第二章 微生物的觀察與檢驗

顯微鏡構造及使用微生物染色微生物鑑定

第一節　顯微鏡構造及使用 顯微鏡的種類與功能

顯微鏡若依觀察方法的差異性，則可區分為明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、位相差顯微鏡、干擾相差顯微鏡、偏光顯微鏡、紫外光顯微鏡、螢光顯微鏡、雷射共軛焦顯微鏡、解剖顯微鏡與電子顯微鏡等特定功能之顯微鏡。

光學顯微鏡 原理

光學顯微鏡是由二組凸透鏡（物鏡、目鏡）組成。欲觀察的物體先經物鏡聚成一放大的倒立實像，該倒立實像於顯微鏡成像過程中僅屬於過渡性的影像，此倒立實像恰巧落於目鏡的焦點內，所以當人眼緊靠目鏡的出視孔時，可觀察到倒立實像經目鏡放大後的更加放大之倒立虛像。

放大率 顯微鏡的放大功能原理是將物鏡和目鏡做適當地調整組合，以放大欲觀察物體（標本）之影像。

物鏡的功能為使被觀察物體成一個倒立放大的實像。低倍鏡常用於搜索觀察對象及觀察標本全貌，高倍鏡則用於觀察標本某部分或較細微的結構，油鏡則常用於觀察微生物或動植物更細微的結構。

目鏡的功能則是將物鏡形成的實像再一次放大成虛像。

顯微鏡總放大率＝物鏡之放大倍數×目鏡之放大倍數。

解像力 解像力是指鏡頭能清楚分辨二相近物體間最小距離的能力。若鏡頭中有二個物體接近到幾乎重疊時，此時通過物體的光線會產生繞射，進而在物體周圍產生一系列光圈，使得二物體無法被清楚辨識，此即表示鏡頭對該二物體已失去解像力。

顯微鏡解像力可由下列數學公式表示：

式中 D 值愈小，表示顯微鏡的解像力愈好，亦即物體可視的二點最短距離很小時仍可以被辨識。由式 (1) 可知，顯微鏡解像力與入射光波長、光入射角、介質的折射率有關。

入射光光源波長： λ 值愈大， D 值愈大； λ 值愈小， D 值愈小，亦即入射光波長愈長，顯微鏡辨識物體的解像力愈差；入射光波長愈短，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。

光入射角： sinθ 值愈小， D 值愈大；sinθ 值愈大， D 值愈小，亦即光入射角愈小，顯微鏡辨識物體的解像力愈差；光入射角愈大，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。

顯微鏡解像力有實質幫助的光入射角度最大值僅為 140° 。

介質的折射率： n 值愈小， D 值愈大； n 值愈大， D 值愈小，亦即標本與物鏡間介質的折射率愈小，顯微鏡辨識物體之解像力愈差；標本與物鏡間介質的折射率愈大，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。

數值孔徑 (numerical aperture) ：亦稱光口徑，是表示經由聚光鏡至物鏡所產生錐狀光圈的量度。

電子顯微鏡 電子顯微鏡與光學顯微鏡的原理極為相似，差異在於電子顯微鏡以電子束取代光線，電磁鐵透鏡取代玻璃透鏡，由於電子輻射的波長比可見光小很多，故大幅提昇解像力（普通光學顯微的最小解像距離為0.2μm ，電子顯微鏡可達到 0.001μm ，亦即 10 　）。Ａ

光學顯微鏡1. 明視野顯微鏡2. 暗視野顯微鏡3. 位相差顯微鏡4. 螢光顯微鏡

光學顯微鏡 明視野顯微鏡

明視野顯微鏡是以自然光或鎢絲燈（電燈）為光源照射樣本，通過與未通過樣本之光線皆進入物鏡中，使得樣本本身呈陰暗，視野背景為明亮狀態。

暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡與明視野顯微鏡相似，皆利用可見光為光源照射樣本，唯一差異在於暗視野顯微鏡的聚光鏡中央有暗視環，使照明光線不直接進入物鏡，只允許被樣本散射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景為陰暗，物體的邊緣為明亮。

位相差顯微鏡 位相差顯微鏡利用菌體內各部位密度的差異，進而對入射光線產生不同的散射，使得活細胞內不同部位產生明顯對比，藉此辨別活細胞內各種構造。位相差顯微鏡較普通光學顯微鏡多了環狀光圈與位相板（位相移動片）等構造。

螢光顯微鏡 螢光顯微鏡是藉由樣本發出的光來達到觀察之目的。某些物質經激發光照射後會產生螢光，無法產生螢光的物質亦可利用螢光染劑與欲觀察的物質結合後產生。螢光顯微鏡包含光源、激發濾光片、螢光樣本與阻斷濾光片等基本元件。

電子顯微鏡 掃描式電子顯微鏡 穿透式電子顯微鏡

掃描式電子顯微鏡 掃描式電子顯微鏡主要用於用來觀察樣本的表面結構。以掃描式電子顯微鏡觀察微生物菌相時須經過煩瑣之前處理過程，其過程包括菌體收集、樣本（菌體）固定、樣本脫水、臨界乾燥、鑲嵌及鍍金。

穿透式電子顯微鏡 穿透式電子顯微鏡多應用於細胞內結構之觀察。穿透式電子顯微鏡樣本製備包括樣本初步固定、樣本清洗、二次固定、脫水、過渡溶劑滲透、塑膠滲透、包埋及聚合。

電子顯微鏡

放線菌的孢子鏈

第二節 微生物染色

1. 染色目的2. 染色原理3. 染劑4. 染色方法 (1)簡單染色 (2) 鑑別染色

革蘭氏染色 (Gram stain)

應用的溶液

反應及細菌外觀

G+ G- Time

1. 結晶紫(主染劑 )

細胞染成紫色 細胞染成紫色 60 sec

2.碘液(媒染劑 )

細胞內形成 CV-I複合物，紫色

細胞內形成 CV-I複合物，紫色 60 sec

3.乙醇(脫色劑 )

細胞壁脫水，發生多孔性收縮，降低 CV-I滲出細胞，紫色

脂質抽出，增加多孔性， CV-I從細胞移出，無色

30 sec

4.番紅( 對比染劑 )

細胞不受影響 發生染色而變粉紅色

30 sec

結核桿菌與抗酸性染色 結核桿菌不會馬上致命，但具有高度傳染力的病患透過飛沫傳染，擴散率相當高，快速檢驗患者並與以隔離是相當重要的。結核病大都是結核桿菌引起的，由於結核桿菌細胞膜上的脂質比其他細菌豐富，經染色後不易被酸性的酒精洗除脂質而退色，故名抗酸性染色。因此抗酸性染色為初步辨識結合桿菌的方法之一。 何謂酸性酒精？

含有 3%鹽酸及90~95%乙醇。

微生物檢驗1. 顯微鏡觀察2. 測定影響微生物生長因子

(1) 物理因子 (2)化學因子 a. 能源 b.碳源 c.氮源

第三節微生物檢驗方法1. 微生物的定性觀察2. 微生物大小的量測3. 總菌數測定4. 大腸菌類數目

微生物大小的量測

鏡臺測微計

總菌數測定1. 直接計數法(cells/ml ， filament/ml ， unit/

ml)

2. 間接計數法 (平板計數法， CFU/ml)

CFU:colony forming unit

血球計數器 : 細菌、小型單細胞藻

Sedgwick-Rafter (S-R) counting cell ：藻類計數