הגנים מאלפימחקרים קובץבביוטכנולוגיה

מצגת – ועיצוב עריכה

צור 2004תמי

פרק ב' – שיבוט גנים וביטויים בחיידקים ובתרביות

תאים

ביוטכנולוגיה המבוססת על הנדסה גנטית •מאפשרת העברת גנים בין מינים רחוקים

)שבירת מחסום המינים(

מבנה החומר

התורשתי

ייצוגים סכמתיים שונים של מולקולת

DNA דו גדילית.

בהמשך, נשתמש בכל אחת מדרכי

התצוגה האלה לחלופין.

א. החומר התורשתי בחיידק

ב. החומר התורשתי.

לתכונהDNAמ

, מכונה גן.RNA המקודד לחלבון או DNAרצף •

הגדרה רחבה יותר – • שמכיל את היחידה התפקודית DNAגן – מקטע •

שקובעת תכונה תורשתית )או חלק ממנה(, .RNAבדרך כלל חלבון או

הגן כולל את האזורים המקודדים לחומצות •אמיניות, ביחד עם אזורי הבקרה והאזורים

שעוברים עריכה ושחבור.

DNAמ – לחלבון

שרשרת חומצות אמיניות יוצרת את המבנה הראשוני

של החלבון.

מבנה שלישוני של חלבון.

ישנן תכונות שלא נראות לעין

חשוב לדעת – •

גן יחידישנן תכונות שמופיעות כתוצאה מפעילות של •)קצב הגידול של אורגניזם כמו דג הסלומון משתנה בהשפעת הורמון הגדילה, המקודד על ידי גן יחיד(

יש תכונות שבהן מעורבים מספר גנים.•

משילוב ביטויין של תכונות כמו גובה ומשקל, מושפע •.בין גנים וגורמים סביבתיים

של התא מורכב DNAלא כל ה – מגנים

ישנם קטעים שאינם מקודדים לחלבונים ואינם •משחקים תפקיד ידוע בבקרה על פעילות הגנים.

בפרוקריוטים קטעים אלה קצרים.•

DNA מכלל ה - 97%בגנום האדם מהווים כ – •

המטען התורשתי של מין מסויים יכול להשתנות במספר דרכים

בתהליך הרקומבינציה נוצרים צרופים רקומבינציה:• קיימים. תהליך זה מתרחש למשל DNAחדשים בין קטעי

במהלך יצירת תאי הרבייה )מיוזה(. כאשר נגיפים חודרים לתא, המטען התורשתי שלהם משתלב במטען התורשתי

של התא בתהליך רקומבינציה. מוטציה היא שינוי בנוקלאוטיד אחד או יותר מוטציה:•

. מוטציה יכולה לגרום לשינוי ברצף ה – DNAברצף ה RNA שליח, שעשוי לגרום לשינוי ברצף חומצות

האמיניות של החלבון ויתכן אף לשינוי במבנה המרחבי של החלבון, עד כדי אובדן פעילותו או רכישת פעילות שונה.

תעתוק במהופך

. RNAישנם נגיפים שהמטען התורשתי שלהם מורכב מ – • עובר תעתוק הפוך RNAעם כניסתם לתא המאכסן, ה – •

על ידי אנזים מיוחד המכונה אנזים מתעתק DNAלמולקולת במהופך.

שגורם לאיידס: HIVלמשל, זאת דרך פעולתו של נגיף ה – • שתועתקה במהופך משתלבת בתוך ה – DNAמולקולת ה –

DNA.של התא והופכת את הנדבק לנשא של גנום הנגיףחוקרים משתמשים באנזים המתעתק במהופך על מנת ליצור •

.RNA לפי התבנית של מולקולות DNAבמבחנה מולקולת

העכבר )הימני( הזוהר שנוצר על ידי שילוב הגן המקודד לחלבון GFB שמקורו במדוזה, בגנום שלו. העכבר השמאלי משמש

להשוואה.

מהו מנגנון הבקרה לביטוי הגנים?

בכל גן אפשר להגדיר שני סוגים של אזורים בעלי •תפקיד שונה:

אזורים המקודדים לחלבון. אזורים מבניים – • שליח ובהמשך תורגם RNAמהם מתועתק ה –

החלבון. אזורים האחראים על הבקרה של אזורי בקרה - •

ביטוי הגן. ביניהם ישנם אזורי בקרה המסמנים את התחלת התעתוק של הגן ואזור המסמן את

סיום התעתוק.

בפרוקריוטים

מספר גנים יכולים להיות מאורגנים תחת בקרה •.לאזור המבני הנמצא בסמוך אזור בקרהמשותפת שלא

, כוללת בדרך כלל אופרוןיחידת ארגון זאת, המכונה •גנים המעורבים בתהליך משותף )למשל, כולם מקודדים

לאנזימים המעורבים ביצירת חומצה אמינית מסוימת( ביחד. והם מתבטאים

, חלבוני בקרה של ביטוי האופרון נעשית על ידי הבקרה•המתקשרים לרצפים שונים באזור הבקרה ופועלים

כמעכבים או מפעילים של תהליך התעתוק.

– פרוקריוטייםבקרה על ביטוי גנים ב

האיור מתאר אופרון המורכב משלושה גנים ואזור בקרה

באיקריוטים.מספר אזורי בקרה כל גן מבוקר בנפרד על ידי•

חלק מאזורי הבקרה יכולים להימצא במרחק רב מהגן שהם •מווסתים או אף בתוך הגן עצמו, באזורים שעוברים עריכה

לאחר התעתוק.

מהבקרה מורכבת יותר הבקרה של הגנים האיקריוטים•בפרוקריוטים ומעורבים בה מספר רב יותר של חלבוני

בקרה. אלה הם חלבונים הנקשרים לרצפים ייחודים באזורי הבקרה •

או זה לזה ובצורה זאת מעכבים או מגבירים את תעתוק הגן.

משתנה בסוגים שונים של תאים, מגוון חלבוני הבקרה•בשלבים שונים בהתפתחות העוברית ובהשפעת גורמים סביבתיים או פנימיים. השינוי במגוון של חלבוני הבקרה

גורם לביטוי של גנים שונים.

– באוקריוטייםבקרה על ביטוי גנים

האיור מתאר גן המורכב מאזור מבני ואזור בקרה.

(5שקופית - הגדרה רחבה יותר) היום נהוג להגדיר לגן

הינדוס - פירושים רבים לו

סיפור מקרה:

מאדם נוצר הורמון הגדילהבחיידקים

מידע - • חומצות אמיניות.191הורמון הגדילה הוא חלבון קצר • לזרם הדם.מופרש מההיפופיזה• על גדילת העצמות הארוכות של הגוף, בניית מסת משפיע•

השריר ועל חילוף החומרים בתאים. – גורמים לעיכוב יצירת ההורמון.פגמים בהיפופיזה• מתבטא בננסות שבה הפרופורציות בין אברי העדר ההורמון•

הגוף הן נכונות, אבל הילדים נמוכים יחסית לבני גילם.פתרונות – • אינו יעיל באדם.הורמון הגדילה המופק מבעלי חיים•.נמוכה כמות ההורמון המופק מנפטרים – • )מחלה עלול להעביר למטופל מחלות החומר המופק •

ניוונית של המוח(

טכנולוגית ההנדסה הגנטית, איפשרה בראשית שנות השמונים ייצור של הורמון

הכנסת הגן מאדם גדילה של אדם על ידי .לחיידקים השלבים העיקריים בתהליך הם:•

בידוד הגן מגנום האדם או יצירת גן משלים.•

חיבור הגן לפלסמיד שמשמש כנשא.•

הכנסת הגן המהונדס על גבי הפלסמיד לתאי •חיידקים.

ביטוי הגן בחיידקים.•

גידול החיידקים בכמויות גדולות והפקת ההורמון.•

בידוד הגן המקודד להורמון הגדילה באדם.

הגן )כמו רוב הגנים באיקריוטים( מכיל אזורים שעוברים עריכה •לאחר שלב התעתוק ואינם משתתפים בבניית החלבון עצמו.

היות ומעוניינים שהגן יתבטא בחיידקים, שבהם לא מתבצע • השליח, יש להכניס לחיידקים רק RNAתהליך העריכה של ה –

את קטעי הגן שעוברים תרגום.

עושים זאת בדרך הבאה:•

משלים בעזרת האנזים המתעתק במהופך.DNAיצירת

שליח שמקודד להורמון הגדילה. מולקולות RNAמבודדים מולקולות 1.. רצפים שיעברו תרגוםרקאלו עברו עריכה ושחבור, ולכן מכילות

שליח משתמשים ברקמת גידול RNAלצורך הפקת כמות גדולה של סרטני של ההיפופיזה המפרישה את הורמון הגדילה ברמה מאוד

גבוהה.

DNAבמבחנה, בעזרת האנזים המתעתק במהופך, יוצרים מולקולות 2. המשלים שנוצר DNA שליח. ה – RNAמשלים, לפי התבנית של ה –

מכיל את כל הרצפים שמתורגמים להורמון הגדילה.

חיבור גן לנשא

על מנת להכניס את הגן מקודד להורמון הגדילה ש לחבר • מתאים שיאפשר את שכפולו במספר רב של נשאאותו ל

עותקים. נחשבים לנשאים מתאימים.פלסמידים• מעגלי, המתרבות DNAפלסמידים הם מולקולות של •

בתא החיידק באופן עצמאי.הם מכילים גנים המקודדים לעמידות לאנטיביוטיקה.•הם מתרבים במהירות בתוך תא החיידק ומספרם יכול •

להגיע למאות עותקים בתוך התא.

את המולקולה המעגלית של הפלסמיד, כדי לחבר אליה את לחתוךיש תחילה •הגן.

)תפקידם המקורי לפרק את החומר באנזימי הגבלהזו משתמשים למטרה •התורשתי של נגיפים הפולשים לתוך תא החיידק.

– כל סוג של אנזים אנזימי ההגבלה הוא ייחודיהמתבצע על ידי החיתוך • 4-8 אך ורק ברצף נוקלאוטידי ייחודי, שאורכו DNAהגבלה חותך את ה –

נוקליאוטידים.

לתוצרי החיתוך קצוות DNAאנזים הגבלה מזהה רצף ייחודי וחותך את ה – חד גדילי.DNAקצרים של

Eco R1באיור – חיתוך עם אנזים ההגבלה

אנזים ליגאז באמצעות DNAחיבור בין קטעי

פלסמיד מהונדס –

פלסמיד הנושא גן מהונדס המקודד להורמון הגדילה,

ויכול להתבטא בתאי החיידק.

על מנת שהגן שמקורו באדם יוכל להתבטא בחיידקים, הוא צריך להכיל אזור פולימרז וחלבוני הבקרה של RNAבקרה המוכר על ידי האנזים המתעתק ה –

החיידק.

לכן, יש לחבר לפלסמיד, המשמש כנשא, גם אזור בקרה שיאפשר את תעתוק הגן בחיידק.

הכנסת הנשא לתוך החיידק

מתוך המצע בו DNAחיידקים קולטים מולקולת •טרנספורמציה.הם נמצאים בתהליך הנקרא

חלק קטן מהחיידקים יקלטו את הפלסמיד •המהונדס.

יש לבודד את החיידקים שקלטו את הנשא.•

שימוש בגן מדווח לזיהוי מושבות 1.שעברו טרנספורמציה.

גן מדווח יוצר תוצר שקל לזהותו, כמו למשל צבע או זהירה )אור(.

אם מחברים את הגן המדווח לנשא המהונדס – רק החיידקים שמכילים את הנשא המהונדס יהיו בעלי צבע

או זהירה.

האפשרויות לבידוד החיידקים נושאי הפלסמידים המהונדסים

. שימוש בגן בורר לזיהוי מושבות שעברו טרנספורמציה2

גן בורר מאפשר לברור מכלל החיידקים את החיידקים שקלטו את הנשא , אותו בגן המקנה עמידות לאנטביוטיקההמהונדס. בדרך כלל משתמשים

מחברים לנשא המהונדס. זורעים את החיידקים שבתערובת על מצע מוצק עם שורדים רק החיידקים שעברו טרנספורמציה אנטיביוטיקה מתאימה.

ורכשו את הגן לעמידות.

גידול חיידקים - חיידקים מתרבים ברבייה אל מינית.

ד'.E.Coli 20זמן הדור של

במהלך גידול החיידקים, גם הפלסמידים מתרבים בתוכם. התרבות הפלסמיד בתוך החיידק אינה תלויה בהתחלקות תא החיידק ולכן נוצרים בחיידק עותקים רבים של פלסמידים, מחיידק בודד, שקלט מולקולה אחת של נשא מהונדס עם

הגן של הורמון הגדילה, אפשר לקבל תוך מספר שעות מיליוני עותקים זהים של הגן.

DNA – שבט זהה של ולקולת DNAלתהליך הזה קוראים גם שיבוט

סיכום תהליך השיבוט של הורמון הגדילה

מאדם בחיידקים

זיהוי החיידקים שעברו טרנספורמציה בעזרת

גן מדווח או גן בורר

בדיקת הביטוי של הגן השליח: RNAבדיקה ברמת ה – •

RNA מפרקים חלק מהחיידקים ומגיבים את ה – . )הגלאי תגובת צבעשבתאיהם עם גלאי ייחודי שיוצר

בעל רצף משלים לרצף של ה RNA או DNAמכיל קטע –RNA – השליח של הורמון הגדילה. אם אכן ה RNA

השליח הזה נוצר בתאים, הגלאי ייצמד אליו באופן ייחודי . – הגן עבר תעתוק בתאי החיידק.תגובת צבעותופיע

בדיקה ברמת החלבון:• אם הגן מתבטא, יווצר חלבון, הוא הורמון הגדילה, אפשר

לזהותו בעזרת גלאי הנקשרים לחלבון באופן ייחודי גלאים אלה מכילים נוגדנים תגובת צבע.ויוצרים

צבע תצביעהנקשרים לאתרים ייחודים בחלבון. הופעת על נוכחות החלבון.

מזרק ידידותי למשתמש עם הורמון גדילה

א. עבודה במנדף סטרילי

ב. תאים בתרבית יוצרים שכבה על

קרגעית צלחת ממצע מזון נוזלי

הגדלים CHOג. תאי בתרבית )חלבוני שלד התא והגרעין נצבעו עם נוגדנים

זוהרים(

תרביות תאים אנימליים

אפשר לבודד תאים מתוך רקמה ולגדלם במנותק מהגוף בתרבית תאים.

ישנם תאים שקצב התרבותם גבוה ותאים אחרים )תאי עצב( שבלתי אפשרי ליצור מהם תרבית תאים.

את תרבית התאים מגדלים באינקובטור – בו התנאים סטריליים והטמפ', הלחות, ההרכב גזים מבוקרים.

הכנסת גנים לתוך תאים אנימליים

היום מקובלות מספר שיטות להכנסת גנים תלוך תאים אנימליים:

טרנספקציה. שמעוניינים להחדיר לתא – DNAטיפול כימי ב – 1.

הזרקה לתוך תאים באמצעות מחט בעלת קוטר מיקרוסקופי.2.

הפעלת שדה חשמלי המשנה את תכונות החדירות של קרום 3..אלקטרופורציה מהתמיסה - DNAהתא ומאפשר קליטת

שימוש בנגיפים.4.