大肠杆菌表达重组人粒细胞 - 集落刺激因子包涵体的复性与纯化

创新实验 I- 化学生物学

< 化学生物学实验 > 课程组 王骊丽

实验四

NORTHWEST UNIVERSITY化学国家级实验教学示范中心

• 基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。

• 重组蛋白分离纯化：细胞收集 、破碎；包涵体的溶解；

• 蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法；

• 蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法

实验技能训练要点主要新知识

• 仪器分析：色谱技术 –液相色谱技术……

• 仪器分析：光谱技术 - 荧光光谱、核磁共振 ……

• 化学生物学导论：蛋白质、酶……

• 蛋白质与酶化学：重组 DNA 技术……

• 蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征… ..

• 有机化学：荧光探针

实验技能训练要点主要知识回顾

背景知识

• 实验室研发从 E.coli 中得到一个具有活性的治疗用药物蛋白

或者研究用蛋白纯品，包括以下步骤：

• ①目的基因 DNA片段的获得；② E.coli 重组表达载体的构

建；③在 E.coli 中对目的基因进行表达；④目的蛋白从

E.coli 裂解液中的纯化；⑤规模化生产工艺（包括工程菌发

酵、复性与纯化工艺的放大等）的建立。

关键词：重组人粒细胞 -集落刺激因子、液相色谱复性与纯化Recombinant human granulocyte colony stimulating factor,

Renaturation and purification by liquid chromatography

实例：粒细胞白血病

粒细胞白血病 (ML) 在我国其发病率占成人新诊断白血病 20%以上，年发病率为 10万分之 1。

人粒细胞 - 集落刺激因子对造血系统的调控作用

HSC

CLP

CMPGMP

MEP

Pro-T

Pro-B

T

B

NK

单核细胞

粒细胞

巨核细胞

红细胞

SCF;IL-2

SCFEPO

SCF

SCF

SCF

SCF

IFN-

SCF

基质细胞

SCF

名称氨基酸残基数

二硫键数

相对分子质量与等电点

主要产生细胞

主要生物学

rhG-SCF

177 分子中

含有 5个

半胱氨酸

残基，可

形成两个

二硫键

19.6kD;

pI 6.0

巨噬细胞、内

皮细胞及纤维

母细胞

能高度特异性

的刺激中性白

细胞系的前体

细胞存活、增

殖和分化，同

时也是成熟的

中性白细胞的

功能活化因子

rhG-CSF 的理化性能与生物学功能

复性与纯化方法

添加剂 质量回收率 (%)

纯度(%)

生物活性(×108IU/

mg)

IEC3.0 mol/L urea,2.5m mol/L GSH, 0.8 m mol/L GSSG

49.0 96 3.0

HIC N.R. 42.6 96.8 2.1

SEC15% glycerol (v/v),2.5m

mol/L GSH, 0.8 mM GSSG30.0 83 1.2

脲梯度SEC

15% glycerol (v/v), 2.5m mol/L GSH, 0.8 m mol/L

GSSG46.1 N.R 1.0

AFC 2.0 mol/L urea 32.0 97 1.8

AFC 3.0 mol/L urea 39.0 97 2.3

几种 PFLC法复性与纯化 rhG-CSF包涵体结果比较

西北大学化学与材料科学学院

实验内容提要一、实验目的

二、实验原理

三、实验仪器与试剂

六、实验延伸

五、实验结果与讨论

四、实验步骤与方法

思考题 参考文献

一、实验目的

• 掌握包涵体的变性、复性的基本原理；• 熟练掌握复性与纯化后蛋白质的表征和鉴定方法；• 熟练掌握蛋白质含量测定和蛋白质构象的表征。

通过人粒细胞 - 集落刺激因子 (GC-CSF) 基因扩增和在大肠杆菌 DH5α 中重组包涵体蛋白表达、复性的实验，使学生了解大肠杆菌包涵体形成和特点 ; 了解二硫键形成与构象的关系；

基因工程技术是指人们按照自己的愿望，通过体外 DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物物种，使现有物种出现人类需要的性状的技术 ;

以大肠杆菌克隆表达系统为基础的原核基因工程技术，使得人们可以在大肠杆菌中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白。

二、实验原理 --基因工程技术

大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在； 包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀

物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性；

包涵体能够溶解于强的变性剂，如 8 mol/L 脲或 6-7mol/L 盐酸胍溶液中。

二、实验原理—包涵体的形成和特点

超声破碎包含体

外周质

胞浆

沉淀

可溶部分

洗涤溶解离心

离心

包涵体复性

直接稀释法（ Direct dilution ），包括透析法和超滤法

液相色谱复性法（ Chromatographic methods for

protein refolding ）

人工配基辅助的蛋白复性（ Artificial molecular

chaperone assisted protein refolding)

二、实验原理—体外复性的主要途径

液相色谱复性蛋白的过程

蛋白质被可逆地吸附在固定相以单个分子存在，从而实现单个分子相互分离，并抑制聚集产生，合适的流动相将蛋白分子从固定相上洗脱。

MP

Hydrophobic amino acid residues

Hydrophilic amino acid residues

Water molecules

Ligands of HPHIC stationary phase

HL, Hydrated Ligands; Uh, Unfolded hydrated-amino acid sequence;

MR, Microdomain Region; IR, Induced Region; In, Intermediate;

H L

12

34

56

7 8 910 11

12

1314

1516

17

1819 20 21

2223

Uh

1

2

3

4

5

67

8

91011

12

13

1415

16

17

18

19

20

2122

23M R

I RIn

MPMP

Hydrophobic amino acid residues

Hydrophilic amino acid residues

Water molecules

Ligands of HPHIC stationary phase

Hydrophobic amino acid residues

Hydrophilic amino acid residues

Water molecules

Ligands of HPHIC stationary phase

HL, Hydrated Ligands; Uh, Unfolded hydrated-amino acid sequence;

MR, Microdomain Region; IR, Induced Region; In, Intermediate;

H L

12

34

56

7 8 910 11

12

1314

1516

17

1819 20 21

2223

Uh

1

2

3

4

5

67

8

91011

12

13

1415

16

17

18

19

20

2122

23M R

I RIn

西北大学化学与材料科学学院

三、实验试剂和仪器

尿素（成都金山化学试剂厂），乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；三氟醋酸（分析纯， Fluka公司）；硫酸铵、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯化钠、浓盐酸等均为分析纯（西安化学试剂厂）。 α- 氰基 -4- 羟基肉桂酸（ CHCA ）均购自 Sigma 公司（ St. Louse ， MO ，美国）。

试剂

三、实验试剂和仪器

纯水仪离心机

二氧化碳培养箱

快速蛋白纯化仪 日立 F-4500 荧光光谱仪

仪器

天数 实验内容 实验准备 相关知识点第 1天

包涵体粗分离、溶解

配制变性剂及其缓冲液，装填色谱柱

细胞的破碎，离心技术

第 2天

利用稀释法、 HIC法进行包涵体的复性与同时纯化

配制色谱流动相 稀释法、色谱复性与纯化原

理第 3天

理化性质分析，分子量，蛋白质含量

SDS-PAGE、质谱紫外分光光度计

电泳、质谱技术

第 4天

一级结构、高级构象、生物学活性

荧光光谱仪、配制测定活性缓冲液

荧光光谱、MTT法

第 5天

数据处理、整理 实验报告  

环节 1

环节 2

环节 3

四、实验步骤与方法—实验天数

四、实验步骤与方法PCR扩增技术获得

rhGC-CSF基因

插入克隆载体进行测序

回收扩增片断

插入表达载体表达 5L 或 50L发酵罐

蛋白的生物活性和理化性质分析

正确的基因

筛选表达最好的菌株

获得包涵体蛋白

多种方法复性重组包涵体蛋白

获得有活性的蛋白

四、实验步骤与方法 -流动相组成

• 普通 SEC ： 0.15 mol/L NaCl ， 3.0 mol/L urea ， 0.05

mol/L Tris-HCl ， 1mmol/L EDTA + 1.0

mmol/L ， pH8.0 GSH/0.1mmol/L GSSG ， 15%甘油 ;

• 脲梯度 SEC ： A 为 0.05 mol/L Tris (pH 8.0) ， 1.0 m

mol/L EDTA ， 0.15 mol/L NaCl ， 2.5 mmol/L GSH

+ 0.8 mmol/L ； B 为 8.0 mol/L urea。

1 、普通 SEC 法对 hG-CSF 复性与纯化

• 流动相平衡 Superdex 75(16/20)柱子，然后将 200 μL 8.0

mol/L脲溶解变性的 rhG-CSF溶液直接进样到平衡好的色谱柱中，用平衡时所用的流动相洗脱复性的 rhG-CSF。

• 流速 1.0 ~ 4.0 mL/min，检测波长为 280 nm。

• 收集复性的 rhG-CSF馏分，测定蛋白浓度。

• 将收集液用稀盐酸将其 pH调至 4.0，然后对储存液 10.0

mmol/L NaAc缓冲液 (pH 4.0)透析，透析后的含 rhG-

CSF的溶液用于测定生物活性。

2 、脲梯度 SEC 复性 rhG-CSF

• 用流动相 A 和 B按一定比例的混合液平衡色谱柱，然后在

10或者 15 mL内将 B液浓度增至 100%。按上述方法平衡

后，将不同体积还原变性的 rhG-CSF直接进入 SEC色谱柱，

然后以 2.0 mL/min的流速用 B液洗脱。检测波长 280 nm。

• 收集复性的 rhG-CSF，用稀盐酸将其 pH调至 4.0，然后对

储存液 10.0 mmol/L 醋酸钠缓冲液（ pH 4.0）透析。透析

后的含 rhG-CSF的溶液用来测定蛋白浓度和生物活性。

优化的条件下复性与纯化

• 普通 SEC法： 流动相为 0.15 mol/L NaCl , 0.05 mol/L Tris,

1.0 mmol/L EDTA, 2.5 mmol/L GSH ,0.8 mmol/L GSSG ,

3.0 mol/L urea ,15% 甘油 (v/v) ， pH 8.0 ；

• 脲梯度 SEC法： 流动相为 0.15 mol/L NaCl , 0.05 mol/L

Tris,1.0 mmol/LEDTA ,2.5 mmol/L GSH ,0.8 mmol/L

GSSG ,15% 甘油 (体积比 ) ， pH 8.0；流动相 B：流动

相 A+ 8.0 mol/L 脲

• 流速为 2.0 mL/min, 检测波长 280nm

rhG-CSF 的 SEC复性与同时纯化产物色谱图；复性与纯化产物 SDS-PAGE分析图；紫外分光光度法测定复性与纯化产物含量结果；荧光光谱表征复性前后的构象；

五、实验结果与讨论

0.0

10.0

20.0

30.0

mAU

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 min

SEC 复性 rhG-CSF 的色谱图

实线代表 rhG-CSF的洗脱曲线， * 表示复性的 rhG-

CSF

脲梯度 SEC 复性 rhG-CSF 的色谱图

五、实验结果与讨论 - 色谱图

1 2 3

1, rhG-CSF 包涵体提取液 ;

2, 分子量标准蛋白 (从底部到顶部依

次为 14,400; 20,100; 31,000; 43,000;

66,200; 97,400 Dalton);

3, SEC复性并部分纯化后的 rhG-CSF

五、实验结果与讨论 -电泳分析

进样量 (L) 脲梯度 SEC

的比活 (×107

IU/mg)

脲梯度 SEC

的质量回收率 (%)

普通 SEC 的比活 (×107

IU/mg)

普通 SEC 的质量回收率

(%)

100 12.8 53.2 12.3 31.4

200 12.1 52.8 11.9 30.1

500 10.4 46.1 8.1 24.7

700 8.9 41.7 7.0 19.1

1000 8.1 31.8 5.8 9.3

脲梯度 SEC和普通 SEC 对 rhG-CSF复性的比较

五、实验结果与讨论 - 对比分析

五、实验结果与讨论 - 蛋白的构象表征

• 圆二色谱法

荧光光谱法

• 使用超声波时应控制强度在一定的限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。产生泡沫会导致蛋白质变性。

• 样品加上上样缓冲液煮沸后，一定要进行离心，以除去颗粒物质。

• 电泳上样时要小心，不要污染旁边的泳道。

• 在复性蛋白时，要注意一定要缓慢加入包涵体复性缓冲液，以防止变化太快造成蛋白质聚集析出。

五、实验结果与讨论 -注意事项

六、实验延伸 - 二硫键对接

Zhang L, Chou CP, Moo-Young M. Disulfide bond formation and its impact on the biological activity and stability of recombinant therapeutic proteins produced by Escherichia coli expression system. Biotechnol Adv 2011; 29:923–9

最具有代表性的是多维能量景观学说（ multidimensional energy landscape) 和折叠漏斗 (folding funnel) 模型。这两种机制都可以很好地预测蛋白的复性路径。

蛋白折叠的漏斗形能量景观图

六、实验延伸 - 蛋白质折叠机制

实时核磁共振光谱可用来跟踪蛋白的折叠反应

六、实验延伸 - 蛋白折叠研究新技术

思考题– 蛋白质的 CD光谱与其分子构象有何关系？圆二色性光谱法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？

– 蛋白质的紫外光谱与其分子构象有何关系？该方法可以为蛋白质分子构象提供哪些信息？

– 你能否通过关键词，查阅和设计一个有功能细胞因子从基因克隆、表达与复性的实验？

参考文献 1. Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation with simultaneous purification of rhG-

CSF from Escherichia coli by ion exchange chromatography.Biome Chromatogr., 2007,21: 1291-1296

2. Wang CZ, Wang LL, Geng XD. Renaturation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor produced from Escherichia coli using size exclusion chromatography, J Liquid Chromatogr. & Related Tech., 2006, 29:203-217

3. Wang CZ, Wang LL, Geng XD. High recovery refolding of rhG-CSF from escherichia coli using urea gradient size exclusion chromatography. Biotechnol.Progr., 2008, 24(1): 209-213

4. Clark ED.Protein refolding for industrial processes. Curr Opin Biotechnol. 2001; 12(2):202-207.

5. Singh SM, Panda AK. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng, 2005, 99(4): 303-310.

6. Geng XD, Wang CZ. Protein folding liquid chromatography and its recent developments. J Chromatogr B, 2007, 849: 69-80.

7. Geng XD, Wang LL. Liquid chromatography of recombinant proteins and protein drugs. J Chromatogr B, 2008, 866: 133-153.

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实验五

《化学生物学》实验课程组 李剑利