第三章細胞與選殖技術

■ 細胞的結構與功能　細胞的發現　細胞學說的建立　細胞的結構與功能　細胞學的研究方法　細胞學研究的思考

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■ 細胞選殖技術　選殖的概念　選殖研究的歷史　動物選殖技術　選殖研究的現狀　選殖展望

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3-1　細胞的結構與功能

細胞的發現細胞 (cell)是由膜包圍著含有細胞核（或擬核）的原生質所組成，是生物體結構和功能的基本單位，也是生命活動的基本單位。

細胞能夠透過分裂而增殖，是生物體個體發育和系統發育的基礎。細胞是遺傳的基本單位，具有遺傳的全能性。

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細胞的發現1665年，英國物理學家羅伯特‧虎克 (Robert Hooke,

1635~1703) 用自己設計製造的顯微鏡觀察櫟樹軟木塞切片時發現其中有許多小室，狀如蜂窩，稱為「 cella」，這是人類第一次發現細胞，生物學家就用「 cell」一詞來描述生物體的基本結構。

1674 年 ， 荷 蘭 布 商 列 文 ‧霍 克 (Antonie van Leeuwenhoek, 1632~1723) 為了檢查布的質量，親自磨製透鏡，裝配了高倍顯微鏡（ 300倍左右），並觀察到了血細胞、池塘水滴中的原生動物、人類和哺乳類動物的精子，這是人類第一次觀察到完整的活細胞。

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細胞學說的建立1838~1839 年間由德國的植物學家許萊登和動物學家施旺的研究報告，使得細胞及其功能有了較為明確的定義，宣告了細胞學說基本原則的創立，細胞學說直到 1858年才完善。

主要內容細胞是有機體，一切動植物都是由細胞發育而來，即生物是由細胞和細胞的產物組成。

所有細胞在結構和組成上基本相似。生物體是透過其細胞的活動反映其功能。新細胞是由已存在的細胞分裂而來。生物的疾病是因為其細胞機能失常。

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細胞的結構與功能生物的一個基本特點是結構和功能的統一。細胞是生物的基本結構單位，可以分為原核細胞

(prokaryotic cell) 與真核細胞 (eukaryotic cell) 兩大類。

原核細胞沒有典型的核結構，遺傳訊息的載體僅為一個裸露在細胞中的環狀 DNA。

真核細胞的結構複雜，植物和動物的細胞大多都是真核細胞，如圖 3.3所示。

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細胞的結構與功能

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原核細胞與真核細胞

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原核細胞地球上約 3/4的生命物質由微生物組成，而其中大多數是原核生物。

原核細胞的結構以及遺傳訊息的複製和傳遞相對簡單，即無性繁殖方式：先生長成兩倍體，再分裂成兩個相同的子細胞，每個子細胞獲得它們上一代遺傳物質的一個拷貝。

原核細胞繁殖迅速，因此可作為良好的實驗材料。

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原核細胞在所有的原核細胞中，大腸桿菌是被人們研究和了解得最多的一種。

大腸桿菌的細胞膜內包裹著細胞質以及核，由於核外無核膜，故也稱為核質或擬核。核由一條環狀的雙股 DNA組成，也稱為染色體 DNA。

除了染色體 DNA外，大腸桿菌和許多細菌的細胞質中還含有稱為質體的很小的環狀 DNA。質體在當今遺傳工程中作用十分重要。

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真核細胞動物、植物和真菌都是真核細胞構成的生物，簡稱真核生物。

真核細胞區別於原核細胞的最主要特徵是它們具有被雙層膜所包裹的、有固定形狀的、結構複雜的細胞核。

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細胞核與遺傳訊息細胞核 (nucleus)是真核細胞內最大、最重要的胞器，大多呈球形或卵圓形。雙層核被膜 (nuclear envelope)將核質與細胞質分開，遺傳訊息被保護在細胞核裏。核膜上有結構複雜精細的核孔，是核內外物質與訊息交換的通道。

一般說來，真核細胞失去細胞核將導致細胞的死亡。細胞核含有染色質 (chromatin)，染色質是由 DNA和蛋白質體成的細絲。

DNA與組蛋白結合，形成核小體 (necleosome)，核小體相連成念珠狀，直徑約為 11nm。每 6個核小體盤繞形成直徑為 30nm的螺旋管。由螺旋管形成 DNA複製環，再形成超螺旋管，再結合許多非組蛋白，最終形成能在顯微鏡下觀察到的直徑約為 400nm的染色體。

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細胞核與遺傳訊息染色體只有在細胞分裂的中期才能看到，它有利於遺傳物質均等地分配到兩個子細胞中去。

一個細胞核內含有該物種的全套遺傳訊息。人類基因體DNA 由 30億對鹼基組成，約 3萬多個基因，可記錄 50億比特的訊息量，相當於 2,000萬冊圖書的訊息量。

DNA上的遺傳訊息透過轉錄、轉譯型成蛋白質來控制遺傳表現型。

核仁的大小、形狀和數目隨生物的種類、細胞類型和細胞代謝狀態而變化。核仁是 rRNA合成、加工和核糖體次單元的裝配場所。

細胞核骨架由纖維蛋白構成。 DNA複製、基因表現、病毒複製、染色體構建都是在特定的核骨架系統上進行。

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胞　器核糖體 (ribosome)

是細胞內合成蛋白質的場所。核糖體由兩個不同大小的次單元構成。

合成蛋白質時，小次單元先與 mRNA結合，大次單元再結合上去。兩個次單元之間有一「通道」，使 mRNA透過，指導蛋白質合成。

很大一部分核糖體附著在內質網膜的表面，形成粗糙內質網。

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胞　器內質網 (endoplasmie reticulum, ER)

分佈在細胞質中，粗糙內質網常分佈於細胞核周圍，呈同心圓狀排列，參與蛋白質的合成與運輸。

在合成分泌蛋白質旺盛的細胞裏，如漿細胞和胰腺細胞內粗糙內質網十分發達。

光滑內質網多呈網狀分佈的小管，在一定部位與粗糙內質網相連接，參與脂肪、磷脂膽固醇、肝醣的合成和分解。

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胞　器高爾基體 (Golgi body)

它位於細胞核的附近，由膜圍成的扁平囊和大泡、小泡 3種結構組成的。這些大泡有的成為溶體，分佈於細胞質內；有的作為分泌顆粒，逐漸移向細胞膜並與細胞膜融合，再將所含的內容物排出細胞外。

高爾基體的作用如同一座加工廠，可以加工、濃縮和運輸蛋白質。

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胞　器溶體 (lysosome)

是一種泡狀結構，外包一層膜，內部含有各種水解酶，能分解各種生物大分子，如蛋白質、核酸、脂類和多醣等，其特徵性酶是酸性磷酸酶。

主要功能：消化吞入細胞內的大分子營養物質、細菌、病毒。可將消化後的營養物質擴散到細胞質，供細胞生命活動，殘渣再排出細胞外，由此起到了營養和防禦的作用。

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胞　器葉綠體 (chloroplast)

是植物細胞特有的胞器，能吸收、固定太陽能，是生命的基礎，也是文明的基礎。

光合作用在葉綠體內進行。粒線體 (mitochondria)

是細胞內氧化磷酸化和形成 ATP的主要場所，有細胞「動力工廠」之稱。

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細胞骨架 (cytoskeleton)

細胞骨架的結構由微絲、微管和中間絲構成。

細胞骨架的作用不僅在維持細胞形態中起作用，而且對細胞生理活動也是不可缺少的。

細胞運動、物質運輸、能量轉換、訊息傳遞、細胞分裂、基因表現、細胞分化、酶反應等生命活動都必須在細胞骨架的特定部位進行。

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細胞骨架 (cytoskeleton)

微管 (microtubule)

是由微管蛋白組成的中空管狀結構，直徑 20~25nm。微管蛋白有 α 、 β兩種不同的次單元，它們相間排列，構成螺旋狀的結構。

微管是纖毛、鞭毛、神經突起、著絲粒、紡錘體的主要構成成分。

微管的功能是保持細胞形狀、細胞運動和細胞內的物質運輸等。

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細胞骨架 (cytoskeleton)

微絲 (microfilament)

又稱肌動蛋白纖維，直徑 5~6nm。和肌球蛋白、肌鈣蛋白和原肌球蛋白組成粗絲和細絲，構成肌肉收縮系統。

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細胞骨架 (cytoskeleton)

中間絲 (intermediate filament)

大小介於微管和微絲之間，直徑 7~10nm，是由上皮細胞分泌產生的一種富含硫的纖維狀蛋白質，極其堅韌。

是皮膚、生皮、毛髮、角、指甲、鱗片、羽毛等結構的主要部分，也是脊椎動物外皮和附屬物的重要成分。

微樑 (microtrabecular system)

是一類遍佈於細胞內的直徑為 2~3nm的細密的立體網架結構，能夠聯繫各個胞器，並且賦予細胞溶質相當大的結構剛性和組織性。

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細胞學的研究方法

細胞形態結構的觀察方法光學顯微鏡的分辨率為 0.2μm，而電子顯微鏡可達 0.2nm，

圖 3.7比較了不同細胞的大小與光學顯微鏡、電子顯微鏡、掃描通道顯微鏡的分辨率範圍。

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細胞學的研究方法

光學顯微鏡技術普通複式光學顯微鏡的組成

光學放大系統，為兩組玻璃透鏡：目鏡與物鏡。照明系統：光源、折光鏡和聚光鏡，有時另加各種濾光片以控制光的波長範圍。

機械和支架系統：主要是保證光學系統的準確配製和靈活調控。

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細胞學的研究方法

對任何顯微鏡來說，最重要的性能參數是分辨率，而不是放大倍數。

分辨率是指區分開兩個質點間的最小距離。這兩個質點之間的距離取決於光源波長 λ、物鏡鏡口角 α（標本在光軸的一點對物鏡鏡口的張角）和介質折射率 n，它們之間的關係是：

D ＝ 0.61λ/(n sin α/2)‧

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細胞學的研究方法

電子顯微鏡技術

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細胞學的研究方法

電子顯微鏡技術

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細胞學的研究方法

電子顯微鏡技術 電子顯微鏡的高分辨率主要是因為使用了波長比可見光短得多的電子束作為光源，波長一般小於 0.1nm。

電子顯微鏡主要由電子束照明系統、成像系統、真空系統和記錄系統等組成（圖 3.9, 3.10）。

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細胞成分的分析方法

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細胞成分的分析方法

形態學觀察與細胞成分分析相結合是當代細胞生物學研究中常常採用的實驗方法，也是揭示生物大分子在細胞內相互關係及功能的有力工具。

胞器與生物大分子及其複合物可透過超速離心技術分離，再分別進行結構和功能研究。

測定蛋白質、核酸、多醣和脂質等細胞成分，通常利用一些顯色劑與待檢測物質中一些特殊基團能夠特異性結合的特徵，透過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分佈和含量。例如福爾根 (Feulgen)反應可以特異顯示 DNA的分佈。

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細胞成分的分析方法

1970年代以來，免疫學的迅速發展為細胞生物學的研究提供了強有力的手段，特別是在細胞內特異蛋白的定位與定性方面，單株杭體與其他一些檢測手段相結合發揮了重要作用。免疫螢光與免疫電鏡已成為研究細胞內蛋白質分子定位的重要技術。

免疫電鏡技術已得到廣泛應用，如：蛋白分泌的研究，透過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態；胞內酶的研究；一些結構蛋白的研究，包括膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。

細胞內特異核酸（ DNA 或 RNA）序列的定性與定位通常採用原位雜交技術 (in situ hybridization)。用標記的核酸探針透過分子雜交方法，確定特殊核苷酸序列在染色體上或在細胞中的位置的方法，稱為原位雜交。原位雜交技術在顯微與亞顯微水準上的基因定位、特異 mRNA表現等問題的研究中起重要作用。

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細胞成分的分析方法

放射自顯影技術是利用放射性同位素的電離輻射對乳膠（含AgBr 或 AgCl）的感光作用，對細胞內生物大分子進行定性、定位與半定量研究的一種細胞化學技術。

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細胞成分的分析方法

研究 DNA合成時通常是用氚 (3H)標記的胸腺嘧啶去氧核苷 (3H-TdR)。

研究 RNA 合成時是用氚標記的脲嘧啶核苷 (3H-U)（圖 3.11）。

在研究含硫蛋白分子代謝時，可用 35S標記的蛋胺酸和半胱胺酸， 3H 或 14C標記的蛋胺酸、白胺酸等也是常用於蛋白分子合成的前體。

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細胞成分的分析方法

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細胞化學的定量分析方法

細胞顯微分光光度術 (microspectrophotometry)

利用細胞內某些物質對特異光譜吸收的原理，用來測定這些物質（如核酸與蛋白質等）在每一個細胞內含量的一種實驗技術。

流式細胞儀 (flow cytometry)

可定量地測定某一細胞中的 DNA 、 RNA或某一特異蛋白的含量，以及細胞群體中上述成分含量不同的細胞的數量，還可將某一特異染色的細胞從數以萬計的細胞群體中分離出來、將 DNA含量不同的中期染色體分離出來，近年來得到越來越廣泛的應用。

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細胞學研究的思考

對細胞成分的了解，特別是數以萬計的基因及其表現產物的功能，以及它們在細胞代謝與細胞生長、分化、衰老、凋亡等生命活動中的作用與調節機制，則更廣泛地需要生物化學分析與分子生物學技術的應用—藉助於當今迅速發展的功能基因體學 (functional genomics)、蛋白質體學 (proteomics)及生物資訊學(bioinformatics)。

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3-2　細胞選殖技術

選殖的概念「選殖」是 clone的音譯，當作名詞用時，它被譯為無性繁殖系，意為來源於單個細胞無性繁殖的細胞群體；當作動詞用時，它表現的是形成無性繁殖系的過程或方法。

選殖技術在現代生物學中又被稱為「生物放大技術」，經歷了 3個發展時期

微生物選殖，即用一個細菌複製出成千上萬個和它一模一樣的細菌，成為一個細菌群。

分子選殖，比如 DNA的複製，得到大量相同的分子。動物選殖技術。

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動物選殖技術

胚胎分割用機械方法把已發育的胚胎分割，再把每一部分移植到動物體內，經發育後出生。該法可以提高動物生產效率，但這並不是嚴格意義上的選殖。

胚胎細胞核移植它是用顯微手術的方法將未著床的早期胚胎細胞分離成單個卵裂球，再把單個卵裂球細胞導入去除染色體的卵母細胞中，經一系列的步驟獲得胚胎，經移植後獲得後代。

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動物選殖技術

胚胎幹細胞核移植胚胎幹細胞是一種全能細胞，可在體外培養條件下使細胞數量倍增，而細胞不分化，每個細胞仍具有發育成一個完整個體的能力，把這種細胞用以上核移植技術導入除去染色體的成熟的卵母細胞內，得到選殖胚胎，經移植至動物體內產生後代動物。

體細胞核移植用動物體細胞作細胞核來源，用核移植的方法將其導入去核卵母細胞，得到選殖胚胎，移植產仔，獲得體細胞選殖動物。

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哺乳動物選殖技術

要完成「哺乳動物選殖技術」必須包括設備齊全的細胞和胚胎工程實驗室，進行細胞的培養、傳代、篩選和胚胎的重建工作。

動物實驗場，提供供體動物或供體卵母細胞，也能提供受體動物，使重建的胚胎得到正常的發育。

對細胞進行外源基因操作的分子生物學實驗室。

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哺乳動物選殖技術

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哺乳動物選殖技術

選殖實驗室需要的材料主要是卵母細胞和供核細胞。卵母細胞的來源：一種是處於原核期的受精卵；另一種是成熟的卵母細胞。

核供體細胞的來源：最早進行哺乳動物核移植是使用早期胚胎卵裂球，從 1986年開始使用，迄今仍然是核供體的主要來源。

哺乳動物的核移植：卵母細胞的去核→供體的準備→核移植→融合和活化→重構選殖胚胎的發育

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胚胎分割

可把它作為選殖技術的一種。它可用來提高優質胚胎的利用效率，促進良種的推廣，在畜牧生產良種群的擴繁上有一定意義。

胚胎分割方法始於 1970年，用於小鼠，後來在兔、山羊、綿羊、奶牛、猿均獲得成功，已經是比較成熟的技術。

2000 年 1 月 schattell等人將此技術用於靈長目動物，獲得了經胚胎分割的恆河猴 Tetra，見圖 3.14。這是第一隻經胚胎分割產生的恆河猴，為了說明它是四分胚的後代而取名為 Tetra，即四的意思。操作過程見圖 3.15。

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胚胎分割

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胚胎分割

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胚胎細胞選殖

如果核移植所用的核供體來自胚胎的卵裂球，則稱為胚胎細胞選殖。

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胚胎幹細胞選殖

胚胎幹細胞（ ES細胞）具有發育的全能性，有與早期胚胎相似的分化能力和正常的二倍體染色體核型。

ES細胞除了用於基因打靶外，還可以用到核移植中。由於它能建系、傳代培養，也可以冷凍保存，因此它可以為核移植提供源源不斷的核供體。

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胚胎幹細胞選殖

核移植按檀香山技術（圖 3.17）進行小鼠卵母細胞用作受體。ES細胞按大小分為兩組，小細胞組直徑為 10μm，大細胞組平均直徑為 18μm，小細胞組用細顯微注射針（內徑 6μm），大細胞用較粗的顯微注射針（內徑 10μm）進行操作。

採用多次吸入吹出法，使細胞膜破裂以分離出細胞核。注射在室溫進行 (25~29 )℃ ，重構胚放在 CZB培養基中培養，經發育後移至同期發情母鼠。Wakayama等人 1999 年 12月用胚胎幹細胞核移植方法，成功的獲得了複製鼠後代。

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胎兒成纖維細胞核移植

動物胎兒細胞經胰蛋白酶消化處理，使分散為單個細胞。再經適當培養基培養傳代，便可用於核移植的核供體。

許多學者均用這種方法成功地獲得了複製動物，如綿羊、山羊、牛和豬，是一個較好的核體來源。

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成體細胞選殖

「桃莉」的選殖英國科學家將來自蘇格蘭黑面羊的卵母細胞去核處理，卵母細胞具有由蛋白質和纖維組成的外殼的透明帶 (Zona pellucida)，它是一層保護膜。

將純白色毛皮芬蘭陶賽特綿羊處於靜止期 (G0)的乳腺細胞與去核的卵母細胞放在一起，然後用微弱的電脈衝以促使供核細胞與去核的細胞質融合。電脈衝也促使細胞活化，並開始分裂。

新的融合細胞移植到黑面羊的生殖腔， 148天之後（ 1997 年 2 月），一隻正常出生、體重 6.6kg的芬蘭陶賽特細毛純白色複製小羊—「桃莉」誕生了。

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成體細胞選殖

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成體細胞選殖

檀香山技術（見圖 3.17）檀香山技術與複製「桃莉」不同之處如下：

使用卵丘細胞，這是一種分化的體細胞且數量眾多，容易獲得。

採用了將核直接注射入去核卵母細胞的方法。卵母細胞的活化採用化學方法，即用鍶離子進行處理，而沒有採用電脈衝活化法，省去了相應的儀器。

成活動物與移植胚數量之比有所提高，達到了2.35%。

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成體細胞選殖

基因轉殖選殖技術將外源 DNA注射到受精卵的原核，再移植到受體動物，待出生後檢測後代是否含有外源基因。

由於基因是透過隨機整合進入受精卵的，因此整合率很低，一般只有 15%左右，而且需要數量較多的受體動物，導致基因轉殖動物生產成本極高，也制約了這一技術的發展。

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成體細胞選殖

基因打靶基因轉殖選殖技術利用基因打靶技術，把外源基因定點插入體細胞中，再經核移植技術得到帶有外源基因的選殖動物的技術。它是在體細胞選殖技術、體細胞基因轉殖選殖技術之後發展起來的第三個重大技術，具有廣泛的應用前景。

異種動物選殖上面所講的選殖技術，包括體細胞選殖產生的「桃莉」、小鼠、牛均是使用來自同一種動物的供體和受體細胞，而且必須移植到同種動物子宮內，經發育產出複製動物。但這種選殖方法卻不適用於珍稀瀕危動物，例如大熊貓。

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選殖研究的現狀

選殖之所以獲得成功是因為胚胎細胞具有全能性，它的細胞核帶有全部遺傳物質，在被移植到卵母細胞後能發育成一個完整的個體。

「桃莉」的誕生激勵各國科學家進一步深入研究哺乳動物的選殖問題。

1998 年 5月美國Wakayama等在 Nature雜誌上報導，他們用小鼠卵丘細胞作核供體，在選殖桃莉羊技術基礎上，對Wilmut的方法進行了改進。他們的技術使選殖的效率有所提高，其成功率達到 2%（而桃莉羊的成功率僅為 1/277），被稱為「檀香山技術」。

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選殖研究的現狀

1998年是複製動物大豐收的一年。 3月，法國 Renard等人用牛胎兒肌細胞獲得複製牛「馬格麗特」。 4月，紐西蘭Wells等人用牛胎兒成纖維細胞獲得複製牛「吉耳」。同時日本 Izumi等用輸卵管上皮細胞獲複製牛。 10月，中國杜淼等用羊胎兒成纖維細胞獲選殖山羊。2001年，美國 Hill等人用牛胎兒成纖維細胞獲複製牛；Yukiko等用分裂中期胚胎成纖維細胞獲選殖小鼠。與此同時利用選殖技術和基因轉殖技術、基因打靶技術相結合生產基因轉殖動物也取得了較大的進展。 1997 年 8月，Schnieke 等人獲轉人基因羊 Polly ； 12月， Angelika等用基因轉染羊胎成纖維細胞，再經核移植獲得人 FIX基因轉殖羊。

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選殖研究的現狀特別要提及的是，在進行各種動物體細胞選殖的同時，異種動物選殖也在悄然興起。動物研究所陳大元領導的研究小組從 1998年開始對大熊貓選殖進行了研究，並證明了大熊貓核供體細胞在兔卵胞質中可去分化而支持早期重構胚發育。體細胞選殖技術逐漸走向完善，並與其他各種技術（如基因轉殖技術、基因打靶技術）互相結合得到具有新特性的動物，更好地滿足人類社會的需要。同時，選殖技術存在的各種問題，也促使科學家去深入探索，使這一技術更加完善。

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選殖展望

現在的選殖技術仍然是一個技巧性很強、操作性很細的技術，而且都是手工操作。每一步驟並沒有嚴格的操作程序，供體核的取出、卵母細胞的去核操作，人為因素很多，若嚴格選擇可移植胚胎，出生數和移植數的比例就可大大提高。只有將這些規律摸清楚、操作也規範化後，選殖技術才能走向完善。