טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית

. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים1•

: טכניקה לבידוד מקטע - cloningשיבוט . 2•DNA

DNA (sequencing). ריצוף 3•

•4 .PCR

•5 .microarray.) ביו-ציפ(

אנזימי רסטריקציה

Cohesive מתלכד =

5 ’overhang

3 ’overhang

cloning

polylinker

פלסמידהשיבוט

• Plasmid cloning

האם ניתן לשבט מקטע דנא שנחתך בשתי קצוותיו באינזים שחותך קצה

( לתוך פלסמיד blunt endsישר )שגם הוא נחתך עם אותו אינזים

רסטריקציה?אי אפשר כי אין נקודת אחיזה1.

אפשר כי מבחינה הסתברותית 2.קצה ישר יגיע למגע עם קצה ישר

שני

כמה אפשריות חיבור (אורינטציות) יש בין פלסמיד שנחתך באינזים רסטריקציה

) לבין רצף bluntשיוצר קצוות ישרים ( שנחתך באותו אינזיםDNAשני של

. אחד1•

. שניים2•

. שלוש3•

. ארבע4•

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית

. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים1•

. שיבוט2•

DNA (sequencing). ריצוף 3•

•4 .PCR (polymerase chain reaction)

•5 .microarray.ביו-ציפ

Taq polymerase

PCR – polymerase chain reaction

30 sec for 1Kb = elongation

PCR

PCR first

In vitro mutagenesis /site-directed mutagenesis – מומלץ לצפייה

Creating transgene mouse

PCR-2

Site-directed mutagenesis

The PCR product on the gel

עזרה בתרגיל

F

R

http://www.tau.ac.il/~gilast/

ביום ראשון לא יהיה שיעור

2010תרגיל בשיבוט-

בסיסים18אורך פריימר לא פחות מ-תכנון פריימרים למוטציה שונה מתכנון פריימרים להגברת מקטע כלשהו

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית

. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים1•

. שיבוט2•

DNA (sequencing). ריצוף 3•

•4 .RCP

•5 .microarray.ביו-ציפ

DNA sequencing

SEQUENCINGריצוף דנא -

אוטומטיDNAמכשיר ריצוף

ריצוף הגנום האנושי

גרג וונטר

Deep sequencing: the technology

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית

. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים1•

. שיבוט2•

DNA (sequencing). ריצוף 3•

•4 .RCP

•5 .microarrayביו-ציפ .

Principle of Microarray (Chip) Assay

Synthetic DNA probesSynthetic DNA probes

PrehybridizationPrehybridization PosthybridizationPosthybridization

Probes with Probes with hybridized hybridized

DNADNA

microarray

Genome microarray

כל נקודה מצינת גן מאוקטב.

סוג הצבע ורמתו מיצגים את רמת

הפעלת הגן

ChIP-on-chip

TF TF

Antibody

TAF II250

RNAP

Chr1

ENr231

ProbeRepeats

Binding sites

Genomic Arrays

ChIP-seq in a nutshell

טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית

הפרדת חלבונים על ידי ג'לים. 1•

. שיבוט2•

DNA (sequencing). ריצוף 3•

•4 .PCR

•5 .microarray.ביו-ציפ

Gel electrophoresisג'לים

SDS. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – 1•

– אוראה או RNA או DNA. ג'ל דנטורטיבי 2•פורמאמיד

. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של 3• בתא) לבדיקת אינטראקציות DNA/RNAחלבון/

לא מוסיפים DNA או RNAחלבון-חלבון, חלבון-חומרים הגורמים לדנטורציה.

הפרדות על גבי ג'לים

Gel electrophoresisג'לים

SDS. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – 1•

– אוראה או RNA או DNA. ג'ל דנטורטיבי 2•פורמאמיד

. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של 3• בתא) לבדיקת אינטראקציות DNA/RNAחלבון/

לא מוסיפים DNA או RNAחלבון-חלבון, חלבון-חומרים הגורמים לדנטורציה.

Native gel

)כולל(.9אקסון עד 7 מאקסון )survival of motor neuron 1 )SMN1. הוטל עליך לשבט חלק מהרצף הגנומי של הגן1

הוא חלק UTR’ 3 הנגזר מתוך הרצף הגנומי העומד לרשותך )האם ה-pre-mRNA הרצף המופיע בתמונה הוא רצף

?(.8 מאקסון

(. 2 )תמונה polylinker. כמו כן לרשותך פלסמיד אשר לתוכו תשבט את הרצף הנדרש באתר ה- 2

. 3. במעבדה שלושה אינזימי חיתוך )רסטריקציה( ואתרי החיתוך שלהם מופיעים בתמונה מספר 3

. שישמש אותך בהמשך המחקר בסנטזת ה-ר.נ.א של הגן המשובטבלבד RNA polymerase T7. כמו כן במעבדה קיים האנזים 4

: פרט כל שלב ושלב )מהגברת מקטע הגן עצמו ועד שלב הפקת SMN1 )כולל( של הגן 9 עד 7. כיצד תשבט את אקסון 5הפלסמיד(, באיזה אנזימים תשתמש, רשום את רצף שני הפריימרים שתזמין, ומה יהיה עליך להזמין בנוסף על כך ?

של הגן )אך ורק אותו!( ?pre-mRNA. מה יהיה עליך לעשות על מנת לקבל את ה 6 מבלי לסנטז את רצף pre-mRNA, אז כיצד תסנטז את רצף ה-(in-vitro) במבחנה pre-mRNAהערה: ניתן לסנטז את ה •

?9 לאקסון מספר downstreamהפלסמיד שנמצא , קיט תעשייתי להפקת פלסמיד )מאפשר להפיק פלסמיד מכמות גדולה של חיידקים( וכמו כן PCRבמעבדה ישנו מכשיר •

ניתן להזמין פריימרים )רצפי התחל(.PCR. מתבצעת ע"י ערבוב החומרים והכנסתם למכשיר ה- PCRראקציית ה- •

תרגיל בשיבוט – ד.נ.א רקומבינטיבי

1תמונה : הגןרצף גנומי חלקי של

survival of motor neuron 1 . (SMN1)

Exon – red upper caseIntron – black lower caseAmino acids –under the center of the codon

tactggatataaacaatatctttttctgtctccagATAATTCCCCCACCACCTCCCATATGTCC I I P P P P P I C P AGATTCTCTTGATGATGCTGATGCTTTGGGAAGTATGTTAATTTCATG D S L D D A D A L G S M L I S W GTACATGAGTGGCTATCATACTGGCTATTATATGgtaagtaatcactcagcatcttttcctg Y M S G Y H T G Y Y M Acaatttttttgtagttatgtgacttacattaaaagactatcaacttaatttctgatcatattttgttgaataaaataagtaaaatgtcttgtgaaacaaaatgctttttaacatccatataaagctatctatatatagctatctatatctatatagctattttttttaacttcctttatttt ccttacagGGTTTTAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCC G F R Q N Q K E G R C S H S TTAAATTAAGGAgtaagtctgccagcattatgaaagtgaatcttacttttgtaaaactttatggtttgtggaaaaca L N Stop aatgtttttgaacatttaaaaagttcagatgttagaaagttgaaaggttaatgtaaaacaatcaatattaaagaattttgatgccaaaactattagataaaaggttaatctacatctccacagaggacatggtttaactggaattcgtcaagcctctggttctaatttctcatttgcagGAAATGCTGGCATAGAGCAGCACTAAATGACACCACTAAAGAAACGATCAGACAGATCTGGAATGTGAAGCGTTATAGAAGATAACTGGCCTCATTTCTTCAAAATATCAAGTGTTGGGAAAGAAAAAAG………………

: פלסמיד 2תמונה השיבוט

polylinker

5 ’G AATTC 3’ 3 ’CTTAA G 5’

EcoRI 5 ’GAATTC 3’3 ’CTTAAG 5’

BamHI5 ’GGATCC 3’3 ’CCTAGG 5’

5 ’G GATCC 3’ 3 ’CCTAG G 5’

: אתרי חיתוך של שלושה אינזימי רסטריקציה3תמונה Products generated by restriction enzymes

Cohesive ends

XhoI 5 ’CTCGAG 3’3 ’GAGCTC 5”

5 ’CTCGA G 3’3 ’G AGCTC 5’