אפיון אוכלוסייה הטרוגנית של (NKתאי הרג טבעיים )

:מנחהפרופ' רמית מרגב' מיכל סימון

אילנה ברוצקימאיה טנסה

רקע תאורטי

מערכת החיסון:מולדתנרכשת

שייכים למע' NK תאי המולדת- אינם ספציפיים,

מהווים קו הגנה ראשון.

בקרה:סיגנלים משפעליםסיגנלים מעכביםאיזון בין השניים

משופעלים NKתאוריית "העצמי החסר"- תאי .MHC-CLASS Iבמגע עם תאים שאינם מבטאים

שיטת ניסוי חדשה, המתבססת על מעקב בודדים NKמיקרוסקופי רציף אחרי תאי

שנזרעו בבאריות של פלטת סיליקון, מאפשרת להתבונן בסינפסה האימונולגית בין תא ההרג לתא המטרה ולאסוף נתונים ברמת

(. 3הפרט הבודד )

מטרת הפרוייקט

תאי אוכלוסיית :NKאפיון הרג ודפוסי? / הטרוגנית הומוגנית אוכלוסייה על מדובר האם? - אותם מאפיין ומה יש תאים סוגי אילו והטרוגנית במידה , , זמני ) מרחק מהירות התא תנועת בין קשר יש האם

? ההרג( ואחוזי התא לתגוביות תגובה

עם NKתאי החיסון מערכת בהתמודדות חשוב חלק מהווים , ועם בפרט ווריאלית סרטנית התמרה שעברו תאים

. הפעולה מנגנוני שהבנת היא השאיפה בכלל פתוגנים , , טיפולים לפתח בעתיד תעזור אלו תאים של ההרג ודפוסי

. נוספות ומחלות סרטן כנגד יותר וממוקדים יעילים

נתונים של בסדרה הופקו 3הנתונים

גבוהה ברזולוצייה הדמייה ניסוייתאי בבאריות NKשל שנזרעו

תאי עם יחד סיליקון פלטת . במשך צולמו התאים ומדיום מטרה

12 , של במרווחים .2שעות דקות : הכיל הגולמי הנתונים קובץ

.1- ה תא ..NKמיקום דגימה בכל במרחב

המטרה 2. לתא הדבקות זמני(conj_start ,)ההרג סיום זמני(conj_end )מתא סופית הנתקות וזמני

(.ADH_endהמטרה )Onfelt B. Et al. (2010). Imaging Immune Surveillance of Individual Nature Killer Cells Confined in Microwell Array. PLoS ONE, vol.5, issue 11.

Onfelt B. Et al. (2010). Imaging Immune Surveillance of Individual Nature Killer Cells Confined in Microwell Array. PLoS ONE, vol.5, issue 11.

נתונים :עיבוד - בין ומהירות מפגש כל במשך מהירות מהירויות חישוב

בהתאמה התא שעבר המרחקים וחישוב המפגשים.) במטלב) אלגוריתם

' - מס התאים מאפייני של וממוצעים הסתברויות חישוב ' , , ויצירת, וכו מהירות תגובה זמני הרג אחוזי אינטרקציות

. התוצאות סמך על גרפים - היררכי אשכול ידי על דומות לקבוצות התאים חלוקת

ותאים אחד מפגש לפחות שעשו תאים בחשבון נלקחו .) במטלב ) אלגוריתם אחת פעם לפחות שהרגו

:תוכנותIBM SPSS Statistics 21 Microsoft Office- EXCEL 2007 MATLAB, R2013b (8.0.0.783)

שיטות

סכמת עבודה

תוצאות עיבוד קוד

נקודות 2 תאים. חישוב המרחק לפי 178ריצה על כל ה- •(X,Y.והכנסתם לתוך וקטור מרחקים )

חישוב המהירות בזמן המפגש: ריצה על מטריצת הזמנים • adh_end עד conj_startוחישוב המהירות לדקה עפ"י

חישוב המהירות בין המפגשים: מתבסס על אותו עקרון •למעט בדיקת אם זה המפגש הראשון או המפגש האחרון.

מטריצת מהירויות לכל מפגש ובין המפגשים פר תא.פלט: •חישוב כל המרחקים הכוללים של התאים •חישוב המרחק בין המפגשים יחד עם זמני חפיפה בין •

המפגשיםיצירת גרפים לבדיקת מפגשים של התאים- האם המפגשים •

גורמים לחלוקה הגיונית של התאים לקבוצות.

עיבוד נתונים סטטיסטי

-בניית קבצי נתונים בSPSS נתונים לפי תאים :ונתונים לפי מפגשים.

שימוש במבחנים סטטיסטיים )מבחןt לשני מדגמים בלתי תלויים, מבחן ספירמן, מתאם

פירסון, רגרסיה:לינאית ולוגיסטית( כדי למצוא קשרים בין המשתנים. המבחן נבחר לפי סוג

המשתנה. חישוב הסתברויות, ממוצעים וכו' )סטטיסטיקה

תיאורית( עבור פילוחים שונים של קבוצות תאים )לא הגיבו, לא הרגו, הרגו(.

( שימוש במבחנים סטטיסטייםANOVA רגרסיה ,

.לוגיסטית( למציאת קשר בין קבוצות האשכול

בדיקת הטרוגניות:

(. האשכול i>0 תאים, 140אשכול הררכי: )• תכונות: 5התבסס על חישוב המרחק האוקלידי בין

מס' אינטרקציות, מהירות ממוצעת, משך התגובה, מרחק כולל ואחוז ההרג.

קבוצות 20 ו- 7, 3 אשכולים: חלוקה ל- 3יצרנו •תאים.

עם המרחק linkage האשכול נבנה לפי פונקציית •הממוצע של כל תא עפ"י חמשת התכונות הנ"ל.

. dendrogramחלוקת כל התאים ע"י ה- •סיווג כל תא שנבדק לקבוצה הנכונה בכל אשכול•חישוב ממוצע לכל קבוצה עפ"י כל תכונה ועיבוד •

הנתונים מבחינה ביולוגית

ניתוח הנתונים

. NK תאי 178 בניסוי נבדקו

- התפלגות התאים לפי 2תרשים סוג האינטרקציה עם תאי

המטרה.

- התפלגות מספר האינטרציות של תאי 1תרשים עם תאי המטרה.NKה-

i=021%

i>0, k=028%

k>051%

0 1 2 3 4 5 6 80.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.250.21 0.21 0.20 0.19

0.070.06

0.01 0.01

number of interaction

dist

ribu

tion

i- number of interactions; k- number of kills;

1 2 3 4 5 6 7 80.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.3000.26

0.250.23

0.090.07 0.06

0.01 0.007

number of interactions

dist

ribu

tion

- הסתברות לאינטרקציות עבור 3תרשים שהגיבו לפחות פעם אחת עם NKתאי

תא מטרה.

0.75

k>0, 90 cells i>0, 140 cells

n 90 140

<i> 3.17 2.74

<k> 2.46 1.58

<t1> (min) 62.21 78.41

n- number of cells; i- number of interactions; k- number of kills; t1- time (min) till first interaction.

ההרג- 4תרשים אינטרקציית. התאים של הראשונה

ההרג- 5תרשים מפגשי מספרתאי .NKשל

First kill interaction

perc

ent

perc

ent

Total killing

תקופת אין"/" חניכה" חימום

"

0.82

.6תרשים , השני- מהמפגש החל הרג מפגשי מספר לפי ההרג אחוזי התפלגות

Cells

(%)

Killing (%)

K>1 K>2

K>3 K>4

0 1 2 3 4 5 6 7 80.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.700.60

0.27

0.07 0.04 0.01 0.01

number of interactions

perc

ent

-7תרשים ' ה- שתא אחרי מטרה תאי עם המפגשים . NKמס להרוג הפסיק

Kinetic priming

" " של מתפרצת ה הקינטיקה להסברת מודלים:NKתאי

Search time modelKinetic priming

Choi PJ & Mitchison TJ (2013) Imaging burst kinetics and spatial coordination during serial killing by single natural killer cells. PNAS.1221312110.

1 2 3 4 6 70.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30 0.27 0.270.24

0.090.11

0.02

number of killing interactions

perc

ent

בבת- 8תרשים להרוג שהפסיקו התאים יצרו הרג מפגשי כמהאחת.

0.78

להרג סיכויבמפגש כאשר

היה הקודם לאהרג

, הרג בהינתןשבמפגש הסיכוי

הרג הקודם היה

סיכוי להרג

i

0.03 0.96 0.59 20.05 0.89 0.54 30.11 0.88 0.51 4

0 0.90 0.50 50 0.83 0.50 6

2 3 4 5 6 7 8020406080

100120

103

68

3522

122 1

61

3718 11 6 1 0

59

3316 10 5 1 0

interaction number

NK

cells

-9תרשים ההרג התפלגות

. מפגש בכל ' מס- כחול

האינטרקציות - אדום. המפגש

שהרגו תאים - ירוק, במפגש

הרג תאי ," סדרתיים"

בכל גם שהרגוהמפגשים הקודמים.

t1 first_conj_length first_adh_length0

20

40

60

80

100

120

62.21

89.73

32.74

107.5893.04

49.26 k>0k=0m

in

- השוואת זמנים בין תאים שהרגו לתאים שלא הרגו כלל.10תרשים

אינטרקציות- )11תרשים כולל<(, )>i>ממוצע הרג )>kממוצע ממוצע<(, כולל הרג kאחוזהראשון%<( ) במפגש ממוצע הרג , k1%ואחוז . פינה( שחור קו זמן קטגוריית כל עבור

- תאי מספר עליונה .NKשמאלית קטגוריה בכל

<i> <k> <k%> k1 %0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0-3031-6061-9091-120121-150151-180>180in

tera

ction

s

<k%> k1 %0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0-3031-6061-9091-120121-150151-180>180

%אינטרקציות יותר

כולל הרג ויותר

מובהק הבדל אין - ההרג באחוזי- ה ובמפגש 1כללי

תאי- 12תרשים של ההקשרות / NKזמני , לא שהרגו לתאים בחלוקה המטרה לתאיהרגו.

conj_length

_1

adh_length

_1

conj_length

_2

adh_length

_2

conj_length

_3

adh_length

_3

conj_length

_4

adh_length

_4

conj_length

_5

adh_length

_50.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

k>0k=0

min

- 13תרשים . , זמני - בין חפיפה בהיר סגול השני מהפגש החל הרג מפגשי בין החפיפה אחוזי ) ( , - האינטרקציה. לתחילת עד דקות ממוצע זמן הזמנים בין חפיפה אין כהה סגול המפגשים

הבאה(.

interaction_2 interaction_3 interaction_4 interaction_50.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

1.000

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0.62 0.72 0.75 0.90

17.77

33.85

41.75

15

dt<0dt>0

min

%

• .•

של- 17תרשים כולל משךתא, כל עבור מפגשים

באשכול.

total distance during interactions0.00

100.00200.00300.00400.00500.00600.00700.00800.00900.00

1000.00

131.66

919.22

436.27 group 1 (88)group 2 (5)group 3 (47)d

ista

nce

(μ

m)

total duration of interactions0.00

10.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.00

100.00

26.11

89.77

69.19

group 1 (88)group 2 (5)group 3 (47)

, 16תרשים אינטרציות- מספר של ממוצעים ערכים. באשכול קבוצה כל עבור הרג ואחוז מהירות

במהלך- 18תרשים כולל מרחק. באשכול, קבוצה כל עבור המפגשים

, 15תרשים ראשוני 3אשכולעל. בוצע תאים 140קבוצות

שהגיבו.

time

(min

)

average no. of interac-tions

average speed during interactions

average killig (%)0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

2.34

2.99

0.54

3.603.35

0.43

3.403.05

0.51

group 1 (88)group 2 (5)group 3 (47)

num

ber o

f in

tera

ction

s/sp

eed

(μm

/min

)/ k

illin

g (%

)

אשכול שהרג- 3לפי מיפחות )%(- יותר

, ומהירות אינטרקציותמפגש ומשך מרחק

יותר .קצרים

סימולציה

* - ללא הטרוגניים בתאים התמקדה היא במטלב סימולציה הרצנו)" ראשוני)" חימום , סטימולציה

. הראשון מהמפגש כבר להרוג שיכולים•. " בהיסטוריה כתלות ההרג את בחנה לא ל הנ הסימולציה• . , תחילה המפגשים ומשך המפגש עד הזמנים התפלגות נבדקו

לאחר . המפגש עד הזמנים של המצטברת ההסתברות חושבהמקסימום לבין להרג ההסתברות בין קומבינציות עשינו מכן

. סימולטניים מפגשים• - הניסוי תוצאות את תאמו לא הסימולציה תבנית תוצאות

הסימולציה ממסקנות שונה הייתה בניסוי בסימולציה; ההרג , כן כמו עצמו בניסוי מאשר תא לכל מפגשים יותר הרבה נספרו

." סידרתיים " רוצחים נמצאו לא

To be continued..סימולציות:

: הומוגנית התפלגות. - לנתונים מתאים לא הומוגנית התפלגות - מתאים + לא הרג פחות הראשון במפגש הומוגנית התפלגות

לנתונים. + הומוגנית .- kinetic primingהתפלגות לבחון יש

הטרוגנית: - , האחרון המפגש של לפחות בהיסטוריה תלות .יש לבחון יש - שונים מאפיינים עם תאים .סוגי לבחון יש

הנחות:t1. ארוך-.

דיון

:" סדרתי " הרג של דפוס על מצביעים שהתקבלו הנתונים - צורך ללא הראשונה מהאינטרקציה כבר זאת עשו שהרגו תאים

." " " חניכה " או חימום בתקופת. יותר מהירה ראשונה אינטרציה יצרו הללו התאים בעלי הם הללו התאים . 100%רוב - שיצרו מפגש בכל הרגו הצלחה במפגש להרג בסביבות iהסיכוי הוא הרג היה הקודם במפגש כאשר

הראשונה. 90% שאינה באינטרקציה להרוג התחילו בודדים תאים רק. קודמת הרג היסטוריית וללא

0.6 מפגשי מספר אחרי אינטרקציות ליצור הפסיקו שהרגו מהתאיםעד- הרגו זו בקבוצה התאים רוב . 3הרג פעמים

- הסימולציה באמצעות להיסטוריה קשר ללא הטרוגנית התפלגות בחנוהניסוי תוצאות את תואמות לא שתוצאותיה יותר; נמצא הרבה ראינו

." " , סדרתיים רוצחים נמצאו לא בניסוי מאשר תא לכל מפגשים

תודות , - ' , והעזרה ההדרכה על מר רמית פרופ המעבדה לראש

דרכינו את ולגשש ולתהות לנסות הלגיטימציה עלמדעי במחקר .הראשונה - וההבנה; הסבלנות על וכמובן

.)!!! ( , טוב מזל והליווי ההדרכה על סימון למיכל , - הניתוחים" עם העזרה על שחף לביא גתית ר לד

הסטטיסטיים.. , האשכולים וניתוח בהכנת הרבה העזרה על פיקמן לישי , לשבת והמוכנות והרעיונות ההצעות על פנחס לניסים

. מהניסיון ולתרום איתנו , - הבונות וההארות ההערות על המעבדה חברי לכל

. הראשונית המצגת לשיפור