丙型肝炎实验诊断研究进展

山东省临床检验中心卢志明

1 、有包膜 ,属黄病毒科，丙型肝炎属。

2、单股正链 RNA (9.6 kb)

3 、 T½: 2.7 小时

4、每日复制量： 10 兆 (1012)

病毒颗粒1. Purcell RH. NIH Consensus Conference on Hepatitis C. 1997.

2. Neumann AU et al. Science. 1998;282:103-107.

3. Rosenberg S. J Mol Biol. 2001;313:451-464.

4. Lauer GM, Walker BD. N Engl J Med. 2001;345:41-52.

丙型肝炎病毒

从非甲非乙型肝炎到丙型肝炎 : 1968-1974 年间 ,HAV 、 HBV 诊断方法相继建立 , 人们

发现还有一种引起输血后肝炎的致病因子 . 1974 年纽约的 Pince 对 204 例术后病人随访 ,6 个月 5

1 人 (25%) 发生了输血后肝炎 , 仅 12 人与 HBV 有关 .CMV 显然不是输血后肝炎的原因 .

1989 年 9 月在东京会议上命名此种病毒为丙型肝炎病毒 (HCV), 由此引发的肝炎称之为丙型肝炎 (HC).

HCV 的病毒命名

HCV 为单股正链 RNA 病毒 5`NC 区、 3`NC 区为非编码区 5`NC 与 3`NC 间分结构编码区： C 区、 E1 、 E2 ；非结构编码区： NS1~5 5`NC 区最保守， C 区较保守， E2 ／ NS1 有高变区（ HVR1 ）

HCV 基因组结构

表 HCV 表达蛋白的特性和功能基 因 氨基酸数目 抗 原 功 能C E1E2NS2NS3NS4aNS4bNS5aNS5b

19119232731663154

261448591

C22-3Gp33Gp70

G33cC100

NS5

核壳蛋白 , 高度保守糖膜蛋白 , 在不同基因中高度变异糖膜蛋白 , 在不同基因中高度变异金属蛋白酶蛋白酶和螺旋酶不清楚不清楚复制酶RNA 依赖的 RNA 聚合酶

全球丙肝的流行情况 1 、 WHO 的资料表明 ,全世界已有约 1.7 亿丙型肝炎病毒

感染者。

2、急性 HCV 感染者中 8O-90 ％可发展为慢性肝炎 ,其中约 20-30 ％会缓慢进展为肝硬化。 1-5 ％发展为肝癌。

3、 HCV 主要经血液和血液制品传播。 至今还没有预防丙型肝炎的疫苗问世 ,治疗效果不

是十分理想。因此 ,建立一种针对 HCV 的具有高灵敏度、特异性和稳定性的检测方法，对于防止 HCV 传播、 HCV感染的早期诊断和治疗具有重要意义。

我国丙型肝炎流行情况•一般人群抗 -HCV 流行率 : 3.2%

•估计 HCV 感染人数 : 3 800 万

( 全国病毒性肝炎血清流行病学调查 1992~1995 )

目前经过血源的管理，丙肝发病率应当有所下降，但有大量病人未被发现和治疗

>3%( 14 省 )

2 ～ 3%( 11 省 )<2%( 6 省 )

我国各省市自治区 HCV 抗体 流行率

新疆

西藏

四川

贵州

海南

广东广西云南

河南 江苏

安徽湖北

台湾

福建江西湖南

宁夏 山西

陕西

辽宁

上海

天津

黑龙江

山东青海

甘肃 北京河北

浙江

吉林内蒙古

重庆

( 全国病毒性肝炎血清流行病学调查 1992~1995 )

我国我国 HCVHCV 基因型调查基因型调查11 、、 HCV 1bHCV 1b 型是主要的基因型，其检出率达型是主要的基因型，其检出率达 83.1783.17 ％。％。22 、、 HCV 2HCV 2 型检出率低，占型检出率低，占 6.866.86 ％；其余为％；其余为 1b1b 、、 22 、、

4b4b 型的混合型。型的混合型。33 、、 HCV 1bHCV 1b 检出率在检出率在 <30<30 岁、岁、 3030 ～～ 4949 岁、岁、 >50>50 岁组岁组

分别为分别为 77.7777.77 ％、％、 83.9283.92 ％、％、 90.9090.90 ％。％。44 、、 HCV 1bHCV 1b 在女性感染的比率较高（在女性感染的比率较高（ 93.6193.61 ％），男％），男

性为性为 7575 ％，差异有极显著的统计意义％，差异有极显著的统计意义 (p<0.01)(p<0.01) 。。55 、、 HCV 1bHCV 1b 型在感染时间型在感染时间 >10>10 年和年和 <10<10 年病人中的检年病人中的检

出率分别为出率分别为 100100 ％和％和 80.4380.43 ％（％（ p<0.01p<0.01 ） 。） 。

HCV 感染：中国 HCV 基因型的地理分布

HCV 基因型在中国的分布以 1b 型为主， 2a 型为辅助

JiamusiJiamusi

ShenyangShenyang

BeijingBeijingHamiHami

LanzhouLanzhou

ChengduChengdu

NanningNanning

NanjingNanjing

佳木斯佳木斯

沈阳沈阳

北京北京哈密哈密

兰州兰州

成都成都南京南京

南宁南宁II/1bII/1b

III/2aIII/2aII/IIIII/III

66aa

Wang Y, et al. J Med Viral, 1993,40:254-260庄辉，等 . 中华流行病学杂志 , 2001,22:99-101

●

长沙

20% 痊愈

HCV 感染的自然史

80% 持续感染

30%

稳定，慢性，无进展

Adapted from Alter HF, Seeff LB. Semin Liver Dis. 2000;20:17-35

肝脏疾病终末期，肝细胞癌，肝脏移植，死亡

30% 呈严重进展

100 位 HCV 急性感染

40% 有不同程度进展

丙型肝炎病毒 (HCV) 感染危害性不容忽视

• 全球性流行 —— 3% (1.7 亿 )

• 慢性化的危险性 —— 60%–85%

• 临床诊断病例 —— < 30%

• 肝硬化的危险性 —— 在感染后 20 年内达 10% 在感染后 30 年内达 20%

• 肝硬化患者中肝细胞癌 —— 1%–4%/ 年 ( 美国 )的发生率 ~ 7% ( 日本、台湾 )

• 失代偿肝硬化 10 年存活率 —— 25 ％• 肝硬化相关性病死率 —— 1%–5%/ 年

WHO. Hepatitis C. Fact sheet no. 164.

Emmet B. Keeffe, MD, Medscape Gastroenterology eJournal, 2002, 4(2) National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002

Consensus statements on the prevention and management of hepatitis B and C in the Asia-pacific region

HCV 的感染人数 = 临床病例？ 发病隐匿 基层临床医生认识不足 丙肝检测没有纳入常规查体项目 确诊比较难，费用高 抗体的窗口期， RNA 的假阴性 ** —— 临床诊断病例少

National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002

美国：在 2015 年以前，临床诊断 HCV 的成人病例数增加 4倍

中国：挑战？！

高慢性化率高感染率、低诊断率

无有效疫苗预防 认识不足

挑战 !!

问题与挑战

我 们 如 何 应 对 挑 战？1 、制定中国丙肝防治指南：规范丙肝的筛查， 诊断和治疗。2 、加强丙肝疾病和诊疗对基层医生的教育。3 、重视临床一线对丙肝的筛查。4 、通过各种途径提高公众对丙肝的防范意识： 如媒体等。

近年来丙肝研究进展 丙肝分型、病毒复制、病毒变异等 慢性化机制、脂肪变性、癌变机理等 抗病毒治疗： I 型应答率 40% ； II 型应

答率 80% 特异性靶向抗病毒治疗（ 2 期临床）

实验室诊断进展 多抗原包被的抗体检测（第 3 代抗 -HC

V ） HCV-Ag 的检测（第 4 代） 抗原 - 抗体联合检测（筛查） HCV 的基因分型 HCV-RNA 的检测 —— 总之，实验室诊断研究进展？

诊断、监测方法

HCV 血清学试验

EIA 检测抗 HCV

HCV-RNA 定性试验 PCR 、 TMA

HCV-RNA 定量试验PCR 、 bDNA

ALT

肝纤维化非损伤试验

肝活检

基因分型

实验室诊断方法

National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002

HCV 血清学试验

EIA 检测 HCV 抗原

常用的检测方法 酶联免疫吸附试验 -HCV 抗体检测 酶联免疫吸附试验 - HCV 核心抗原检测 免疫学方法 - 免疫印迹法（ RIBA ） 免疫学方法 - 血清学分型 分子生物学方法 -HCV-PCR 定量、 HCV-PCR 定性 分子生物学基因分型方法 - 型特异PCR 分型法、型特异探针杂交法、限制性长度多态性分析法 (RFIJP) 、核酸序列分析法、酶切分型法、基因芯片等

感染丙肝病毒后各指标检测时间表

Anti-HCV Window = 70 days(3rd Gen) = 82 days(2nd Gen)

10080604020

0

An

alyt

e L

evel

Time

HCV RNA Window = approximately 11~13 days

Anti- HCV

HCV- RNA

HCV Ag Window = 12~14 days

HCV- Ag清学分型

感染丙肝病毒后各指标检测时间表

Anti-HCV Window = 70 days(3rd Gen) = 82 days(2nd Gen)

10080604020

0

An

alyt

e L

evel

Time

HCV RNA Window = approximately 11~13 days

Anti- HCV

HCV- RNA

HCV Ag Window = 12~14 days

HCV- Ag清学分型

HCV 抗体检测应用的不足 目前国内主要应用抗 HCV/EIA检测抗体，经

抗体筛选后，临床上仍有少量的输血后丙肝的发生。

主要原因 窗口期

丙肝抗体假阴性问题

1. 窗口期 2. 静默感染 (immunosilent infection)

3.试剂质量

4. 其它

HCV 抗体检测应用的不足1 、不能用于丙型肝炎的早期诊断。

2 、临床上不能区分既往感染和现症感染。

3 、抗病毒治疗不一定造成抗 HCV阴转，不能用于抗病毒疗效的检测。

血清 HCV-RNA 的检测 血清 HCV-RNA的定性检测： 容易产生假阳性或假阴性（ PCR产物易产生污染）

血清 HCV-RNA的定量检测： 缺点： RNA降解容易出现假阴性 优点：可用于抗病毒治疗的选择与疗效监测

免疫学方法 -免疫印迹法 重组免疫印迹法(Recornbinant immunobIot， RIBA)RIBA是 FDA批准的抗 HCV补充试验．主要是 解决 ELISA试验中的假阳性问题。 目前广泛使用的RIBA一 3非特异性反应明显减少，敏感度显著提高(99． 5）。

缺点是 RIBA在操作上较 ELISA困难，费时、成本 高，因此限制了这项技术在临床上的普遍使用。

目前检测方法 抗 -HCV and HCV-RNA 的检测 —— 不能满足临床早期、准确、可靠的要求。

RIBA 实验操作复杂、费用较高、推广难

丙肝抗原检测1 、丙型肝炎早期感染诊断指标2 、丙型肝炎确诊指标3 、丙型肝炎治疗评价指标4 、丙型肝炎筛查指标

HCVHCV 核心抗原核心抗原的检测的检测

抗 -HCV

“游离”抗原时间

HCV 感染过程

早期检测“筛查”

“总”抗原( 抗体结合 )

“总”抗原

诊断用

12-14 天 年

1 pg/ml 1 pg/ml 总总 HCV HCV 核心抗原 核心抗原 = 8000 IU/ml HCV RNA= 8000 IU/ml HCV RNA

日70-80 天

感染丙肝病毒后各指标检测时间表

抗 -HCV

“游离”抗原

早期检测“筛查”

“ 总”抗原

■HCV RNA 11~13 days ■ HCV Ag 12~14 days ■ Anti-HCV = 70 days(3rd Gen) = 82 days(2nd Gen) 1 pg/ml 1 pg/ml 总总 HCV HCV 核心抗原 核心抗原 = 8000 IU/ml HCV RNA= 8000 IU/ml HCV RNA

HCV RNA

1 10 20 30 40 50 60 80 90 100 110 120 130 140 15070 天时间

灵敏度

0

10

20

30

40

50

60

检验原理

通过对血清或血浆样品进行预处理，解离HCV 抗原 /抗体复合物并释放出所有核心抗原，经固相包被特异性抗体捕获后，再与酶标记抗体形成双抗体夹心复合物，最后加入酶底物显色，以产品规定的可见光波长临界OD值判断HCV 抗原检测结果。

HCV 抗原 ELISA 基本原理

Microwell

HCV Antigen

Anti HCV cor eHRP Conjugate d Antibody

Anti HCV cor e Antibody

H RP

Mo Ab

HCV 抗体

抗 原

抗 HCV 抗体 -HRPHRP抗 HCV 体

酶 联 板

样本处理

不同亚型丙型肝炎病毒核心抗原的序列分析 10 20 30 40 50 60   HCV 1 MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG HCV 1b MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG HCV 2a MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG HCV 2b MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG HCV 3 MSTLPKPQRK TKRNTIRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYVLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG     70 80 90 100 110 120 HCV 1 RRQPIPKARQ PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG HCV 1b RRQPIPKARQ PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG MGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRHRSRNLG HCV 2a RRQPIPKDRQ STGKSWGKPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPTWGPT DPRHRSRNLG HCV 2b RRQPIPKDRQ STGKSWGKPG YPWPLYGNEG LGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNVG HCV 3 RRQPIPKARQ SEGRSWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG   130 140 150 160 HCV 1 KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGARRA LAHGVRVLED HCV 1b KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGARRA LAHGVRVLED HCV 2a KVIDTLTCGF ADLMGYIPVV GAPVGGARRA LAHGVRVLED HCV 2b KVIDTLTCGF ADLMGYIPVV MAPLGGARRA LAHGVRVLED HCV 3 KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV MAPVGGARRA LAHGVRALED

四株单抗亚型检定

1号 (CAb-1) IgG2a 2号 (CAb-2) IgG2a

3号 (EAb-1) IgG2b 4号 (EAb-2) IgG1

HCV-Ag 和 HCV-RNA 检测的比较 HCV cAg HCV RNA 样本储存的条件要求 普通 特殊 样本的前处理试剂 不需要 需要 特殊仪器要求 无 有 实验人员的训练 普通 专业 实验费用 低 高

根据我国目前的状况 ,HCV cAg 检测更符合我国的国情 ,可以为血液安全 , 临床诊断提供廉价 ,切实可行的检测方法 .

丙肝抗体检测“窗口期”补充方案

1.检测丙肝抗原 2.检测丙肝病毒 RNA 3.联合检测： HCV Ag + HCV RNA + HCV Ab

HCV实验室检测流程HCV-Ag HCV-Ab

阴性报告

RRRR 阳性阳性 S/COS/CO 比值比值 <3.8<3.8ECi ECi S/CO S/CO < < 88

HCV-Ab RIBA HCV RNA NAT

阴性

其他结果评价 ( 如 NAT 、 ALT)

阴性 阳性可疑

阳性

RR 阳性EIA S/CO >3.8ECi S/CO > 8

或

报告

报告

报告 报告 报告

丙肝确诊后的实验室检测 HCV 基因分型——选择抗病毒治疗防案、

疗效评价、确定疗程，预后判断 HCV-RNA定量的检测——评价抗病毒治

疗的疗效 丙肝抗原定量检测——即将上市，评价

抗病毒治疗的疗效

HCV RNA(+) (-) HCV Ag (+) (-) HCV Ab量由高 低

HCV RNA 持续 (+) HCV Ag 持续 (+) HCV Ab 持续 (+)

急急性性丙丙肝肝

支持自身清除支持自身清除

(15--20%)(15--20%)

支持发展慢性丙肝支持发展慢性丙肝

(80--85%)(80--85%)

HCV 实验结果临床诊断分析

慢性丙型肝炎 慢性肝病患者： HCV RNA (+)

HCV Ag (+) 抗 HCV (+)

对免疫健全的 HCV RNA(+) 患者 , 其中 HCV 抗原、抗 HCV (EIA) 阳性率 > 99%

对某些透析或严重免疫缺陷患者 , 尽管存在 HCV RNA 复制 , 但抗 HCV (-), 可诊断为 HCV 感染者或慢性丙肝患者

慢性慢性丙型肝炎丙型肝炎

HCV 实验结果临床诊断分析

献血员或体检群体的筛查 若抗 HCV(+), HCV Ag(+), HCV RNA(+)

为慢性丙肝或慢性 HCV 感染者 若抗 HCV(-), HCV Ag(+), HCV RNA(+)

为 “ 窗 口 期 ” (70天 ) “静默感染” (immunosilent infection) 是引起输血后丙肝的主要原因

HCV 实验结果临床诊断分析

总 结

1 、丙肝是引起肝硬化、肝癌的主要原因之一，是危害人民生命健康的严重疾病，应引起临床医生的高度重视。

2 、丙肝抗原的检测是抗 -HCV窗口期及 HCV-RNA假阴性的补充，丙肝抗原的定量检测是抗病毒治疗的评价指标。

3 、丙肝无疫苗预防，起病隐匿，丙肝抗原、抗体的联合检测应成为常规临床检查项目，及早发现潜在病人。

4、 HCV 分型、 HCV-RNA检测是选择抗病毒治疗方案、疗效评价、确定疗程，预后判断的重要指标。