第二十一章免疫学检测原理

制作：姚新生审校：孙万邦联系： [email protected];0852-8204419

上一页下一页上一页下一页返回返回本章首页第一节第二节第三节

免疫学应用免疫学应用本科免疫学本科免疫学 POWERPOINTPOWERPOINT讲稿讲稿

免免疫疫应应用用

第二十一章免疫学检测原理

免疫学检测乃借助免疫学、细胞生物学和分子生物学理论或技术，对抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子等进行定性或定量检测。免疫学检测技术在医学生物学研究领域得到广泛应用，并在临床实践中用于探讨免疫相关疾病的发病机制及其诊断、病情监测与疗效评价等。随着现代免疫学以及细胞生物学、分子生物学等相关学科的进展，免疫学检测技术不断发展和更新。

第一节基于抗原 - 抗体反应的检测方法第二节免疫细胞的检测第三节免疫分子的检测





学习指导

1 、掌握凝集反应和沉淀反应的概念 2 、掌握免疫细胞和免疫分子常用检测方法的名称 3 、熟悉三大标记技术的原理和方法及其应用 4 、了解免疫学方法的研究概况、进展及在临床中的应用





第一节基于抗原 - 抗体反应的检测方法

一、抗原抗体结合反应的特点（熟悉）（一）特异性和交叉反应（二）抗原 - 抗体结合的带现象与可见性抗体反应中，可能出现抗原或抗体过剩的情况，由于过

剩一方的结合价不能被完全占据，多呈游离的小分子复合物形式，或所形成的复合物易解离，不能被肉眼察见，此为前带现象（ prozone ）即抗体过剩，或后带现象(postzone) 即抗原过剩。

（三）可逆性抗原 - 抗体反应为分子表面的非共价结合，结合虽稳定但

可逆。





第一节二、抗原 - 抗体反应的影响因素（熟悉）

（一）电解质（二）酸碱度抗原抗体反应的最适 pH 是 6~8 。（三）温度抗体 - 抗原反应的最适温度为 37℃ 。（四）抗原和抗体的性质抗体的特异性和亲和力是决定抗原 - 抗体反应的关键因素。抗原和抗体的浓度、比例对抗原 - 抗体反应的影响最大，

是决定性因素





第一节三、抗原抗体反应的基本检测方法

（一）凝集反应（图 21-1 ）（掌握）细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一

定条件下出现肉眼可见的凝集物，此为凝集反应(agglutination) 。

1 ．直接凝集 2 ．间接凝集 3 ．间接凝集抑制试验





各种凝集反应示意图






（二）沉淀反应（掌握）可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液、各

种微生物蛋白分子等）与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀，此为沉淀反应 (precipitation) 。

1 ．单向免疫扩散 (single immunodiffusion) 2 ．双向免疫扩散 (double immunodiffusion) 3 ．免疫电泳 (immunoelectrophoresis) 4 ．免疫比浊 (immunonephelometry)





单向免疫扩散 (single immunodiffusion)





双向免疫扩散 (double immunodiffusion)





免疫电泳 (immunoelectrophoresis)





对流免疫电泳





火箭免疫电泳






（三）补体参与的反应（了解）应用抗体与红细胞表面抗原结合，激活反应体系中的补

体成分，根据溶血现象判定试验结果。补体结合试验和溶血空斑试验（后叙）均属此类反应。补体结合试验曾用于检测多种细菌、病毒的抗原或抗体，因易受多种试验条件影响，已渐被其他方法取代。此外，补体依赖的微量细胞毒实验曾用于 HLA 的血清学分型，方法是：将标准分型血清与待检淋巴细胞反应，再加入兔补体，若细胞表面表达相应 HLA 抗原，则被溶解。溶解细胞可被台盼蓝或伊红染料着色，而活细胞不着色，藉此判定结果。






（四）免疫标记技术（熟悉）免疫标记技术（ immunolabelling technique ）乃用荧光

素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原 - 抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。

。






（四）免疫标记技术 1 ．免疫荧光法 (immunofluorescence ， IF) 此法乃用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原 - 抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。

（ 1 ）直接荧光法：（ 2 ）间接荧光法：





免疫荧光法 (immunofluorescence ， IF)






（四）免疫标记技术 2 ．酶免疫测定 (enzyme immunoassay ， EIA)

（ 1 ）酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay ， ELISA) ：是酶免疫测定中应用最广的技术，用于测定可溶性抗原或抗体。其基本方法是：将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原 - 抗体反应在固相表面进行，借助洗涤将固相上的抗原 - 抗体复合物与液相中游离成分分离（图 21-6 ）。 ELISA 的操作方法很多，以下简介几种基本方法。





第一节基本检测方法 --- （四）免疫标记技术

1 ）双抗体夹心法： 2 ）间接法： 3) 酶联免疫斑点试验 (ELISPOT): 其原理是： 4 ） BAS-ELISA ：

ELISA 技术的优点是灵敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等





间接法






（四）免疫标记技术（ 2 ）免疫组化技术 (immunohitochemistry techenique) ：应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态

学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。常用技术包括酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）、免疫金组化（胶体金颗粒标记）、免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记）等






（四）免疫标记技术 3 ．放射免疫测定法 (radioimmunoassay ， RIA) 乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原 - 抗体反应的特异性，检测灵敏度达 pg水平。常用于标记的放射性核素为 125I和 131I ，分为液相和固相两种方法。该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、 IgE 等。






（四）免疫标记技术 4 ．化学发光免疫分析将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，

发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高，常用于检测血清超微量活性物质（甲状腺素等激素）。






（四）免疫标记技术 5 ．免疫印迹法 (immunoblot) 该法又称 Western印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫

技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原（图 21-10 ）。





第二节免疫细胞的检测

一、免疫细胞及其亚类计数（了解）（一）外周血单个核细胞的分离体外检测淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞

(peripheral blood mononuclear cell ， PBMC) ，常用的方法是葡聚糖 - 泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。





第二节一、免疫细胞及其亚类计数（了解）

（二）淋巴细胞亚群的分离

1 ．尼龙棉分离法 2 ． E花结分离法 3 ．洗淘法 4 ．流式细胞术 (flow cytometry ， FCM) 5 ．磁分离技术





第二节一、免疫细胞及其亚类计数

（三）淋巴细胞亚群计数 1 ．免疫荧光技术 2 ．微量细胞毒试验在补体存在下，针对淋巴细胞 CD 分子的 McAb 与相应

CD 分子结合，可激活补体而使细胞溶解，通过活细胞和死细胞对染料着色的不同，即可判断待检细胞是否表达特定 CD 分子，从而对淋巴细胞亚群进行计数





第二节二、淋巴细胞功能测定（了解）

（一）淋巴细胞功能测定的体外试验

1. 淋巴细胞增殖试验（ 1 ） 3H-TdR掺入法：（ 2 ） MTT 法：（ 3 ）形态学计数法：





第二节二、淋巴细胞功能测定（了解）

2 ．细胞毒试验 CTL 、 NK 细胞可直接杀伤不同靶细胞（如肿瘤细胞、移植供体细胞等）。通过检测杀伤活性可用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面研究。

（ 1 ） 51Cr释放法：（图 21-11 ）。（ 2 ）乳酸脱氢酶（ LDH ）酶释放法：（ 3 ）细胞凋亡检查法：





第二节二、淋巴细胞功能测定

3 ．分泌功能测定（了解）（ 1 ）细胞因子分泌细胞的测定：（ 2 ）抗体形成细胞测定：常用溶血空斑试验 (hemolytic

plaque assay) ，即测定针对 SRBC 表面已知抗原的抗体形成细胞数目。其原理是：抗体形成细胞分泌的 Ig 与 SRBC表面抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数（图 21-12 ）。亦可采用 RHPA 和 ELISPOT 法检测抗体分泌细胞。

图 21-12 溶血空斑试验





第二节二、淋巴细胞功能测定

（二）淋巴细胞功能测定的体内试验（了解）正常机体对特定抗原产生细胞免疫应答后，再用相同抗

原作皮肤试验，即出现以局部红肿为特征的迟发型超敏反应，细胞免疫低下者呈阴性反应。皮肤试验方法简便，可辅助诊断某些病原微生物感染（结核杆菌、麻风杆菌）、免疫缺陷病等。皮肤试验常用的生物性抗原多从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素、链激酶 -链道酶、念珠菌素、腮腺炎病毒等。





第三节免疫分子的检测

一、免疫球蛋白的测定（了解）免疫球蛋白的测定有两类方法：①在体外用已知抗原

检测相应抗体，用于多种感染性疾病的辅助诊断与流行病学调查（前已述及）；②用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量测定。检测血清含量高的IgG 、 IgA 、 IgM时，可用免疫比浊法；检测 IgD 、 IgE选用 ELISA 、 RIA 等灵敏度高的方法。诊断免疫球蛋白异常性疾病（如骨髓瘤、性联无丙种球蛋白血症等），可用免疫电泳等方法





第三节二、补体测定（熟悉）

测定血清补体含量与活性有助于了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊断。对血清含量高的 C3 、 C4 、 B 因子等，可用免疫比浊法，其他含量低的成分则借助 ELISA 、RIA 等方法。血清总补体活性测定常采用 50% 补体溶血法（ CH50 ），其原理是：用 SRBC 和兔抗 SRBC 作为抗原抗体复合物，通过经典途径激活待检血清中的补体，导致 SRBC 溶解。若待检血清补体含量减少或成分缺失，则影响溶血结果，通常以 50% 溶血所需的最小补体量表示总补体活性





第三节三、细胞因子检测（了解）

细胞因子检测可分为免疫学测定法、生物学活性测定法及分子生物学测定法。

（一）免疫学测定法 1 ．分泌性细胞因子检测常用方法为双抗体夹心

法、 ELISA 、免疫斑点法、放射免疫法（ RIA ）、 ELISPOT 、免疫印迹法等。某些细胞因子含量甚微的样品（如脑脊液）可用免疫聚合酶链反应（ immuno-PCR ）。

2 ．胞内细胞因子检测采用 FCM 免疫荧光技术可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的细胞因子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同细胞因子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的细胞因子，也可用多参数流式细胞术对胞内多种细胞因子进行检测。





第三节三、细胞因子检测

（二）生物活性测定法 1 ．促进细胞增殖和增殖抑制法 2 ．抗病毒活性测定法 3 ．直接杀伤法 4 ．趋化活性测定法此外，某些细胞因子能诱导靶细胞表达某些膜分子或可

溶性蛋白质，可用荧光素标记抗体检测表达相应分子的细胞数，或测定细胞所分泌的蛋白质，间接了解细胞因子活性。





第三节三、细胞因子检测

（三）分子生物学测定法具体方法为聚合酶链反应（ PCR ）、实时定量

PCR 、 RNA印迹法、核酸酶保护分析法和原位杂交法等，例如：根据细胞因子基因核苷酸序列设计相应引物，借助逆转录 PCR 测定待检细胞中特异性 mRNA 。





第三节四、 CD 分子、表面受体和黏附分子的检测（了解）

检测细胞表面 CD 分子、表面受体和黏附分子可用于鉴别免疫细胞及其亚类，并了解其分化、活化状况。用已知的抗 CD 分子、表面受体或黏附分子抗体可鉴定细胞表面相应膜分子，常用的方法有间接免疫荧光法、流式细胞术等。某些 CD 分子、受体分子和黏附分子还存在可溶性形式，可采用 ELISA 等免疫学方法测定其含量。





第三节五、 HLA型别分析（了解）

以往主要借助血清学和细胞学方法进行 HLA型别分析，目前基因分型已成为主流技术，常用者为指纹图谱技术、聚合酶链反应 -序列特异性寡核苷酸探针 (PCR-SSOP) 、聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性（ PCR-RFLP ）、聚合酶链反应 - 单链构象多态性 (PCR-SSCP) 、聚合酶链反应 -序列特异性引物（ PCR-SSP ）、单核苷酸多态性分析（ SNP ）等。 HLA 分型技术在同种移植供、受者配型、亲子鉴定和某些疾病研究中已被广泛应用。





本章小结

1 、掌握凝集反应和沉淀反应的概念2 、掌握免疫细胞和免疫分子常用检测方法的名称3 、熟悉三大标记技术的原理和方法及其应用4 、了解免疫学方法的研究概况、进展及在临床中的应用

第 二十一章 免疫学检测原理

Documents

第二十一章免疫学检测原理