И. В. АртюховИ. В. Артюхов

Крионика: Крионика: основные концепции основные концепции

и методыи методы

1.1. Основные идеиОсновные идеи2.2. КриобиофизикаКриобиофизика

Повреждающее действие холодаПовреждающее действие холода Гипотермия при ТГипотермия при Т≥≥00°°CC Применение криопротекторовПрименение криопротекторов Замораживание. Критерий Смит.Замораживание. Критерий Смит. ВитрификацияВитрификация

1.1. Практика крионикиПрактика крионики Применяемые криопротекторыПрименяемые криопротекторы Идеальный случайИдеальный случай Типичные осложненияТипичные осложнения

Содержание лекции:Содержание лекции:

Основные идеи крионики

• Исходное предположениеИсходное предположение• Различные толкования понятия «смерть»Различные толкования понятия «смерть»• Три ключевых вопросаТри ключевых вопроса

Исходное предположениеИсходное предположение::

• Личность человека представляет из себя Личность человека представляет из себя некоторый объём информации, некоторый объём информации, материальным носителем которой материальным носителем которой является головной мозг.является головной мозг.

Отсюда основная идеяОтсюда основная идея::• Впереди у человечества неограниченно Впереди у человечества неограниченно

много времени для прогресса. Рано или много времени для прогресса. Рано или поздно будет достигнуто всё, что в принципе поздно будет достигнуто всё, что в принципе возможно. возможно.

• На сегодняшний день мы не знаем На сегодняшний день мы не знаем фундаментального принципа, который фундаментального принципа, который запрещал бы восстановление личности по запрещал бы восстановление личности по сохранённой конфигурации нейронных сетей.сохранённой конфигурации нейронных сетей.

• Отсюда задача: сохранить эту конфигурацию Отсюда задача: сохранить эту конфигурацию до времён, когда такое восстановление до времён, когда такое восстановление станет возможно – или будет доказано, что станет возможно – или будет доказано, что это невозможно.это невозможно.

Различные толкования понятия «смерть»Различные толкования понятия «смерть»

• Прекращение дыхания

• Остановка сердцебиения

• «Смерть мозга» - прекращение электрической активности головного мозга

• Разрушение нейронов

• «Информационная смерть»

Сохранение нейронов после Сохранение нейронов после остановки кровообращенияостановки кровообращения

М. К. Недзведь, С. В. Шелег и др., Морфологические изменения коры головного мозга человека при длительной аноксии – Здравоохранение, 7/2003 (Минск)

1.1. Возможно ли в принципе обратимо и надолго Возможно ли в принципе обратимо и надолго заморозить человека (или другое крупное заморозить человека (или другое крупное млекопитающее)?млекопитающее)?

- Вероятно …- Вероятно …

2.2. Возможно ли сделать это Возможно ли сделать это сейчассейчас так, чтобы так, чтобы реанимировать его с помощью технологий реанимировать его с помощью технологий обозримого будущегообозримого будущего??

- Не исключено …- Не исключено …

3.3. Возможно ли будет реанимировать человека, Возможно ли будет реанимировать человека, замороженного с применением замороженного с применением реальныхреальных сегодняшних процедур?сегодняшних процедур?

- Есть надежда!- Есть надежда!

Три ключевых вопроса:Три ключевых вопроса:

Что следует из неопределённости:Что следует из неопределённости:

• Гарантий, конечно, нет – Гарантий, конечно, нет – но попробовать стоитно попробовать стоит

Возможные методы сохранения:Возможные методы сохранения:

• ОбезвоживаниеОбезвоживание• Химическая фиксацияХимическая фиксация• ПластинацияПластинация• … … • Глубокое охлаждениеГлубокое охлаждение

Животные - рекордсмены

Сибирский углозуб - ~90 лет ►

◄ Коловратка - ~30 тыс. лет

Криобиофизика

• Повреждающее действие холодаПовреждающее действие холода• Гипотермия при Т≥0°CГипотермия при Т≥0°C• Применение криопротекторовПрименение криопротекторов• Замораживание. Критерий Смит.Замораживание. Критерий Смит.• ВитрификацияВитрификация

Повреждающее действие холода

На уровне молекулНа уровне молекул Денатурация белков (холодовая и химическая) Фазовый переход в липидах мембраны

На уровне клетокНа уровне клеток Разрыв мембран кристаллами льда

На уровне тканейНа уровне тканей Повреждение межклеточного матрикса Микро- и макротрещины

Денатурация белковДенатурация белков

•Тепловая•Барическая•Радиационная

…•Холодовая•Химическая

У них тепловая денатурация У них тепловая денатурация наступает уже при +6наступает уже при +6°°СС

◄ «Снежная блоха» - ногохвостка Hypogastrura nivicola

Гололобая антарктическая нототения Notothenia neglecta ►

Строение клеточной Строение клеточной мембранымембраны

Фазовый переход в Фазовый переход в мембранемембране

Применение индуцированной гипотермии в анестезиологии

• Начальная гипотермия (34-32°C, без остановки кровообращения)

• Средняя гипотермия ( 31-28°C, остановка сердца до 10 мин.)

• Промежуточная степень гипотермии (27-20°C; на практике не применяется)

• Глубокая гипотермия (19-8°C; остановка сердца 120 мин. и больше)

Существенных проблем, связанных с денатурацией белков или фазовым переходом в мембранах не наблюдалось.

Разрыв клеточных мембран Разрыв клеточных мембран кристаллами льдакристаллами льда

Растрескивание тканей

Печень крысы после замораживания при -20°С

Использование криопротекторовИспользование криопротекторов

Некоторые криопротекторыНекоторые криопротекторы

• Глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль• ДМСО, ДЭСО• этанол, метанол• формамид, метилформамид • пропандиол

…• трегалоза, сахароза• полиэтиленгликоль• фиколл

…

Молекулы некоторых криопротекторов

Этиленгликоль Глицерин

ДМСО Формамид

Метанол

Токсичность криопротекторов

Метанол, ЭГ, ФА считаются высокотоксичными веществами (поражают ЦНС, почки, печень), но основной вклад вносят их метаболиты. Однако, в используемых высоких концентрациях токсичны все вещества.

Причины токсичности различных криопротекторов пока плохо изучены. Среди них:

• Осмотический стресс (особенно, для непроникающих КП)

• Разрушение клеточных мембран (ДМСО)

• Возможно, химическая денатурация каких-то белков.

Для разных клеток/тканей,видов и, даже, индивидуумов относительная токсичность может быть очень разной. Так, для эмбрионов мыши глицерин оказывается более токсичным,чем ДМСО, который токсичнее ЭГ.

Снижение токсичности

• Использование комбинаций криопротекторов (так, комбинация ДМСО и формамида менее токсична, чем эти вещества по-отдельности; ЭГ также несколько снижает токсичность ДМСО).

• Повышение концентраций и переход к более токсичным КП по мере снижения температуры.

Замораживание (freezing) и витрификация

• Замораживание: часть воды переходит в лёд

• Витрификация: вода переходит в аморфное (стекловидное) состояние

Замораживание. Критерий Смит.

В экспериментах на джунгарских хомячках О. Смит показала, что при условии перехода в лёд не более ~60% воды не наблюдалось заметных нарушений их поведения. Это наблюдение послужило обоснованием «критерия Смит»: стремиться не допускать замерзания более 60% воды.

Например, при использовании глицерина это достигается при его концентрации ~27% об.

Dr Audrey Smith, circa 1960s

Продемонстрировано обратимое Продемонстрировано обратимое замораживание целой печенизамораживание целой печени

Израильские учёные разработали методику, позволяющую целиком обратимо замораживать крупные органы со сложной внутренней структурой. Технология была проверена на крысиной и свиной печени. После разморозки органы сохраняли более 80% жизнеспособности.

Ранее эта же группа продемонстрировала обратимое сохранение овечьего яичника, крысиных сердца и печени.

Zohar Gavish, Menachem Ben-Haim, Amir Arav. Cryopreservation of Whole Murine and Porcine Livers. Rejuvenation Research. August 1, 2008, 11(4): 765-772.

ВитрификацияВитрификация

2 литра раствора М22 в состоянии витрификации при Т=-124.4оС

Для достижения витрификации используются более высокие концентрации криопротекторов и высокие скорости (соответственно, меньшие времена) охлаждения/согревания

«Опасные зоны»:

• ~-40 ... -80°C - зона наиболее быстрого роста кристаллов льда.

• ~-100 … -120°C - зона наиболее интенсивной нуклеации.

Фазовая диаграмма системы глицерин-вода

Некоторые растворы, применяемые для витрификации

Источник: G.M. Fahy, B. Wowk, J. Wu, J. Phan, C. Rasch, A. Chang, E. Zendejas, Cryopreservation of organs by vitrification: perspectives and recent advances, Cryobiology 48 (2004) 157-178.

Девочка, рождённая из Девочка, рождённая из витрифицированного эмбрионавитрифицированного эмбриона

Обратимая витрификация почки кроликаОбратимая витрификация почки кролика

Практика крионики

• Криосохранение всего тела vs. нейрокриосохранение

• Применяемые криопротекторы

• «Идеальный» случай...

• … и распространённые осложнения

Криосохранение всего тела vs. нейрокриосохранение

• Криосохранение всего тела (full body) - Как правило, производится витрификация головного мозга с замораживанием остального тела. Последнее время делаются попытки витрификации всего тела.

• Нейрокриосохранение — сохранение только головы или только головного мозга.

Этапы крионического процессаЭтапы крионического процесса::

1.1. Подготовительный (прижизненный)Подготовительный (прижизненный)2.2. Подготовительный (посмертный)Подготовительный (посмертный)3.3. Глубокое охлаждениеГлубокое охлаждение4.4. ХранениеХранение5.5. ВосстановлениеВосстановление

Идеальный случай

• Нет тромбоза сосудов головного мозга или других препятствий к его перфузии

• Есть возможность провести прижизненную премедикацию

• Есть возможность начинать манипуляции непосредственно после остановки кровообращения

• Всё оборудование и реактивы находятся под рукой

Этап 1: прижизненная подготовкаЭтап 1: прижизненная подготовка:: Препараты, рекомендуемые Cryonics Institute для прижизненной подготовки

SUPPLEMENT DAILY DOSEα-Lipoic Acid 750 milligramsCoEnzyme Q10 500 milligramsMixed tocopherols 2,000 IUsSelenium 400 microgramsCarnosine 2.5 gramsMagnesium Oxide 1 gramAcetyl-L-Carnitine 1 gram

Также могут использоваться:Также могут использоваться:

1.1. Гепарин (если возможно)Гепарин (если возможно)

2.2. Тромболитики (по показаниям)Тромболитики (по показаниям)

3.3. Антигипоксанты (оксибутират, карнитин, сукцинат ...)Антигипоксанты (оксибутират, карнитин, сукцинат ...)

4.4. Противовоспалительные (ибупрофен, аспирин — если возможно)Противовоспалительные (ибупрофен, аспирин — если возможно)

5.5. Другие антиоксиданты (Другие антиоксиданты (кромекроме аскорбиновой кислоты!) аскорбиновой кислоты!)

6.6. Блокаторы кальциевых каналовБлокаторы кальциевых каналов

Этап 2: посмертная подготовкаЭтап 2: посмертная подготовка::

2.1. Охлаждение (особенно, головного мозга)2.1. Охлаждение (особенно, головного мозга)2.2. Введение гепарина, тромболитиков, 2.2. Введение гепарина, тромболитиков,

антиоксидантов, мембранопротекторов, антиоксидантов, мембранопротекторов, ингибиторов апоптоза, хелаторов, ингибиторов апоптоза, хелаторов, антибиотиков и др. - с применением антибиотиков и др. - с применением искусственного кровообращения или искусственного кровообращения или непрямого массажа непрямого массажа

2.3. Перфузия раствором криопротектора2.3. Перфузия раствором криопротектора

Устройство для непрямого массажа фирмы Lucas

Охлаждение головного мозга

• Обкладывание головы и шеи пакетами с водой со льдом (при сохранении всего тела — погружение в ванну с водой со льдом)

• Подача водно-ледяной смеси (Ice slurry) в носоглотку

Перфузия

1. Открывается доступ к сонным артериям и подъярёмным венам.

2. В артерии вводятся канюли перфузионной системы*; вены каннюлируются для слива.

3. Производится промывание кровеносного русла промывочным раствором, охлаждённым до 0°С.

4. Производится перфузия растворами криопротектора с нарастающей концентрацией и понижающейся температурой.

5. По достижении целевой концентрации производится максимально быстрое охлаждение до температуры, максимально близкой к темпертуре витрификации (но не выше ~-80°C).

______________

* Необходимо исключить попадание в кровеносное русло пузырьков воздуха!

Растворы для витрификации

М22 (Alcor) CI−VM−1

Dimethyl sulfoxide 22.305%Formamide 12.858%Ethylene glycol 16.837%N-methylformamide 3%3-methoxy-1,2-propanediol 4%Polyvinyl pyrrolidone K12 2.8%X-1000 ice blocker 1%Z-1000 ice blocker 2%

About 8.3 liters of 70% CI−VM−1 is made with:2.83 liters Ethylene glycol (3.15 kg) + 2.83 liters DMSO (3.14 kg) + 1.0 liter of (9X concentrated) carrier solution* (about one kg) + 1.70 liters of water (about 1.7 kg)

В качестве носителя используется модифицированный RPS−2 (Renal Preservation Solution two).

Проблема вязкости перфузата

Специфична для криоконсервации органов и целых организмов.

• Сахара ▼

• полиэтиленгликоль ▼

• глицерин ▼

• этиленгликоль ▼

• ДМСО

Охлаждение до температуры хранения

• Необходимо как можно быстрее проскочить 1-ю «опасную зону» (~-40°C .. -80°C) во избежание образования кристаллов льда

• Желательно как можно быстрее проскочить 2-ю «опасную зону» (~-100°C .. -120°C) во избежание нуклеации (образования зародышей кристаллов льда), которая приведёт к образованию кристаллов на этапе согревания

• На этапе ~ -120°C .. Твитр

скорость охлаждения не имеет

большого значения

• В случае хранения при температуре ниже Твитр

охлаждение

до температуры (и любые другие изменения температуры) хранения должно производиться как можно медленнее.

Повреждения на этапах 2- 4Повреждения на этапах 2- 4::

1.1. Разрушение нейронов вследствии Разрушение нейронов вследствии аутолиза, апоптоза и др.аутолиза, апоптоза и др.

2.2. Осмотический шокОсмотический шок3.3. Токсичность криопротектораТоксичность криопротектора4.4. Холодовая денатурация белковХолодовая денатурация белков5.5. Повреждения кристаллами льдаПовреждения кристаллами льда6.6. Образование микро- и макротрещинОбразование микро- и макротрещин

Распространённые осложнения

• Прижизненные повреждения ГМ

• Посмертный тромбоз сосудов ГМ

• Запаздывание охлаждения ГМ и последующих этапов

• Анатомические особенности строения кровеносных сосудов ГМ.

Прижизненные повреждения головного мозга

• травмы,

• опухоли,

• нейродегенеративные заболевания,

• хроническая ишемия,

• ишемический или геморрагический инсульт

• ...

Анатомические особенности строения кровеносных сосудов ГМ

При некоторых отклонениях в строении кровеносной системы (аномалии Виллизиева круга) перфузия через сонные артерии оказывается недостаточной. В этом случае необходима дополнительная перфузи через позвоночную артерию.

Выявить аномалию Виллизиева круга возможно с помощью ангиографии (напр., добавив в перфузат рентгеноконтрастное вещество).

Перспективные, но Перспективные, но неопробованные методынеопробованные методы

• Использование высоких давлений в Использование высоких давлений в комбинации с адиабатическим охлаждениемкомбинации с адиабатическим охлаждением

• Использование ультразвукаИспользование ультразвука• Использование СВЧ – полейИспользование СВЧ – полей• Использование «жидкого льда»Использование «жидкого льда»• Использование инертных газов в качестве Использование инертных газов в качестве

криопротекторовкриопротекторов• Быстрое охлаждение с продувом гелия через Быстрое охлаждение с продувом гелия через

кровеносное руслокровеносное русло

Использование «жидкого льда»Использование «жидкого льда»(«(«ice slurryice slurry»)»)

Использование «жидкого льда» приИспользование «жидкого льда» прилапароскопической операции на почкелапароскопической операции на почке

Структура: взвесь частиц льда менее 0.1 мм в разведённом солевом растворе.

Возможные применения для внутреннего охлаждения криопациентов:• Доставка в полости тела (напр., носоглотку)• Введение в легкие с помощью эндотрахеальной трубки + непрямой массаж сердца• Перфузия взвесью микрочастиц льда в растворе криопротектора.

Эксперимент с замораживанием Эксперимент с замораживанием сердца крысысердца крысы

Патент RU 2 268 590 C1

ВосстановлениеВосстановление(современные представления)(современные представления)::

1.1. Восстановление головного мозга – Восстановление головного мозга – наномедицинские технологиинаномедицинские технологии

2.2. Восстановление остального тела при его Восстановление остального тела при его криосохранении - наномедицинские криосохранении - наномедицинские технологии технологии

3.3. Восстановление остального тела при Восстановление остального тела при нейрокриосохранении – терапевтическое нейрокриосохранении – терапевтическое клонирование, инженерия тканей и органов, клонирование, инженерия тканей и органов, клеточная клеточная 3D3D-литография, протезирование, -литография, протезирование, наномедицинские технологиинаномедицинские технологии

НаномедицинскиеНаномедицинские технологии оживления: технологии оживления:

«Ремонт» с помощью нанороботов«Ремонт» с помощью нанороботовK. E. Drexler, Engines of Creation, Снаpter 9 «A Door to the Future» (1986)Ralph C. Merkle, The Molecular Repair of the Brain - Cryonics, Vol. 15 No's 1 & 2, (1994)

Послойное сканирование с Послойное сканирование с восстановлениемвосстановлениемMichael Soloviov, Atomic Printers Or Time Estimation Of Atom-by-atom Brain Assembling - Longevity Report, Volume 6 no 48 (1994)

Управляемый эмбриогенезУправляемый эмбриогенезMikhail Soloviev, Reanimation by Artificial Embryogeny - Longevity Report, Volume 11 no 58 (1997)

...?...?

Спасибо за внимание!Спасибо за внимание!