimento de resfriamento novamente;
Para novo congelamento, desligar o programa Auto N2L Manual e acionar o aquecimento (HEAT) e circulação de ar
(FANS) para que a temperatura retorne a 4°C;
No momento que o equipamento retornar a 4°C, desligar o aquecimento (HEAT) e a circulação de ar (FANS);
Abrir a tampa e recarregar o equipamento para reiniciar o processo;
Ao final da rotina de congelamento (final das palhetas), desligar o programa Auto N2L Manual e acionar o aquecimento (HEAT) e circulação de ar (FANS) para que a temperatura
suba até 27°C;
Desligar o computador e a máquina de congelamento;
Abrir a tampa do tanque e remover a palheta do sensor; Secar o tanque com uma toalha e em seguida passar papel toalha
embebido em álcool 70%;
Deixar a tampa do tanque aberto.
AÇÃO CORRETIVA
Interromper o processo caso alguma das etapas não seja cumprida;
Cessar o procedimento caso seja detectado problema em
atingir as temperaturas de congelamento;
Encaminhar o equipamento para revisão caso não seja
possível restabelecer seu funcionamento normal.
ACÃO PREVENTIVA
Aferir a temperatura do interior da máquina de congelamento
mediante o uso de termômetro calibrado;
Revisão da rotina de utilização e calibração do equipamento por empresa certificada;
Descartar as palhetas de sêmen submetidas ao procedimento defeituoso.
Revisado por: Data:____/____/2012
MONITORAMENTO
Planilha de utilização, aferição e revisão/calibração do equipamento.
Data Nome
Atividade (X)
Observação Utilização
Revisão /
calibração