58

บทที่ 3

ผลและวิจารณ

1. การคัดเลือกชนิดของพืชที่มีกิจกรรมเอนไซมทําใหนมจับตัวเปนกอนทําการสกัดเอนไซมจากสวนตาง ๆ (ดอก ใบ ผล เมล็ด หัว และลําตน) ของ

พืชสด 71 ชนิด จาก 18 วงศ ดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอร เขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.9 ภายใตสภาวะเดียวกัน โดยดอกที่ใชในการสกัด ไดแก ดอกขี้เหล็ก ดอกคูน ดอกชงโค และดอกโยทะกา (วงศ Leguminosae-Caesalpiniodeae ) ดอกแค ดอกมะกล่ําตาหนู ดอกมะกล่ําเผือก (วงศ Leguminosae-Papilionoideae) ดอกฉําฉา (วงศ Leguminosae-Minosoideae) ดอกผักคราดหัวแหวน ดอกบานชื่น ดอกดาวเรือง ดอกหญาละออง ดอกหนาด ดอกตีนตุกแก (วงศ Compositae) ดอกสิงหโมรา (วงศ Araceae) ดอกบานไมรูโรย (วงศ Amaranthaceae)

สวนใบที่ใชในการสกัด ไดแก ใบตําลึง (วงศ Cucurbitaceae) ใบชะอม (วงศ Leguminosae-Minosoideae) ใบลําโพง (วงศ Solanaceae) ใบยางนอง (วงศ Moraceae) ใบนมตําเลีย (วงศ Asclepiadaceae)ใบชะมวง (วงศ Gutttiferae)

สวนเนื้อของผลมาใชในการสกัด ไดแก ฟกเขียว แตงกวา บวบหอม มะระ เตาหู (วงศ Cucurbitaceae) มะขามแขก (วงศ Leguminosae-Caesalpiniodeae ) สาเก ขนุน (วงศ Moraceae) มะขามปอม (วงศ Euphorbiaceae) ยอ (วงศ Rubiaceae) พืชที่นําทั้งผลมาใชในการสกัดไดแก มะเขือชนิดตางๆ (วงศ Solanaceae) กระเจี๊ยบ (วงศ Malvaceae )

สวนเมล็ดที่ใชในการสกัดไดแก กระถิน ชงโค โยทะกา (วงศ Leguminosae-Caesalpiniodeae) มะกล่ํา อัญชัน ถั่วลันเตา ถั่วแขก (วงศ Leguminosae-Papilionoideae) ผักฉําฉา มะขามเทศ เนียงนก (วงศ Leguminosae-Minosoideae)

สวนหัวที่ใชในการสกัด ไดแก มันฝรั่ง (วงศ Solanaceae) หัวบุก หัวเผือก (วงศ Araceae) หัวแครอท (วงศ Umbellifere) หัวไชเทา (วงศ Cruciferae) และสวน

59

ลําตนที่ใชในการสกัดไดแก เดหลีใบกลวย (วงศ Araceae) แสดงดังตาราง 5 จากนั้นนําสารสกัดเอนไซมจากของพืชดังกลาว มาทดสอบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน (milk clotting activity) โดยคัดเลือกสารสกัดเอนไซมจากพืชที่ทําใหนมจับตัวเปนกอน (milk clotting time) ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ภายในระยะเวลา 3 ชั่วโมง ผลการสกัดเอนไซมจากพืชพบวา ปริมาณสารสกัดเอนไซมที่ไดมีปริมาตร 12-15 มล./ตัวอยางสด 10 กรัม มีพีเอชอยูในชวง 5.8-6.0 และสารสารสกัดเอนไซมจากพืชที่ทําใหนมจับตัวเปนกอนที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสภายในระยะเวลา 3 ชั่วโมง ไดแก มะเขือพวง (Turkey berry) มะแวง (Sparrow’s brinjal) มะเขือเหลือง (Craib egg plant) มะเขือไขเตา(Egg plant 1) และมะเขือลาย (Egg plant 2) จัดอยูในวงศ Solanaceae และฟกเขียว(Ash gourd) และแตงไท (Musk melon) จัดอยูในวงศ Cucurbitaceae โดยสารสกัดเอนไซมจากพืชวงศ Solanaceae จะมีสีน้ําตาลซึ่งเกิดจากปฏิกิริยาการเกิดสีน้ําตาล (browning reaction) ที่มีเอนไซมเกี่ยวของ ไดแก เอนไซมฟนอเลส (phenolase)พอลิฟนอเลส (polyphenolase) ที่มีในพืชเปนตัวเรงปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารประกอบฟนอล ทําใหเกิดสารสีน้ําตาลที่เรียกวา เมลาโนดิน (melanodin) เมื่อหั่นหรือตัดพืช สวนที่สัมผัสกับอากาศจะมีสีน้ําตาลเกิดขึ้น (มหาวิทยาลัยสุโขทัยธรรมาธิราช, 2539) และเมื่อเติมสารสกัดเอนไซมจากพืชวงศ Solanaceae ลงในน้ํานมทําใหสีของน้ํานมเปลี่ยนจากสีขาวขุนเปนสีน้ําตาลออน สําหรับสารสกัดเอนไซมจากพืชวงศ Cucurbitaceae มีสีขาวขุน-เขียวออน ทั้งนี้เนื่องจากในกระบวนการสกัดไดทําการตัดแตง ทิ้งสวนเปลือกและไส นําสวนเนื้อมาใชในการสกัดและเหวี่ยงแยก ไดสารสกัดเอนไซมใส จะไมมีผลทําใหสีน้ํานมเปลี่ยน เมื่อเติมสารสกัดเอนไซมจากพืชลงในน้ํานม(หางนมรอยละ 12 ในสารละลายแคลเซียมคลอไรดเขมขน 0.01 โมลารพีเอช 6.5) สารละลายผสมที่ไดมีคาพีเอชลดลงเพียงเล็กนอยอยูในชวง 6.3-6.4 เนื่องจากน้ํานมมีสมบัติความเปนบัฟเฟอรที่ดีมีโปรตีนและเกลือโดยเฉพาะเกลือฟอสเฟตเปนตัวปองกันมิใหพีเอชของนมเปลี่ยนแปลงมาก (วัฒนา ประทุมสินธุ, 2534)

ทําการทดสอบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของสารสกัดเอนไซมจากพืชโดยนําเวลาทําใหนมจับตัวเปนกอนของสารสกัดเอนไซมจากพืชมาเปรียบเทียบกับเวลา

60

ทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมเรนนินทางการคา ทําการวัดปริมาณโปรตีนและคํานวณกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนของสารสกัดเอนไซมจากพืช 7 ชนิด ที่คัดเลือกได พบวา สารสกัดเอนไซมจากพืชทั้ง 7 ชนิดมีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนอยูในชวง 0.01-0.02 ยูนิต/ตัวอยาง 1กรัม. ขณะที่เอนไซมเรนนิน ทางการคามีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนสูงถึง 6.25 X 105 ยูนิต/ กรัม แสดงดังตาราง 6 นั่นคือ เอนไซมเรนนินทางการคามีความบริสุทธิ์มากกวาสารสกัดเอนไซมจากพืชหลายเทาเนื่องจากสารสกัดเอนไซมจากพืชที่ไดไมผานกระบวนการทําบริสุทธิ์ทําใหมีสารหลายชนิดปะปนอยู จึงมีความจําเพาะตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนต่ํา

ตาราง 6 ระยะเวลาและกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนของสารสกัดเอนไซมจากพืช 7 ชนิดที่สกัดดวยซิเตรต บัฟเฟอรเขมขน 0.1โมลาร พีเอช 5.9Milk clotting time and specific milk clotting activity of 7 plants enzyme extracted by 0.1 M citrate buffer at pH 5.9

Source of enzyme MCT(min)

MCA(unit/g)

Protein(mg/g)

SMA(unit/ mg protein)

1. Turkey berry2. Sparrow's brinjal3. Craib egg plant4. Egg plant 15. Egg plant 26. Ash gourd7. Musk melon8. Commercial rennin

17.75+0.9614.50+1.2924.00+0.82

137.25+1.50132.00+1.4147.75+2.06

138.00+2.942.25+0.08

1.03+0.051.27+0.110.76+0.030.13+0.000.14+0.000.58+0.030.20+0.001.25 X 106

77.42+3.3052.00+3.8431.59+4.1836.13+2.5238.20+1.1326.52+2.4732.36+1.132.0+0.14

0.01+0.000.02+0.000.02+0.000.00+0.000.00+0.000.02+0.000.01+0.006.25 X 105

Mean + Standard deviation of two replicationEgg plant 1 = Makhuea khait tao , Egg plant 2 = Makhuea Lai, MCT = milk clotting time, MCA = milk clotting activity, SMA = specific milk clotting time

61

2. การคัดเลือกชนิดของสารสกัดที่เหมาะสมจากการคัดเลือกชนิดของพืชที่มีกิจกรรมเอนไซมทําใหนมจับตัวเปนกอน

ภายใน 3 ชั่วโมง พบวา มีพืช 7 ชนิด ไดแก มะเขือพวง มะแวง มะเขือเหลือง มะเขือไขเตา มะเขือลาย ฟกเขียวและแตงไท อยางไรก็ตามความสามารถในการสกัดของสารละลายบัฟเฟอรแตละชนิดอาจมีความแตกตางกัน ขึ้นอยูกับชนิดของเอนไซมที่ตองการและคาคงที่การแตกตัวของกรดออนหรือพีเคเอ (pKa) ของบัฟเฟอรแตละชนิด ดังนั้นจึงทําการศึกษาชนิดของสารสกัดที่เหมาะสม โดยนําพืชทั้ง 7 ชนิดดังกลาว มาสกัดดวยสารละลายบัฟเฟอร 2 ชนิด ที่พีเอชตาง ๆ ไดแก สารละลายซิเตรต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0, 5.9, 6.2 สารละลายอะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช5.0, 5.6 ผลการทดลอง พบวา สารสกัดเอนไซมจากพืชที่สกัดดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 ใหคากิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนสูงกวาสารสกัดเอนไซมจากพืชที่สกัดดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอร เขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.9, 6.2 สารละลายอะซิเตต บัฟเฟอร เขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0, 5.6 และน้ํากลั่น ตามลําดับ โดยสารสกัดเอนไซมจากมะเขือเหลืองและฟกเขียวที่สกัดดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอร เขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 มีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอน (0.04 ยูนิต/โปรตีน 1 มก.) สูงกวาสารสกัดเอนไซมจากมะแวงและมะเขือพวง (0.03 และ 0.02 ยูนิต/โปรตีน 1 มก. ตามลําดับ) ขณะที่สารสกัดเอนไซมจากมะเขือลาย มะเขือไขเตา และแตงไทยมีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนต่ํามาก แสดงดังตาราง 7 ดังนั้นจึงเลือกสารสกัดเอนไซมจากฟกเขียว มะเขือเหลือง มะแวงและมะเขือพวงที่สกัดดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 ในการศึกษาการทําบริสุทธิ์บางสวนของสารสกัดเอนไซมจากพืชตอไป

Gupta และ Eskin (1977) และ Eskin และ Landman (1975) ใชสารละลายอะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.01 โมลาร พีเอช 5.5-5.6 ละลายตะกอนเอนไซมจากฟกเขียวที่ผานการตกตะกอนโปรตีนดวยอะซิโตนเย็น กอนนําไปทําการไดอะไลซิสเปนที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 16-18 ชั่วโมงและทําแหงที่อุณหภูมิจุดเยือกแข็ง ไดปริมาณผลผลิตเอนไซมรอยละ 60 และมีความบริสุทธิ์ 5 เทา

62

Sousa และ Malcata (1998a) และ Tavria และคณะ (2001) ทําการสกัดเอนไซมคารโดซินจากดอกคารโดนแหงดวยชนิดของสารละลายซิเตรต บัฟเฟอร 0.1 โมลาร พีเอช 5.9 และ 5.4 ตามลําดับ เพื่อศึกษาการยอยสลายโปรตีนเคซีนในน้ํานม

Tamer (1993) ทําการสกัดและทําบริสุทธิ์เอนไซมที่ทําใหนมจับตัวเปนกอนจาก เมล็ด ดอก และ ใบของทอเรีย ทีสทิล ดวยสารละลายผสมของสารละลายอะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.05 โมลาร พีเอช 5 แคลเซียมคลอไรดรอยละ 0.75 อีดีทีเอรอยละ 0.13 โพลิไวนิลโพลิไพโรลิโดนรอยละ 0.2 และเบตา-เมอแคปโตเอทานอลรอยละ 0.025 และตกตะกอนโปรตีนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 80 เอนไซมที่ไดมีน้ําหนักโมเลกุล 19–24 กิโลดาลตัน มีคาพีไออยูในชวงพีเอช 3.3 -3.7

65

ตาราง 7 ผลของสารละลายบัฟเฟอร พีเอชตางๆ ตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน ปริมาณโปรตีนและกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนของสารสกัดเอนไซมจากพืช 7 ชนิดEffect of buffers at various pH on milk clotting activity, protein content and specific milk clotting activity of 7crude plants enzyme

Buffers0.1 M citrate buffer pH 5.0 0.1 M citrate buffer pH 5.9 0.1 M citrate buffer pH 6.2

Extracted plants MCA(unit/g)

Protein(mg/g)

SMA(unit/ mgprotein)

MCA(unit/g)

Protein(mg/g)

SMA(unit/ mgprotein)

MCA(unit/g)

Protein(mg/g)

SMA(unit/ mgprotein)

1. Turkey berry2. Sparrow's brinjal3. Craib egg plant4. Egg plant 15. Egg plant 26. Ash gourd7. Musk melon

1.36+0.131.39+0.100.97+0.080.13+0.080.13+0.000.67+0.000.19+0.00

72.79+8.3840.97+1.5225.97+1.4831.12+2.2411.12+2.2416.31+0.8338.95+0.91

0.02+0.00c0.03+0.00b0.04+0.00a0.00+0.01e0.01+0.00d0.04+0.00a0.00+0.00e

1.20+0.081.24+0.080.88+0.040.13+0.020.13+0.000.60+0.020.19+0.00

75.71+6.0255.19+8.9132.69+5.4533.72+0.8421.12+3.5521.79+1.3042.70+0.39

0.02+0.00b0.02+0.00b0.03+0.00a0.00+0.00d0.01+0.00c0.03+0.01a0.00+0.00d

0.07+0.000.07+0.000.07+0.000.09+0.000.10+0.000.09+0.000.14+0.00

70.16+1.0554.29+4.0834.97+4.2130.26+1.2525.57+0.7830.29+0.7138.10+0.76

0.00+0.00a0.00+0.00a0.00+0.00a0.00+0.00a0.00+0.00a0.00+0.00a0.00+0.00a

Mean + Standard deviation of two replication. Egg plant 1 = Makhuea Khait tao; Egg plant 2 = Makhuea Lai , MCA = milk clotting activity, SMA = specific milkclotting time. abcde in the same column is significant at the 0.5 level.

66

ตาราง 7 (ตอ)(Continued)

Buffers0.1 M acetate buffer pH 5.0 0.1 M acetate buffer pH 5.6 Distilled water pH 6.5

Extracted plants MCA(unit/g)

Protein(mg/g)

SMA(unit/ mgprotein)

MCA(unit/g)

Protein(mg/g)

SMA(unit/ mgprotein)

MCA(unit/g)

Protein(mg/g)

SMA(unit/ mgprotein)

1. Turkey berry2. Sparrow's brinjal3. Craib egg plant4. Egg plant 15. Egg plant 26. Ash gourd7. Musk melon

0.63+0.050.68+0.020.49+0.030.06+0.000.10+0.000.24+0.010.17+0.00

65.65+2.4541.69+0.6325.94+0.8429.87+1.6012.89+0.7615.59+1.0338.91+0.86

0.01+0.00b0.02+0.00a0.02+0.00a0.00+0.00c0.00+0.00b0.02+0.00a0.00+0.00c

0.55+0.020.57+0.040.51+0.030.06+0.000.10+0.000.22+0.010.18+0.01

68.57+2.3150.54+1.4931.20+0.9533.44+0.5721.96+1.0221.45+0.8441.77+0.36

0.01+0.00b0.01+0.00b0.02+0.00a

0.00+0.01bc0.00+0.00c0.01+0.00b0.00+0.00c

0.49+0.020.52+0.030.12+0.000.05+0.000.06+0.000.14+0.000.14+0.00

69.96+2.3657.71+0.7937.87+0.8131.06+0.9427.65+0.4432.34+0.7937.62+0.76

0.01+0.00a0.01+0.00a0.00+0.00b

0.00+0.01ab0.00+0.00b0.00+0.00b0.00+0.00b

Mean + Standard deviation of two replication. Egg plant 1 = Makhuea Khait tao; Egg plant 2 = Makhuea Lai , MCA = milk clotting activity, SMA = specific milkclotting time. abc in the same column is significant at the 0.5 level.

65

3. การทําบริสุทธิ์บางสวนของสารสกัดเอนไซม3.1 การตกตะกอนโปรตีนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัว

ทําการตกตะกอนโปรตีนสารสกัดเอนไซมจากพืช 4 ชนิด คือ ฟกเขียว มะเขือเหลือง มะแวงและมะเขือพวง ที่สกัดดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลารพีเอช 5.0 (คัดเลือกไดจากขอ 2.) ดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 20, 40, 60 และ 80 นําตะกอนมาไดอะไลซิส แลวนําสารละลายเอนไซมแตละสวนมาทดสอบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน กิจกรรมยอยสลายโปรตีน และวัดปริมาณโปรตีน พบวา แตเอนไซมจากพืชที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 21-60 มีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนสูงกวาสารสกัดเอนไซมและเอนไซมจากพืชที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 0-20 และ 61-80 โดยเอนไซมจากพืชที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 0-20 มีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนต่ํา (0.00 ยูนิต/ตัวอยาง 1 กรัม) และเอนไซมจากพืชที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 61-80 ทําใหนมจับตัวเปนกอนนานกวา 3 ชั่วโมง

เอนไซมจากพืชทั้ง 4 ชนิด ที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 21-60 มีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนไมแตกตางกันทางสถิติ (p>0.05) โดยเอนไซมจากมะแวงที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัว รอยละ 21-60 มีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนสูงที่สุดเทากับ 0.04 ยูนิต/โปรตีน 1 มก. และเอนไซมจากและฟกเขียว มะเขือพวงและ มะเขือเหลือง มีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนเทากับ 0.03 0.03 และ 0.02 ยูนิต/โปรตีน 1 มก. ตามลําดับ เอนไซมจากพืชที่ผานการตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 21-60 จะมีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 2-4 เทา แสดงดังตาราง 8 ทั้งนี้เนื่องจากการตกตะกอนโปรตีนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต เปนการทําใหการละลายของโปรตีนลดลงและจับตัวกันตกตะกอนลงมาทําใหโปรตีนที่แยกไดมีความบริสุทธิ์มากขึ้น

เอนไซมจากพืชทั้ง 4 ชนิด ที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 21-60 มีอัตราสวนระหวางกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนตอกิจกรรมยอย

66

สลายโปรตีนสูงกวาสารสกัดเอนไซม โดยเอนไซมจากมะแวงมีคาสูงสุดเทากับ 1.17-1.26 รองลงมา ไดแก มะเขือพวง (0.74-0.82) มะเขือเหลือง (0.52-0.56) และฟกเขียว(0.32-0.38) ตามลําดับ แสดงดังตาราง 8 ซึ่งอัตราสวนระหวางกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนตอกิจกรรมยอยสลายโปรตีน เปนคาที่แสดงถึงปริมาณเอนไซมโปรติเอสที่มีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน มีประโยชนในการคัดเลือกชนิดเอนไซมและสภาวะที่เหมาะสมในการตกตะกอนโปรตีนเพื่อผลิตเนยแข็ง (Green et al., 1972; Chen andzen, 1980) โดยเอนไซมและสภาวะที่เหมาะในตกตะกอนโปรตีนควรมีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนสูง แตมีกิจกรรมยอยสลายโปรตีนต่ําและมีกิจกรรมจําเพาะยอยสลายพันธะ Phe105-Met106 ในแคปปา-เคซีน (Tavaria et al., 1997)

จากผลการทดลองขางตนจึงเลือกเอนไซมจากมะแวง และ ฟกเขียวเปน ตัวแทนของพืชทั้ง 2 วงศ ที่ผานการคัดเลือก ไดแกเอนไซมจะมะแวงเปนตัวแทนของพืชวงศ Solanaceae และเอนไซมจากฟกเขียวจะเปนตัวแทนของพืชวงศ Cucurbitaceae ในการศึกษาตอไป

Eskin และ Landman (1975) ทําการสกัดเอนไซมที่ทําใหนมจับตัวเปนกอนจากเนื้อฟกเขียวโดยการบีบคั้นเนื้อฟกที่บดละเอียด แลวตกตะกอนโปรตีนดวยอะซิโตนเย็นปริมาณ 4 เทาของสารสกัดเอนไซม นําไปเหวี่ยงแยกที่ความเร็วรอบ 7000 xg เปนเวลา 20 นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ละลายตะกอนดวยสารละลาย อะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.01 โมลาร พีเอช 5.5 ทําการตกตะกอนและแยกตะกอนโปรตีนอีกครั้งดังวิธีที่กลาวขางตน ดังนั้นเอนไซมที่ไดจากการตกตะกอนดวยอะซิโตนเย็นทั้ง 2 ครั้ง มีความบริสุทธิ์เทากับ 5.5 และ 7.6 เทา นอกจากนี้ Gupta และ Eskin (1977) ทําการสกัดและทําบริสุทธิ์เอนไซมจากเนื้อฟกเขียวดวยวิธีการบีบคั้นและทําใหเอนไซมเขมขนที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ใหมีปริมาตรเหลือรอยละ 40 ของสารสกัดเริ่มตน แลวตกตะกอนโปรตีนดวยอะซิโตนเย็นปริมาณ 3 เทาของสารสกัดเอนไซม ละลายตะกอนที่ไดดวยสารละลายอะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.01 โมลาร พีเอช 5.6 และไดอะไลซิสที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 16-18 ชั่วโมง พบวา เอนไซมมีความบริสุทธิ์ 6.89 เทา

67

ตาราง 8 การทําบริสุทธิ์บางสวนของสารสกัดเอนไซมจากพืช 4 ชนิด ดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวความเขมขนตางๆ Partial purification of 4- crude plants enzyme by various saturated ammonium sulfates

Plant sample Fraction Volume(ml)

MCA(unit/g)

PA(unit/g/1hr);

MCA/PA Protein (mg/g)

SMA(unit/ mg protein)

Yield(%)

Fold

Ash gourd

Craib eggplant

Sparrow’sbrinjal

Turkey berry

Crude extract21-40% sat. (NH4)2SO4 precipitate41-60% sat. (NH4)2SO4precipitate

Crude extract21-40% sat. (NH4)2SO4precipitate41-60% sat. (NH4)2SO4precipitate

Crude extract21-40% sat. (NH4)2SO4precipitate41-60% sat. (NH4)2SO4precipitate

Crude extract21-40% sat. (NH4)2SO4precipitate41-60% sat. (NH4)2SO4precipitate

1702222

1502323

1502223

1502726

0.66+0.025.95+0.146.38+0.23

1.06+0.069.28+0.606.60+0.21

2.52+0.1221.36+0.8616.82+0.78

2.00+0.0216.78+1.9010.26+0.45

6.01+0.0818.83+0.1616.89+0.22

5.46+0.0716.60+0.2812.68+0.58

5.46+0.0116.98+1.1714.37+0.84

5.38+0.1220.36+0.7213.80+0.19

0.14+0.00Cb0.32+0.01Ca0.38+0.01Ca

0.19+0.02Bb0.56+0.06Ba0.52+0.03Ba

0.46+0.03Ab1.26+0.04Aa1.17+0.03Aa

0.38+0.03Bb0.82+0.06Ba0.74+0.03Ba

198.32+3.39542.61+8.99519.80+2.64

180.02+3.08478.46+9.06

390.17+17.08

180.01+3.08489.15+31.34442.31+25.12

177.29+1.51586.90+26.40424.75+3.21

0.01+0.00ABb0.03+0.01ABa0.03+0.02ABa

0.01+0.00Bb0.02+0.00Ba0.02+0.00Ba

0.01+0.00Ab0.04+0.00Aa0.04+0.00Aa

0.01+0.00ABb0.03+0.01ABa0.03+0.03ABa

10037.6742.23

10043.2039.94

10039.0235.58

10039.3932.13

13.313.71

13.302.88

13.122.72

12.522.14

Note: Mean + Standard deviation of two replication. ABC in the same column between plants is significant at the 0.5 level; ab in the same column between fraction is significant at the 0.5llevel; MCA = Milk clotting activity; PA= Proteolytic activity SMA = specific milk clotting activity (unit/mg protein)

68

3.2 ศึกษาคุณสมบัติบางประการของเอนไซมที่ผานการทําบริสุทธิ์บางสวนนําเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงที่ผานการทําบริสุทธิ์บางสวนที่ไดจากขอ 3.1

มาศึกษาคุณสมบัติบางประการของเอนไซมดังตอไปนี้3.2.1 ศึกษาอุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน โดยการ

เติมสารละลายเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวง 0.03 และ 0.09 ยูนิต / นม 1 มล. ลงในน้ํานมและบมสารผสม ที่อุณหภูมิ 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 และ 80 องศาเซลเซียส แลวทดสอบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมที่อุณหภูมิตางๆ เทียบกับกิจกรรมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส พบวา กิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงมีคาเพิ่มขึ้นเมื่ออุณหภูมิสูงขึ้น และมีคาสูงสุดที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส นั่นคือ อุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนสูงสุดของเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงอยูในชวง 45 องศาเซลเซียส ที่พีเอช 6.0-6.2แสดงดังภาพ 3 และเมื่ออุณหภูมิสูงกวา 45 องศาเซลเซียส เอนไซมมีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนลดลงเนื่องจากความรอนทําใหโครงสรางของเอนไซมในสวนของหมูพรอสเตติก (prosthetic groups) ถูกทําลายและเสียสภาพการทํางานไป (Garcia et al., 2000) ซึ่งสอดคลองกับการทดลองของ Tamer (1993) ที่รายงานวาโดยปกติเอนไซมที่ทําใหนมจับตัวเปนกอนจะถูกทําลายที่อุณหภูมิสูงกวา 50 องศาเซลเซียส

3.2 ศึกษาคุณสมบัติบางประการของเอนไซมที่ผานการทําบริสุทธิ์บางสวนนําเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงที่ผานการทําบริสุทธิ์บางสวนที่ไดจากขอ 3.1

มาศึกษาคุณสมบัติบางประการของเอนไซมดังตอไปนี้3.2.1 ศึกษาอุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน โดยการ

เติมสารละลายเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวง 0.03 และ 0.09 ยูนิต / นม 1 มล. ลงในน้ํานมและบมสารผสม ที่อุณหภูมิ 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 และ 80 องศาเซลเซียส แลวทดสอบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมที่อุณหภูมิตางๆ เทียบกับกิจกรรมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส พบวา กิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงมีคาเพิ่มขึ้นเมื่ออุณหภูมิสูงขึ้น และมีคาสูงสุดที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส นั่นคือ อุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนสูงสุดของเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงอยูในชวง 45 องศาเซลเซียส ที่พีเอช 6.0-6.2แสดงดังภาพ 3 และเมื่ออุณหภูมิสูงกวา 45 องศาเซลเซียส เอนไซมมีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนลดลงเนื่องจากความรอนทําใหโครงสรางของเอนไซมในสวนของหมูพรอสเตติก (prosthetic groups) ถูกทําลายและเสียสภาพการทํางานไป (Garcia et al., 2000) ซึ่งสอดคลองกับการทดลองของ Tamer (1993) ที่รายงานวาโดยปกติเอนไซมที่ทําใหนมจับตัวเปนกอนจะถูกทําลายที่อุณหภูมิสูงกวา 50 องศาเซลเซียส

69

020406080

100

30 35 40 45 50

ภาพ 3 ผลของอุณหภูมิตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมจากฟกเขียว ( ) และมะแวง ( )Effect of temperature on milk clotting activity of enzymes from Ashgourd ( ) and Sparrow's brinjal ( )

3.2.2 ศึกษาพีเอชที่เหมาะสมตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนน้ํานม (หางนมรอยละ 12 ในสารละลายฟอสเฟต บัฟเฟอรเขมขน 0.1

โมลาร ) ที่เตรียมไดมีคาพีเอชสุดทายเทากับ 6.1 6.2 6.3 6.5 6.6 6.7 และ 6.8 นํามาบม ที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส (คัดเลือกไดจากขอ 3.2.1) เติมสารละลายเอนไซมจากฟกเขียว มะแวงและเอนไซมเรนนินทางการคา 0.03 0.09 และ 500 ยูนิต/นม 1 มล. ลงในน้ํานมที่มีคาพีเอชตาง ๆ ทดสอบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมจากพืช พบวา คาพีเอชที่เหมาะสมตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวง คือ 6.0 และ 6.6 ตามลําดับ ดังภาพ 4 โดยกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมมีคาลดลงที่พีเอชต่ําหรือสูงเกินไป ทั้งนี้เนื่องจากในสารละลายที่มีความเปนกรดหรือเปนดางมากๆ ทําใหเอนไซมเสียสภาพไดงาย โดยพีเอชจะไปมีผลตอการแตกตัวของอิออน (ionization) ของหมูโพรโททรอพิค (prototropic group) ที่อยูในบริเวณเรง (active site) ของเอนไซมมีผลทําใหเกิดการเปลี่ยนโครงรูปสามมิติซึ่งจะมีผลไปสูการเบี่ยงเบนในดานการจับกับสับสเตรต หรือการเรงปฏิกิริยา นอกจากนี้พีเอชยังไปมีผลตอการเกิดสารประกอบรวมระหวางเอนไซมและสับสเตรต (enzyme substrate complex) การแตกตัวของอิออนของสับสเตรตและโคแฟคเตอรสงผลใหการจับกับเอนไซมเปลี่ยนไป (ปราณี อานเปรื่อง, 2543)

Temperature (OC)

Relat

ive ac

tivity (

%)

70

020406080

100

5.8 6 6.2 6.4 6.6 6.8

ภาพ 4 ผลของพีเอชตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมจากฟกเขียว ( ) และมะแวง ( )Effect of pH on milk clotting activity of enzymes from Ash gourd ( ) and Sparrow's brinjal ( )

3.2.3 ศึกษาความคงตัวของเอนไซมที่อุณหภูมิตาง ๆโดยใหความรอนแกเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงที่อุณหภูมิ 30 40 และ

65 องศาเซลเซียส เปนเวลา 5 10 15 30 60 90 120 150 180 210 270 300 นาที และที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส เปนเวลา 2 4 6 8 10 และ15 นาที แลวนํามาทดสอบ กิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงโดยปรับพีเอชของน้ํานมใหมีคาเทากับ 6.0. และ 6.6 ตามลําดับและบมที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส พบวา เอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงยังคงมีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนที่อุณหภูมิ 30 40 และ 65 องศาเซลเซียส อยางนอย 5 ชั่วโมง โดยที่ ณ อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เอนไซมมีความคงตัวตออุณหภูมิดีที่สุด นอกจากนี้ยังพบวาเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงจะสูญเสียกิจกรรมเมื่อใหความรอนที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 และ 4 นาที ตามลําดับ แสดงดังภาพ 5 การทนรอนของเอนไซมอาจเนื่องพันธะภายในของสารเปปไทด ไดแก พันธะไดซัลไฟดที่ชวยยึดกรดอะมิโนซิสเตอีนสองตัวในเปปไทดสายเดียวกันหรือตางสายกันใหอยูใกลชิดกัน เปนพันธะที่แข็งแรงทําใหโครงสรางของเอนไซมไมเปลี่ยนไปและไมเกิดการเสียสภาพเมื่อไดรับความรอนระดับหนึ่ง (Nissen,1993)

pH

Relati

ve ac

tivity

(%)

71

การใหความรอนแกสารสกัดเอนไซมจากผลจูบีน ที่อุณหภูมิ 40 หรือ 50 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที จะไมมีผลตอการลดลงของกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของสารสกัดเอนไซม แตที่อุณหภูมิ 60 หรือ 70 องศาเซลเซียส กิจกรรมของสารสกัดเอนไซมจะลดลงรอยละ 28 และ 86 ตามลําดับ และจะสูญเสียกิจกรรมเม่ือไดรับความรอนที่อุณหภูมิ 80-90 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที (Yousif et al., 1996)

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250 300

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250 300

(A) enzyme from Ash gourd(B) enzyme from sparrow’s brinjal

ภาพ 5 การทนตอความรอนของเอนไซมจากฟกเขียว (A) และมะแวง (B) ที่อุณหภูมิ 30°C ( ), 40°C ( ), 65°C ( ) และ 80°C ( )Thermal stability of enzymes from Ash gourd (A) and Sparrow’sbrinjal (B) at various temperature, 30°C ( ), 40°C ( ), 65°C ( ) and80°C ( )

Relati

ve ac

tivity

(%)

Time (minutes)

(B)

Relati

ve ac

tivity

(%) (A)

72

3.2.4 ศึกษาความคงตัวของเอนไซมที่พีเอชตางๆสารละลายเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงที่ละลายในสารละลายอะซิเตต

บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 3.6 4.8 และ 5.2 และสารละลายทริส-มาลีเอท บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.2 6.2 7.7 และ 8.4 มีคาเทากับ 4.4 4.6 4.8 4.9 5.2 5.6 และ 6.0 ตามลําดับ จากนั้นบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ระยะเวลาตางๆ แลวทดสอบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน ที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส พีเอช 6.0 และ 6.6 พบวา เอนไซมในสารละลายพีเอช 4.4-6.0 ยังคงมีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนรอยละ 98 เมื่อบมเปนเวลา 7 ชั่วโมง แตกิจกรรมของเอนไซมจากมะแวงจะลดลงเมื่อบมนาน 3-3.5 ชั่วโมง แสดงดังภาพ 6 แสดงวา เอนไซมจากฟกเขียวทนตอพีเอชไดดีกวาเอนไซมจากมะแวง

73

97

97.5

98

98.5

99

99.5

100

0 50 100 150 200 250 300 350 400

97

97.5

98

98.5

99

99.5

100

0 50 100 150 200 250 300 350 400

(A) enzyme from Ash gourd(B) enzyme from Sparrow’s brinjal

ภาพ 6 การทนตอพีเอชของเอนไซมจากฟกเขียว (A) และมะแวง (B) ที่พีเอช4.4( ), 4.6( ), 4.8( ), 4.9 ( ), 5.2( ), 5.6(Ο) และ 6.0 ( )pH stability of enzymes from Ash gourd(A) and Sparrow’s brinjal (B)at pH 4.4( ), 4.6( ), 4.8( ), 4.9( ), 5.2( ), 5.6(Ο) and 6.0 ( )

Relati

ve ac

tivity

(%)

Relati

ve ac

tivity

(%)

Time (minutes)

(A)

(B)

74

4. ผลของสารประกอบฟนอลตอกิจกรรมของเอนไซมจากพืชสารประกอบฟนอลเปนองคประกอบหนึ่งในพืช ถูกสกัดออกมาและปะปน

อยูในสารสกัดเอนไซมทําใหสารสกัดเอนไซมมีสีน้ําตาล ซึ่งเปนสาเหตุยับยั้งกิจกรรมของเอนไซมและยังมีผลทําใหโปรตีนเคซีนในนมตกตะกอนเร็วขึ้น (Gegenheimer, 1990; Iturbe-chinas and Canals, 1986) ดังนั้น จึงศึกษาผลของสารประกอบฟนอลตอกิจกรรมของเอนไซมจากพืช โดยการเติมสารโพลีไวนิลไพโรลิโดนรวมกับสารละลายบัฟเฟอร เพื่อยับยั้งกิจกรรมของสารประกอบฟนอลที่มีในสารสกัดเอนไซม ซึ่งทาง อุตสาหกรรมอาหารมีการนําโพลีไวนิลไพโรลิโดนมาใชเปนวัตถุเจือปนอาหาร ทําหนาที่เปนสารใหความคงตัว (stabilizer) สารเพิ่มความหนืด (thickener) อิมัลซิไฟเออร เปนตน (นิธิยา รัตนาปนนท, 2545)

4.1 ศึกษาผลของโพลีไวนิลไพโรลิโดนตอกิจกรรมของเอนไซมจากพืชทําการทดลองเบื้องตน โดยสกัดเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงดวยสาร

ละลายซิเตรต บัฟเฟอร เขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 รวมกับสารโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 1.5 แลวนําไปทดสอบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน พบวา สารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวที่เติมและไมเติมสารโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 1.5 มีคากิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนเทากับ 0.55 และ 0.58 ยูนิต/ตัวอยาง 1 กรัม ซึ่งไมแตกตางกัน (p>0.05) ทางสถิติ ขณะที่สารสกัดเอนไซมจากมะแวงที่เติมโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 1.5 มีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนต่ํากวาสารสกัดเอนไซมจากมะแวงที่ไมเติมโพลีไวนิล-ไพโรลิโดนรอยละ 1.5 ซึ่งมีคาเทากับ 0.58 และ 0.74 ยูนิต/ตัวอยาง 1 กรัม ตามลําดับ ทั้งนี้เนื่องจากสารโพลิไวนิลไพโรลิโดนจะทําหนาที่ในการยับยั้งกิจกรรมของสารประกอบฟนอลที่ปะปนอยูในสารสกัดเอนไซมจากมะแวง มีผลทําใหนมจับตัวเปนกอนนานขึ้นและมีคากิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของเอนไซมมีคาลดลง และสรุปวาสารประกอบฟนอลในสารสกัดเอนไซมจากมะแวงมีผลตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนสูงขึ้น แตเมื่อสกัดดวยบัฟเฟอรชนิดเดียวกันรวมกับสารโพลิไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 1.5 สามารถยับยั้งกิจกรรมของสารประกอบฟนอลไดและทําใหกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนมีคาลดลง แตสําหรับสารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวซึ่งมีปริมาณสารประกอบฟนอล

75

ในปริมาณนอย (สังเกตจากสีของสารสกัดซึ่งมีสีใส) การเติมสารโพลิไวนิลไพโรลิโดนไมมีผลตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของสารสกัดเอนไซม นอกจากนี้ พบวา ลักษณะตะกอนโปรตีนที่ไดจากการตกตะกอนดวยสารสกัดเอนไซมจากพืชที่สกัดดวยสารละลาย บัฟเฟอรรวมกับโพลิไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 1.5 มีการเกาะตัวดีกวาตะกอนโปรตีนที่ไดจากการสกัดดวยสารละลายบัฟเฟอรเพียงอยางเดียว

ผลการสกัดเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงที่สกัดดวยสารละลายบัฟเฟอร 2 ชนิด พีเอช ตางๆ พบวา สารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวมีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอน (0.02-0.03 ยูนิต/โปรตีน 1 กรัม) สูงกวาสารสกัดเอนไซมจากมะแวง (0.01 ยูนิต/โปรตีน 1 กรัม) โดยสารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวที่สกัดดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอรและสารละลายอะซิเตต บัฟเฟอร เขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 มีคากิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอน (0.03 ยูนิต/โปรตีน 1 กรัม) สูงกวาสารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวที่สกัดดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอร เขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.9, 6.2 สารละลายอะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.6 และน้ํากลั่น (0.02 ยูนิต/โปรตีน 1 กรัม) นอกจากนี้ สารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงที่สกัดดวยสารละลายอะซิเตต บัฟเฟอร เขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 มีอัตราสวนระหวางกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนตอกิจกรรมยอยสลายโปรตีนสูงกวาการสกัดดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 แสดงดังตาราง 9 และเมื่อสังเกตลักษณะตะกอนโปรตีน โดยการเอียงหลอดทดลอง พบวา ตะกอนโปรตีนที่ไดจากสารสกัดเอนไซมจากพืชที่สกัดดวยสารละลายอะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 และ 5.6 มีการเกาะตัวแนนเมื่อเอียงหลอดทดลองตะกอนโปรตีนไมแตกเปนกอนเล็ก ๆ ขณะที่ตะกอนโปรตีนที่ไดจากสารสกัดเอนไซมจากพืชที่สกัดดวยสารละลายซิเตรต บัฟเฟอร เขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 5.9 6.2 และน้ํากลั่น มีการเกาะตัวกันไมแนนเมื่อเอียงหลอดทดลองตะกอนโปรตีนจะแตกเปนกอนเล็ก ๆ ดังนั้น ในการทดลองนําเอนไซมจากพืชมาประยุกตใชในการผลิตคอทเทจชีส สเปรด เพื่อใหตะกอนที่ไดมีการเกาะตัวกันดี จึงเลือกสกัดเอนไซมจากพืชดวยสารละลายอะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0

76

ตาราง 9 ผลของโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ1.5 รวมกับสารสกัดบัฟเฟอรตอกิจกรรมของสารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงEffect of 1.5 %polyvinylpyrrolidone compose with extracted buffer on activity of crude enzyme from Ash gourd and Sparrow's brinjal

Plant sample Extracted buffer MCA (unit/g) PA (unit/g/1hr); MCA/PA Protein (mg/g) SMA (unit/ mg protein)Ash gourd

Sparrow's brinjal

0.1M Citrate 5.00.1M Citrate 5.90.1M Citrate 6.20.1M Acetate 5.00.1M Acetate 5.6Distilled water

0.1M Citrate 5.00.1M Citrate 5.90.1M Citrate 6.20.1M Acetate 5.00.1M Acetate 5.6Distilled water

0.56+0.010.48+0.010.46+0.010.37+0.020.30+0.010.20+0.00

1.36+0.061.18+0.041.11+0.041.08+0.070.87+0.050.31+0.01

0.55+0.120.54+0.000.48+0.020.34+0.030.44+0.020.50+0.01

2.76+0.182.45+0.022.38+0.041.96+0.031.64+0.011.98+0.04

1.06+0.26a0.88+0.01c0.95+0.02b1.10+0.001a0.68+0.03d0.50+0.03e

0.57+0.03b0.48+0.02c0.47+0.00c0.64+0.04a0.53+0.04b0.16+0.01d

16.26+0.2217.22+0.3818.26+0.1415.49+0.1316.40+0.1516.33+0.49

113.13+7.82134.27+1.55113.27+1.46107.69+3.36116.87+1.7799.89+1.34

0.03+0.00a0.02+0.00b0.02+0.00b0.03+0.00a0.02+0.00b0.01+0.00c

0.01+0.00a0.01+0.00a0.01+0.00a0.01+0.00a0.01+0.00a0.00+0.00a

Mean + Standard deviation of two replication. abcd in the same column is significant at the 0.5 level; MCA = milk clotting activity; PA= proteolytic activity; SMA = milk specific clottingactivity

77

4.2 ความเขมขนของโพลีไวนิลไพโรลิโดนตอกิจกรรมของเอนไซมจากพืชจากการทดลองขอ 4.1 พบวา สารโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 1.5 สามารถ

ยับยั้งสารประกอบฟนอลที่ปะปนอยูในสารสกัดเอนไซมจากพืชสงผลใหกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนมีคาลดลง ในกรณีที่มีการเพิ่มความเขมขนของโพลีไวนิลไพโรลิโดนมากขึ้นจะมีผลอยางไรกับกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนของสารสกัดเอนไซมจากพืช ดังนั้น จึงไดทําการศึกษาความเขมขนของโพลีไวนิลไพโรลิโดนรวมกับสารละลาย บัฟเฟอรในการสกัดเอนไซมจากพืชตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน พบวา สารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวที่เติมโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 0 1.5 2 และ 3 มีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนและกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนไมแตกตางกัน (p>0.05)อยูในชวง 0.43-0.44 ยูนิต/ตัวอยาง 1 กรัม และ 0.05 ยูนิต/ โปรตีน 1 กรัม ตามลําดับ สําหรับสารสกัดเอนไซมจากมะแวงที่เติมโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 0 1.5 2 และ 3 มีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนลดลง (p>0.05) เทากับ 2.20 1.97 1.78 1.72 ยูนิต/ตัวอยาง 1 กรัม. ตามลําดับ นั่นคือความเขมขนของโพลีไวนิลไพโรลิโดนที่เพิ่มขึ้นมีผลทําใหกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนและกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนของสารสกัดเอนไซมจากมะแวงลดลง แตการเพิ่มความเขมขนของโพลิไวนิลไพโรลิโดนไมมีตอกิจกรรมของสารสกัดเอนไซมจากฟกเขียว เมื่อพิจารณาอัตราสวนระหวางกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนตอกิจกรรมการยอยสลายโปรตีน พบวา สารสกัดเอนไซมจาก ฟกเขียวและมะแวงที่เติมสารโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 1.5 มีคาอัตราสวนระหวาง กิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนตอกิจกรรมการยอยสลายโปรตีนสูงกวาสารสกัดเอนไซมที่เติมสารโพลีไวนิลไพโรลิโดน รอยละ 0 2 และ 3 แสดงในตาราง 10 จึงเลือกใชสารโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 1.5 รวมกับบัฟเฟอรในการสกัดเอนไซมจากพืช ในการผลิตคอทเทจชีส สเปรด โดยพืชที่เลือกใชไดแก ฟกเขียว เนื่องจากสารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวมีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนสูงกวามะแวง สารสกัดใสไมมีสี หาซื้องาย มีผลผลิตตลอดทั้งป ขณะที่สารสกัดเอนไซมจากมะแวงมีสีน้ําตาลซึ่งมีอาจผลตอสีของตะกอนโปรตีนและจะมีผลผลิตในชวงหนาฝนเทานั้น

78

ตาราง 10 ผลของความเขมขนของโพลีไวนิลไพโรลิโดนตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน กิจกรรมยอยสลายโปรตีนและปริมาณโปรตีนของสารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวและมะแวงEffect of concentration of polyvinylpyrrolidone on milk clotting activity, proteolytic activity and protein content ofcrude enzyme from Ash gourd and Sparrow’s brinjal

Plant sample Polyvinylpyrrolidone(%)

MCA (unit/g)

PA(unit/g/1hr);

MCA/PA Protein(mg/g)

SMA (unit/ mgprotein)

Ash gourd 01.523

0.44+0.010.44+0.000.43+0.000.44+0.01

0.47+0.030.40+0.010.44+0.010.46+0.03

0.94+0.03ab1.10+0.17a

0.96+0.02ab0.97+0.10ab

8.71+0.058.67+0.038.55+0.028.65+0.01

0.05+0.01a0.05+0.01a0.05+0.00a0.05+0.01a

Sparrow’sbrinjal

01.523

2.20+0.451.97+0.121.78+0.101.72+0.07

3.14+0.050.56+0.040.54+0.010.61+0.02

0.70+0.03c3.50+0.37a

3.26+0.17ab2.83+0.09b

81.45+0.2580.03+0.6079.62+0.1881.45+0.27

0.03+0.00a0.02+0.00b0.02+0.00b0.02+0.00b

Mean + Standard deviation of triplication. abc in the same column is significant at the 0.5 level; MCA = milk clotting activity ; PA= proteolyticactivity ; MSA = milk specific clotting activity

79

การสกัดและทําบริสุทธิ์บางสวนเอนไซมที่สกัดจากฟกเขียว เพื่อใชในการผลิตคอทเทจชีส สเปรด โดยสกัดเอนไซมจากฟกเขียวดวยสารละลายอะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พีเอช 5.0 รวมกับโพลีไวนิลไพโรลิโดนรอยละ 1.5 และตกตะกอนโปรตีนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 20 40 60 และ 80 และนําตะกอนโปรตีนแตละสวนมาทดสอบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน กิจกรรมยอยสลายโปรตีน วัดปริมาณโปรตีนโดยวิธี Bradford พบวา ตะกอนโปรตีนที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 21-40 และ 41-60 มีความบริสุทธิ์ เพิ่มเปน 3.70 และ 3.20 เทา ตามลําดับ โดยเอนไซมที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 21-60 มีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนเทากับ 18.90 ยูนิต/ ตัวอยาง 1 กรัม. และมีกิจกรรมจําเพาะทําใหนมจับตัวเปนกอนสูงกวาเอนไซมที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตที่ความเขมขน 0-20 และ 61-80 ดังนั้น จึงนําเอนไซมจากฟกเขียวที่ตกตะกอนดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวรอยละ 21-60 นํามาไดอะไลซิสในสารละลายอะซิเตต บัฟเฟอรเขมขน 0.1โมลาร พีเอช 5.0 ทําแหงที่อุณหภูมิจุดเยือกแข็ง ไดเอนไซมผง 0.623 กรัม มีกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน 18.02 ยูนิต/ตัวอยาง 1 กรัม.เอนไซมผงมีกิจกรรมลดลงรอยละ 4 และมีความบริสุทธิ์ 4.15 เทา ดังแสดงในตาราง 11

80

ตาราง 11 การทําบริสุทธิ์บางสวนของสารสกัดเอนไซมจากฟกเขียวดวยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวความเขมขนตาง ๆPartial purification of crude enzyme from Ash gourd by various saturated ammonium sulfates

Fraction Weight/volume

MCA(unit/g)

PA(unit/g/1hr);

MCA/PA Protein (mg/g) SMA (unit/ mgprotein)

Yield Fold

Ash gourd (Pulp)Crude extract

0-20% sat. (NH4)2SO4precipitate,dialyzed21-40% sat. (NH4)2SO4precipitate,dialyzed41-60% sat. (NH4)2SO4precipitate,dialyzed61-80% sat. (NH4)2SO4precipitate,dialyzedFreeze dried powder (21-60% sat.(NH4)2SO4precipitate)

300 g450 ml

25 ml

25 ml

20 ml

5 ml

0.623 g

0.53+0.01

1.61+0.02

11.34+0.65

7.86+0.37

0.21+0.01

18.02+0.31

6.03+0.08

15.69+0.15

22.18+0.14

18.07+0.33

4.57+0.35

6.13+0.22

0.09+0.00

0.10+0.00

0.50+0.03

0.43+0.01

0.04+0.01

2.97+0.31

48.04+2.97

181.44+11.71

274.94+4.83

220.19+3.39

358.21+16.36

450.49+2.41

0.01+0.00

0.01+0.00

0.04+0.00

0.04+0.00

0.00+0.00

0.04+0.11

100

3.01

19.71

14.61

0.36

28.22

1

0.80

3.70

3.20

0.05

4.15

MCA = milk clotting activity; PA= proteolytic activity; SMA = specific milk clotting activity

81

เมื่อเปรียบเทียบกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอนและกิจกรรมยอยสลายโปรตีนของเอนไซมฟกเขียว พบวา เมื่ออุณหภูมิเพิ่มสูงขึ้นกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน (MCA) และกิจกรรมยอยสลายโปรตีน (PA) มีคาเพิ่มขึ้น โดยมีกิจกรรมสูงสุดที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส และเมื่ออุณหภูมิสูงขึ้นกิจกรรมของเอนไซมจะลดลง แสดงดังภาพ 7 ทั้งนี้เนื่องจากความรอนจะเรงใหเกิดปฎิกริยาการยอยสลายโปรตีนและทําใหโปรตีนเสียสภาพและตกตะกอนเร็วขึ้น ดังนั้นในการผลิตคอทเทจชีส สเปรด ดวยเอนไซมจากฟกเขียวควรคํานึงถึงอุณหภูมิที่ใชในการบมน้ํานมที่มีกิจกรรมยอยสลายโปรตีนต่ําเนื่องจากถาบมน้ํานมที่มีกิจกรรมยอยสลายโปรตีนสูงจะทําใหปริมาณตะกอนโปรตีนที่ไดต่ํา จากการทดลองของ Aworh และ Nakai (1986) พบวา เอนไซมที่สกัดจากใบโซดอม มีกิจกรรมยอยสลายโปรตีนที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียสสูงกวาที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส

0

50

100

150

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9

0

50

100

150

200

ภาพ 7 ผลของอุณหภูมิตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวเปนกอน ( ) และกิจกรรมยอยสลายโปรตีน ( ) ของเอนไซมจากฟกเขียวEffect of temperature on milk clotting activity ( ) and proteolyticactivity ( ) of enzyme from Ash gourd

30 35 40 45 50 55 60 65 70

Relative PA (%)

Relati

ve MC

A (%

)

MCA = milk clotting activityPA = proteolytic activity

Temperature (OC)

82

5. การผลิตคอทเทจชีส สเปรดดวยเอนไซมจากฟกเขียว5.1 สภาวะที่เหมาะสมในการตกตะกอนโปรตีนดวยเอนไซมจากฟกเขียวในการ

ผลิตคอทเทจชีส สเปรดการผลิตคอทเทจชีส สเปรดจากน้ํานมพรองไขมัน (ไขมันนมรอยละ 0.2-0.4)

ผานการพาสเจอไรสที่อุณหภูมิ 75 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 วินาที และตกตะกอนโปรตีนดวยเอนไซมจากฟกเขียวรวมกับหัวเชื้อ S. lactis เขมขน 1.70 X109 เซลล/มล. (ภาคผนวก ง) โดยเชื้อ S. lactis เปนจุลินทรียที่เจริญไดดีที่อุณหภูมิ 25-45 องศาเซลเซียส (มหาวิทยาลัยสุโขทัยธรรมาธิราช, 2539) ขณะที่อุณหภูมิและพีเอชที่เหมาะสมตอกิจกรรมทําใหนมจับตัวปนกอนของเอนไซมจากฟกเขียวเทากับ 50 องศาเซลเซียส 6.0 ดังนั้น การตกตะกอนโปรตีนดวยเอนไซมจากฟกเขียวรวมกับหัวเชื้อ S. lactis ควรคํานึงสภาวะที่เหมาะสมสําหรับการเจริญของจุลินทรียและกิจกรรมทําใหนมตกตะกอนดวยเอนไซมเพื่อใหไดปริมาณผลผลิตตะกอนโปรตีนสูงและตะกอนโปรตีนเกาะตัวกัน

5.1.1 อุณหภูมิที่เหมาะสมในการตกตะกอนโปรตีนดวยเอนไซมจากฟกเขียวน้ํานมพรองไขมันนมพาสเจอไรสมีคาพีเอชเทากับ 6.5 และเมื่อเติมหัวเชื้อ

S. lactis รอยละ 5 บมที่อุณหภูมิ 32 องศาเซลเซียส เปนเวลา 1 ชั่วโมง น้ํานมมีพีเอช ลดลงเปน 6.3 จากนั้นเมื่อเติมเอนไซมจากฟกเขียว 1.45 ยูนิต/นม 1 มล. และบมตอที่อุณหภูมิตางๆ (32 35 40 และ 45 องศาเซลเซียส) เปนเวลา 4 ชั่วโมง พบวา น้ํานมที่เติมหัวเชื้อ S. lactis รอยละ 5 และไมเติมเอนไซมจากฟกเขียว โปรตีนไมตกตะกอน น้ํานมที่เติมหัวเชื้อ S. lactis รอยละ 5 และเอนไซมจากฟกเขียว 1.45 ยูนิต/นม 1 มล.และบมที่อุณหภูมิตางๆ หลังจากการบมเปนเวลา 4 ชั่วโมง น้ํานมมีคาพีเอชอยูในชวง 5.8-6.1 เมื่อบมน้ํานมที่อุณหภูมิสูงขึ้น ทําใหปริมาณตะกอนโปรตีนลดลงขณะที่ปริมาณเวยเพิ่มขึ้น โดยการบมที่อุณหภูมิ 32 35 และ 40 องศาเซลเซียส มีปริมาณผลผลิตตะกอนโปรตีนไมแตกตางกันทางสถิติ (p<0.05) อยางมีนัยสําคัญและมีปริมาณผลผลิตตะกอนโปรตีนสูงกวาการบมที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส โดยปริมาณผลผลิตตะกอนโปรตีนที่ไดจากการบมที่อุณหภูมิ 35 มีคาสูงสุดเทากับรอยละ 11.14

83

แสดงดังตาราง 12 จึงเลือกอุณหภูมิที่เหมาะสมตอการตกตะกอนโปรตีนของน้ํานมที่ 35 องศาเซลเซียส เปนเวลา 4 ชั่วโมงในการผลิตคอทเทจชีส สเปรด

ตาราง 12 การตกตะกอนโปรตีนของนมพรองไขมันที่อุณหภูมิตางๆ Milk clotting of skim milk at various temperature

Treatment Temp(oC)

pH* Curd(g)

Whey(ml)

Yield (%)(Curd)

S. lactis 5%S. lactis 5% + enz**.S. lactis 5% + enz.S. lactis 5% + enz.S. lactis 5% + enz.

3232354045

6.06+ 0.106.09+0.105.97+0.206.01+0.106.10+0.10

-21.55+1.22a22.29+1.03a20.77+1.39a15.66+1.78b

-168.50+0.71b168.00+1.41b

169.50+0.71ab174.00+1.41a

-10.78+0.61a11.14+0.51a10.39+0.25a7.83+0.85b

Mean + Standard deviation of two replication.** enz = enzyme from Ash gourd 1.45 unit/ml milk*pH of incubated milk at various temperature for 4 hab in the same column is significant at the 0.5 level.- not detected

5.1.2 ปริมาณเอนไซมจากฟกเขียวที่เหมาะสมในการตกตะกอนโปรตีนน้ํานมพรองไขมันพาสเจอไรส (ไขมันรอยละ 0.2-0.4) มีคาพีเอชเทากับ

6.5 และเมื่อเติมหัวเชื้อ S. lactis รอยละ 5 บมที่อุณหภูมิ 32 องศาเซลเซียส เปนเวลา 1 ชั่วโมง น้ํานมมีพีเอชลดลงเปน 6.3 จากนั้นเมื่อเติมเอนไซมปริมาตรตางๆ (0.95 1.45 1.95 2.45 ยูนิต/นม1 มล. ) และบมตอที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เปนเวลา 4 ชั่วโมง (คัดเลือกไดจากขอ 5.1.1) พบวา เมื่อความเขมขนของเอนไซมเพิ่มขึ้น คาพีเอชของน้ํานมมีคาลดลง ตะกอนโปรตีนที่ไดลดลง ปริมาณเวยเพิ่มขึ้น และปริมาณผลผลิตของตะกอนโปรตีนที่ไดมีคาลดลง โดยการเติมเอนไซม 0.95 ยูนิต/น้ํานม 1มล. มีปริมาณผลผลิตตะกอนโปรตีนสูงสุด เทากับรอยละ 10.27 แสดงดังตาราง 13 แตการเกาะตัว

84

ของตะกอนโปรตีนต่ํากวาตะกอนโปรตีนที่ไดจากการเติมเอนไซม 1.45 ยูนิต/นม 1 มล.ซึ่งมีปริมาณผลผลิตตะกอนโปรตีนต่ํากวา (รอยละ 9.71) แตลักษณะตะกอนโปรตีนที่ตองการกอนที่จะมีการผสมรวมกับครีม ตะกอนโปรตีนที่ตองการ ตองไมเปนเนื้อแปง (mealy) ไมรวน (crumble) ไมเปนลักษณะแปงเปยก (pasty) ไมเหนียว (sticky) ไมเปนน้ําแฉะ (watery) หรือ มีลักษณะเปนเลน (slimy) (United States department of agriculture, 2001) ซึ่งตะกอนโปรตีนที่ไดจากการเติมเอนไซม 1.45 ยูนิต/นม 1มล. ลักษณะใกลเคียงกับตะกอนโปรตีนที่ตองการมากที่สุด ดังนั้น ในการตกตะกอนโปรตีนเพื่อผลิตคอทเทจชีส สเปรดจึงเติมเอนไซมจากฟกเขียว 1.45 ยูนิต/นม 1 มล.ในนมพรองไขมันพาสเจอไรสที่เติมหัวเชื้อ S lactis รอยละ 5 และบมที่อุณหภูมิ 32 องศาเซลเซียส เปนเวลา 1 ชั่วโมง แลวบมน้ํานมตอที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เปนเวลา 4 ชั่วโมง

ตาราง 13 ปริมาณตะกอนโปรตีนจากนมพรองไขมันที่ตกตะกอนดวยเอนไซม จากฟกเขียวความเขมขนตางๆCoagulum from skim milk clotted with enzyme from Ash gourd atvarious concentrations

Conc. of enzyme(unit/ml milk)

pH* Curd(g)

Whey (ml)

Yield (%)(Curd)

0.951.451.952.45

5.78+0.105.67+0.205.62+0.105.60+0.10

5.13+0.04a4.86+0.07b3.53+0.02c3.50+0.10c

37.00+1.41c41.50+0.71bc43.00+1.41ab47.50+0.71a

10.27+0.09a9.71+0.14b7.07+0.04c6.99+0.20c

Mean + Standard deviation of two replication.*pH of incubated milk at various temperature for 4 habc in the same column is significant at the 0.5 level

85

5.1 ผลของสารใหความคงตัวและปริมาณไขมันในการผลิตคอทเทจชีส สเปรดดวยเอนไซมจากฟกเขียว

5.2.1 ชนิดและความเขมขนของสารใหความคงตัวในการผลิตคอทเทจชีส สเปรดดวยเอนไซมจากฟกเขียว

ทําการผลิตคอทเทจชีส สเปรด จากน้ํานมพรองไขมัน (ไขมันรอยละ 0.2-0.4) ตามวิธีในภาคผนวก ง โดยนําตะกอนโปรตีนที่ผลิตไดมาผสมกับไขมันนมซึ่งมีการเติมสารใหความคงตัวที่ตองการศึกษา จากผลการทดลอง พบวา ปริมาณสารใหความคงตัวทุกชนิดจะเปนสัดสวนโดยตรงกับคุณลักษณะเนื้อสัมผัส คือ เมื่อใชปริมาณสารใหความคงตัวเพิ่มขึ้นความแนนเนื้อของผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรด จะสูงขึ้นซึ่งพิจารณาจากคาแรง (force) คาความนิ่ม (softness) และความเหนียว (adhesive) โดยคอทเทจชีส สเปรดที่เติมสารใหความคงตัวรอยละ 0.5 มีลักษณะเนื้อสัมผัสดีกวาที่ระดับ 0.2 นอกจากนี้สารใหความคงตัวยังมีสมบัติในการเปนสารทดแทนไขมัน (Fat replacer) ซึ่งเมื่อนํามาใชในผลิตภัณฑอาหารจะทําใหชวยลดปริมาณไขมันที่ตองเติมลงไปและไดผลิตภัณฑที่มีไขมันต่ําแตมีลักษณะกายภายทางดานเนื้อสัมผัส ใกลเคียงผลิตภัณฑที่เติมไขมันตามอัตราสวนปกติ (Lindsay, 1996) จากการทดลองผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่เติมเจลาตินและคารราจีแนนรอยละ 0.5 (เติมปริมาณไขมันรอยละ 10) มีเนื้อสัมผัสใกลเคียงกับครีมคอทเทจชีส สเปรด ทางการคา ซึ่งมีคาแรงและ คาความนิ่มเทากับ 47.06 กรัม และ 405.64 กรัมวินาที ตามลําดับ แสดงดังตาราง 14 แตครีมคอทเทจชีส สเปรดมีปริมาณไขมัน (ไมต่ํากวารอยละ 54) สูงกวาผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่ผลิตได ดังนั้นจึงสามารถเลือกใชเจลาตินหรือคารราจีแนนเปนสารใหความคงตัวในผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดได แตเนื่องจากแนวโนมการใชคารราจีแนนในผลิตภัณฑนมสูงกวาเจลาติน และคารราจีแนนมีสมบัติเดนในการเกิดปฏิกิริยากับโปรตีน (นิธิยา รัตนาปนนท, 2545) ดังนั้นจึงเลือกใชคารราจีแนนรอยละ 0.5 เปนสารใหความคงตัวในการผลิตคอทเทจชีส สเปรดตอไป

86

ตาราง 14 ผลของสารใหความคงตัวตอเนื้อสัมผัสของผลิตภัณฑคอทเทจ ชีส สเปรดที่ตกตะกอนนมดวยเอนไซมจากฟกเขียวEffect of type of stabilizer on texture of cottage cheese spread coagulated by enzyme from Ash gourd

TextureStabilizer Concentration(%) Force(g) A1(gs) A2(gs)

Gelatin 00.20.5

27.49±2.65Cc27.16±1.60Bb48.11±1.33Ba

260.98±27.05Cb249.98±14.10Ba413.63±51.68Ba

-138.57±8.30ABa-140.63±8.22BCab-222.09±41.61BCb

Carragenan 00.20.5

27.49±2.65Cc40.87±1.00Ab48.69±3.34Aa

260.98±27.05Cb557.91±434.58Aa434.58±23.78Aa

-138.57±8.30ABa-246.00±2.97Cab-205.20±10.76Cb

Salt CMC 00.20.5

27.49±2.65Cc25.93±0.93Cb32.23±1.23Ca

260.98±27.05Cb248.47±18.15Ca301.67±0.65Ca

-138.57±8.30ABa-121.57±12.31Aab–135.73±0.42Ab

C 47.06±4.84 405.64±57.62 -191.29±5.15Mean + Standard deviation of two replication. C= Commercial cream cottage cheese spread, A1(gs)= Softness; A2(gs)= Adhesive; ABC in the same column between type of stabilizer is significant at the 0.5 level. abc in the same column between concentration of stabilizer is significant at the 0.5 level .

5.2.2 ปริมาณไขมันนมในการผลิตคอทเทจชีสสเปรดดวยเอนไซมจากฟกเขียวทําการผลิตคอทเทจชีส สเปรดจากน้ํานมพรองไขมันตามวิธีในภาคผนวก ง

โดยนําตะกอนโปรตีนที่ผลิตไดมาผสมกับไขมันนมซึ่งมีการเติมคารราจีแนนรอยละ 0.5 และใชความเขมขนของไขมันนมรอยละ 0 10 และ 25 พบวา ผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่เติมไขมันนมรอยละ 0 มีเนื้อสัมผัสแนนกวาการเติมไขมันความเขมขนอื่น โดยใหคาแรง (force) คาความนิ่ม (softness) เทากับ 36.02 กรัมและ 331.22 กรัมวินาทีตามลําดับและมีคาใกลเคียงกับผลิตภัณฑครีมคอทเทจชีส สเปรดทางการคาซึ่งใหคา

87

แรงและคาความนิ่มเทากับ 47.06 กรัมและ 405.64 กรัมวินาที แตคอทเทจชีส สเปรดที่เติมไขมันนมรอยละ 10 และ 25 มีความนิ่มกวาการเติมไขมันนมรอยละ 0 โดยใหคาความหนืด (adhesive) เทากับ -202 และ -174 กรัมวินาที ตามลําดับและมีคาใกลเคียงกับผลิตภัณฑครีมคอทเทจชีส สเปรดทางการคา ซึ่งใหคาความหนืดเทากับ -191.29 กรัมวินาที นั่นคือ ปริมาณไขมันที่เพิ่มขึ้นทําใหผลิตภัณฑครีมคอทเทจชีส สเปรดมีความนิ่มมากขึ้นและมีคาความหนืดลดลง

ผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่เติมไขมันนมรอยละ 0 10 และ 25 มีคาความสวาง เทากับ 92.24 92.22 และ 91.73 ตามลําดับ นั่นคือ ปริมาณไขมันนมเพิ่มขึ้นทําใหคาความสวางมีแนวโนมลดลงแตไมแตกตางอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ(p>0.05) แตปริมาณไขมันที่เพิ่มขึ้นมีผลทําใหคาสีแดงและสีเหลืองของคอทเทจชีส สเปรดเพิ่มขึ้นอยางมีนัยสําคัญยิ่ง (p<0.05) โดยผลิตภัณฑครีมคอทเทจชีส สเปรดที่เติมไขมันนมรอยละ 0 10 และ 25 มีคาสีแดงเทากับ -0.80 -0.35 และ 0.25 ตามลําดับนั่นคือผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่เติมไขมันรอยละ 25 มีสีแดงเขมกวาเนยแข็งที่เติมไขมันนมรอยละ 0 และ 10 สําหรับคาสีเหลืองของผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่เติมไขมันนมรอยละ 0 10 และ 25 เทากับ 9.55 11.67 และ 14.57 ตามลําดับ นั่นคือ ผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรด ที่เติมไขมันนมรอยละ 25 มีสีเหลืองเขมกวาผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่เติมไขมันนมรอยละ 0 และ 10 แสดงดังตาราง 15

จากการทดลองพบวาผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่ไมเติมไขมันนมและใชคารราจีแนนรอยละ 0.5 มีความแข็งใกลเคียงกับผลิตภัณฑครีมคอทเทจชีส สเปรด ทางการคามากที่สุด ขณะที่ผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่เติมไขมันนมรอยละ 25 มีความนิ่มใกลเคียงกับผลิตภัณฑครีมคอทเทจชีส ทางการคามากที่สุดและผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่เติมไขมันนมรอยละ 25 มีคาสีใกลเคียงผลิตภัณฑครีมคอทเทจชีส สเปรดทางการคามากที่สุด ดังนั้นในการคัดเลือกปริมาณไขมันนมในการผลิตคอทเทจชีส สเปรดดวยเอนไซมจากฟกเขียว จะเลือกทําการผลิตคอทเทจชีส สเปรดที่ไมเติมไขมันนมและใชคารราจีแนนรอยละ 0.5 เนื่องจากตองการผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่มีปริมาณไขมันต่ํา แตมีคุณคาทางโภชนาการสูงและสามารถนําไปเปนสวนประกอบอาหารทดแทนไขมันไดโดยเนื้อสัมผัสไมเปลี่ยนแปลง ซึ่งเหมาะสําหรับผูที่ตองการ ควบคุมอาหารและผูที่รักสุขภาพทั่วไป

88

ตาราง 15 ผลของปริมาณไขมันนมตอเนื้อสัมผัสและสีของผลิตภัณฑคอทเทจ ชีส สเปรดที่ตกตะกอนนมดวยเอนไซมจากฟกเขียวEffect of cream on texture and color of cottage cheese spread coagulated by enzyme from Ash gourd

CharacteristicCream(%) Texture Color

Force (g) A1 (gs) A2 (gs) L* a* b*0 36.02±1.40a 331.22±12.13a -293.66±0.25b 92.24±0.21a -0.80±0.07c 9.55±0.69c10 26.39±4.05b 242.47±28.11b -202.89±59.20ab 92.22± 0.01a –0.35±0.08b 11.62±0.10b25 25.46±3.08b 234.14±30.51b -174.58±24.43a 91.73±0.06b 0.25±0.07a 14.57±0.12aC 47.06±4.84 405.64±57.62 -191.29±5.15 93.60±0.42 0.33±0.38 14.55±0.47

Mean + Standard deviation of two replication., C= Commercial cream cottage cheese, A1(gs) = Softness ; A2 (gs) =Adhesive; L* =Lightness (0 being black ,100 being white) , a* = Red verses green (+being red, - being green, 0being gray); b* = Yellow verses blue (+being yellow, - being blue, 0 being gray). abc in the same column is significant at the 0.5 level

5.3 คุณสมบัติของผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรด5.3.1 คุณสมบัติทางเคมีของผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่ผลิตดวยเอนไซมจากฟกเขียว มีปริมาณ

ความชื้น ไขมัน โปรตีน คารโบไฮเดรต และ เถา รอยละ 73.88 0.98 15.17 9.15 และ0.82 ตามลําดับ และมีคาพีเอชเทากับ 6.03 ซึ่งสูงกวาคาพีเอชของคอทเทจชีส สเปรดที่กําหนดไวไมควรเกิน 5.2 (United States department of agriculture, 2001) ทั้งนี้อาจเนื่องมาจากเติมหัวเชื้อความเขมขนนอยไปและใชเวลาในการบมเพียง 4-5 ชั่วโมง ประกอบกับหัวเชื้อ S. lactis เปนจุลินทรียที่ผลิตกรดแลกติกในปริมาณสูงปานกลางโดยปริมาณกรดแลคติกที่วัดไดจากผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่ผลิตไดมีคารอยละ 0.38 ดังนั้นการผลิตคอทเทจชีส สเปรดใหมีคาพีเอชต่ําลง สามารถทําไดโดยการเพิ่มปริมาณหัวเชื้อหรือเพิ่มระยะเวลาการบมน้ํานมหรือใชหัวเชื้อผสมระหวางเชื้อ S. lactisรวมกับแบคทีเรียที่ผลิตกรดแลกติกในปริมาณสูงมากไดแกพวก Lactobacilli เชน Lactobacillus thermophilus และ L. helveticus เปนตน

89

เมื่อพิจารณาปริมาณความชื้นและปริมาณไขมันของคอทเทจชีส สเปรดที่ผลิตได จัดเปนเนยแข็งชนิดออนไขมันต่ํา (skimmed milk soft cheese) โดยมีความชื้นไมเกินรอยละ 80 และปริมาณไขมันนอยกวารอยละ 2 (National Dairy Council Education Department, 2001) ใหพลังงาน 106 กิโลแคลอรี/100 กรัม ขณะที่ ครีมคอทเทจชีส สเปรดทางการคา ใหพลังงาน 187. กิโลแคลอรี/100 กรัม โดยมีปริมาณไขมันไมต่ํากวารอยละ 54 ปริมาณโปรตีนและคารโบไฮเดรตเทากับรอยละ 9.3 และ 4.6 ตามลําดับ นอกจากผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดที่ผลิตไดมีปริมาณแคลเซียมเทากับ 323.53 มก/100 กรัม แสดงดังตาราง 16 ซึ่งน้ํานมและผลิตภัณฑจากน้ํานมเปนแหลงแคลเซียมที่สําคัญที่สุด โดยเฉพาะน้ํานมวัวใหแคลเซียมไดถึง 120 มก./100 มล.ในขณะที่น้ํานมคนใหเพียง 30 มก./100 มล.(สุรัตน โคมินทร, 2535)

ตาราง 16 องคประกอบทางเคมีของนมพรองไขมัน ตะกอนโปรตีนและผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรด ที่ผลิตดวยเอนไซมจากฟกเขียวChemical component of skim milk, curd and cottage cheese spread produced by enzyme from Ash gourd

Sample Moisture(%)

Fat(%)

Protein(%)

CHO(%)

Ash(%)

Ca(mg/100ml/g)

Energy(KCal)

Skim milk+CaCl2 *C1

92.8873.88

0.380.98

1.7815.17

4.29.15

0.760.82

118.68323.53

27.34106.1

C2 - <54 9.3 4.6 - - 187.3 * 0.01 M CaCl2C1= Cream cottage cheese spread, C2= Commercial cream cottage cheese spread- not determined

5.3.2 คุณสมบัติทางจุลินทรียของผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรด ผลการตรวจวิเคราะปริมาณจุลินทรียทั้งหมด โคลิฟอรมและอี-โคไล S.

aureus จุลินทรียที่ผลิตกรด และยีสตและรา ในน้ํานมพรองไขมัน (พาสเจอรไรดที่อุณหภูมิ 75 องศาเซลเซียสเปนเวลา 15 วินาที) เอนไซมจากฟกเขียว (พาสเจอไรสที่

90

อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส) เปนเวลา 30 นาที ตะกอนโปรตีนและผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรด พบวา ปริมาณจุลินทรียทั้งหมดที่เจริญไดที่อุณหภูมิปานกลางในเอนไซมจากฟกเขียว น้ํานมพาสเจอรไรส ตะกอนโปรตีนและผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรด มีคาเทากับ 5.1 X10 , 3.6X105 , 3.2X106 , 3.4X106 CFU/มล. ตามลําดับ ซึ่งปริมาณจุลินทรียทั้งหมดที่เจริญไดที่อุณหภูมิปานกลางในน้ํานมพาสเจอรไรสมีคาสูงกวาปริมาณจุลินทรียในน้ํานมที่ผานการพาสเจอไรสซึ่งกําหนดโดยกระทรวงสาธารณสุข ซึ่งกําหนดไวไมเกิน 10,000 CFU/มล. (กองสัตวแพทยสาธารณสุข กรมปศุสัตว, 2539)ทั้งนี้อาจเนื่องมาจากกระบวนการหลอเย็นหรืออาจเกิดการปนเปอนจากวัสดุอุปกรณที่ใชในกระบวนการผลิต สงผลใหปริมาณจุลินทรียทั้งหมดที่เจริญไดที่อุณหภูมิปานกลางในตะกอนโปรตีนและผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรด มีคาสูงเชนกัน ผลการตรวจวัดปริมาณโคลิฟอรมโดยใชตาราง จํานวน MPN 3 หลอด พบวา เอนไซมผงจากฟกเขียว น้ํานมพาสเจอรไรส ตะกอนโปรตีนและผลิตภัณฑคอทเทจแสดงผลเปนลบ ไมพบ โคลิฟอรมในตัวอยาง แสดงวาน้ําที่นํามาใชในกระบวนการผลิตมีความสะอาด ไมมีการปนเปอนของสิ่งสกปรกจากคนและสัตว การตรวจวัดปริมาณเชื้อ S. aureus ในเอนไซมจากฟกเขียว น้ํานมพาสเจอไรส ตะกอนโปรตีนและผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรด ไมพบเชื้อ S. aureus เจริญบนอาหาร BP ซึ่งสาเหตุที่ตองทําการตรวจวัดปริมาณ S. aureus ในผลิตภัณฑเนยแข็ง เนื่องจาก S. aureus เปนจุลินทรียที่ทําใหเกิดโรคสามารถถายทอดโดยทางปาก จมูก ผิวหนัง และ อุจจาระซึ่งแสดงถึงสุขลักษณะของผูปฏิบัติงาน นอกจากนี้ S. aureus สามารถทนตอในอาหารที่มีน้ําอิสระ (available water, aw).ต่ําเทากับ 0.86 โดยแบคทีเรียสวนใหญจะเจริญไดดีในอาหารที่มีคา aw ประมาณ 1 ซึ่งในผลิตภัณฑเนยแข็งเปนผลิตภัณฑที่มีการดึงน้ําออกบางสวนเทานั้น ดังนั้นจุลินทรียสามารถเจริญได (สุมารี เหลืองสกุล, 2535) การตรวจวัดปริมาณจุลินทรียที่ผลิตกรดในตะกอนโปรตีนและผลิตภัณฑคอทเทจชีส สเปรดมีปริมาณ 3.7X104 CFU/มล. และ 2.8X104 CFU/มล. ตามลําดับ ทั้งนี้อาจเนื่องจากในกระบวนการผลิตมีการเติมจุลินทรีย S. lactis รอยละ 5 ลงในน้ํานมพาสเจอรไรส ผลการตรวจวิเคราะหปริมาณจุลินทรียแสดงดังตาราง 17 ผลิตภัณฑคอทเทจชีส

91

สเปรดที่ผลิตได ปลอดจากเชื้อโรค S. aureus และมีคุณภาพทางจุลินทรียอยูในเกณฑมาตรฐานของ USDA วามีปริมาณ โคลิฟอรม ไมเกิน 10 CFU/มล. และปริมาณยีสตและรา ไมเกิน 10 CFU/มล. (United States department of agriculture, 2001)

ตาราง 17 ชนิดและปริมาณจุลินทรียของวัตถุดิบหลักและผลิตภัณฑคอทเทจ ชีส สเปรดType and load of microorganism of raw material and product in cottage cheese spread

Sample Mesophile(CFU/ml.)

Coliforms(MPN/g.)

S. aureus(CFU/ml.)

Lactic acidbacteria

(CFU/ml.)

Yeast mold(CFU/ml.)

Plant enzymeSkim milkCurdCottage cheese

5.1 X103.6 X105

3.2 X106

3.4 X106

NDNDNDND

NDNDNDND

--

3.7 X104

2.8 X104

NDNDNDND

ND = not detected - = not determined