第一章 微生物常规鉴定技术

一、接种、分离纯化和培养技术二、形态结构和培养特性观察 三、生理生化试验 四、血清学检验

第一节 微生物检验基本知识 一 接种 　将微生物接到适于它生长繁殖的人工

培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

　

１ 接种工具和方法

　接种和分离工具1 ．接种针 2. 接种环 3. 接种钩 4.5. 玻璃涂棒 6. 接种圈 7. 接种锄 8. 小解剖刀

常用的接种方法有以下几种： １）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回

直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。

２）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。

３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。

４）浇混接种 又称混菌法或倾注法，该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至 45°C 左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。

５）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。

６）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物钟，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。

　　

７）注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。

８）活体接种 活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。

２ 无菌操作 　　培养基经高压灭菌后，用经过灭菌

的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌 (2) 开启棉塞 (3)管口灭菌 (4) 挑起菌苔 (5)接种 (6) 塞好

棉塞

二 分离纯化 含有一种以上的微生物培养物称为混

和培养物（ Mixed culture ）。 如果在一个菌落中所有细胞均来自于

一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（ Pure culture ）。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。

1 稀释平板法（倾注法和涂布法）

2 划线法

1. 斜线法 2.曲线法 3. 方格法 4. 放射法 5.四格法

3 富集培养法 　富集培养法的方法和原理非常简单。我们可

以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。

4 厌氧法 石蜡法： 厌氧培养箱法 : 亨盖特滚管法：

三 培养 1 、根据培养时是否需要氧气，可分为好

氧培养和厌氧培养两大类。 ２、根据培养基的物理状态，可分为固

体培养和液体培养两大类。

第二节 微生物常规鉴定技术 一 形态结构和培养特性观

察 １、微生物的形态结构观

察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（ colony ）。

１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。

２）霉菌和酵母菌的培养特征：

大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。

霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。

二 生理生化试验

　　微生物生化反应：指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

１ 糖酵解试验 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。

试验方法： 以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置 36±1.0°C 培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。

本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和 An-drade 指示剂。

２ 淀粉水解试验

　　某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

试验方法： 以 18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于 36±1°C 培养 24~48h，或于 20° 培养 5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。

　　 注意：淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和 pH等均有一定关系。培养基 pH必须为中性或微酸性，以 pH7.2 最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

３甲基红（Methyl Red MR ）试验与 V-P(Voger—Proskauer ) 试验 1)．培养基：缓冲葡萄糖蛋白胨水 磷酸氢二钾 5克 多胨 7克 葡萄糖 5克 蒸馏水 1000毫升 pH 7.0 溶化后校正pH，分装小试管，每管 l毫升，高压灭菌 12l ℃15 分钟。 2)．试剂： ① 甲基红试剂：甲基红 0.1克， 95％酒精 300毫升，蒸馏水 20

0毫升。 先将甲基红溶于酒精中，然后加入蒸馏水。 ②6％ a一萘酚酒精溶液， 40％氢氧化钾溶液 3)．试验 自琼脂斜面挑取少量培养物接种于缓冲葡萄塘蛋白胨水中， 36士 l℃

培养 2～ 4天，哈夫尼亚菌则应在 22～ 25℃中培养，进行结果检查。

　

4) 甲基红（Methyl Red MR ）试验与V-P(Voger—Proskauer ) 试验结果检查

甲基红 (MR) 试验 某些微生物如大肠杆菌，志贺氏菌、产气杆

菌等，在糖代谢过程中产生丙酮酸，丙酮酸再进一步分解生成乙酸、乳酸、琥珀酸等。酸类增加愈多，则培养基中的 pH值愈下降，当降至 pH4.5 以下时，甲基红指示剂呈红色，即为阳性反应，如 pH值高于 4.5 则培养物呈黄色，即阴性反应。因此，在培养物中加入一滴甲基红试剂，立即可观察上述结果。

V—P(Voger—Proskauer) 试验

（丙酮酸） （乙酰甲基甲醇）

（二乙酰）

2CH3COCOOH CH3COCHOHCH3+2CO2

CH3COCHOHCH3

-2H

-2HCH3COCOCH3

（胍） （红色化合物）

4 靛基质试验

（色氨酸） （靛基质）

某些微生物如大肠杆菌、变形杆菌、霍乱弧菌等含有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸，产生靛基质 (indolo) 。当它与对二甲氨基苯甲醛 (P—dimethyl aminobenaldehyde) 作用，形成玫瑰靛基质 (rosindole)而呈红色。

试验方法： 试剂： L一色氨酸 0.1克 0.01M pH6.8磷酸缓冲盐水 100毫升 贮存于 4℃

方法：在上述试剂中加入大量纯培养菌，使成悬液，置 36士 l℃水浴中 l小时，然后滴加对二甲基氨基苯甲醛液，观察结果。

结果：阳性者在液面呈粉红色至玫瑰红色。

5 硫化氢试验 某些微生物 (如沙门氏菌、变形杆菌等 )能分

解蛋白质中的含硫氨基酸 (如胱氨酸、半胱氨酸等 ) 产生硫化氢，硫化氢遇到铅盐或铁盐，则发生作用而生成黑色的硫化铅或硫化铁。

COOHCHNH2CH2S·SCH2NH2COOH+4H2→2H2S+2NH3+2CH3COOH+2HCOOH

H2S+Pb(CH3COO)2→PbS ↓+2CH3COOH (硫化氢 ) (醋酸铅 ) 硫化铅 (黑色沉淀 ) 培养基配制及试验方法见 GB4789.28 中 2.14

(微量快速法 )： 试剂：盐酸半胱氨酸 O.1克 O.02MpH7.0磷酸缓冲盐水 100毫升 贮存于 4℃

方法：取上述试剂 O.4毫升，挑取一环纯培养物，制成悬液，于管口棉塞间夹一条醋酸铅试纸 (不可接触试剂 )，于 36士 l ℃中每 15 分钟观察一次，直至 l小时结束。

结果：试纸条呈棕色至黑色为阳性。

6 尿素酶试验 有些微生物含有尿素酶，能分解培养基

中的尿素产生氨，使培养基变成碱性。酚红指示剂变为红色。

培养基配制及试验方法见 GB4789.28 中 2.15 (微量快速法 )： 试剂：尿素 10克 0.2M pH6.5磷酸缓冲液 100毫升 0.4％酚红液 取 10％尿素液 100毫升 ,加入 0.4 ％酚红液 0.6毫升 ,

于 4 ℃保存 ,试剂的颜色为黄色，如变成淡红色，说明尿素已被分解，不宜使用。

方法：取一灭菌试管。加入上述试剂 0.2毫升，再加入一环纯培养体，于 36士 l℃培养 10~30分钟观察结果。

结果：呈淡红色为阳性。

7 硝酸盐还原试验

某些微生物如沙门氏菌能使硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性环境下，亚硝酸盐可与氨基苯磺酸结合成重氮盐，若再遇 a一萘胺可形成红色偶氮化合物。培养基及试剂的配制 ,试验方法及结果观察见 GB4789.28—2003.2.17

试剂；硝酸钠 0.05克溶于 0.025 M pH6.8 磷酸缓冲液中，于 4℃保存。

方法：取试剂 0.2毫升装一支小试管内，取一环纯培养物，制成悬液，置 36士 l℃培养 1 小时，然后加入甲液和乙液各0.2毫升，立即观察结果。

结果：阳性者呈红色。

8 过氧化氢酶试验 某些微生物能产生过氧化氢酶，将过氧化氢分

解而放出氧气。 过氧化氢酶 2H2O2 一一→ 2H20+02↑( 气泡 ) 多数需氧或兼性厌氧微生物皆能产生过氧化氢酶，而一般厌氧微生物不产生此酶．

试剂： 3％过氧化氢溶液 方法：取一环纯培养体置于洁净的小试管内，滴加 3％过氧化氢液 2毫升， 30秒钟内产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。

9 氧化酶试验 具有氧化酶的微生物，可使盐酸二甲基对苯二胺脱氢，氧化成有色的醌类化合物，

试剂配制及实验方法见 GB4789.28--2003 ． 2.18

10 三糖铁（ TSI）琼脂试验 　　试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落

或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置 36±1℃培养 18~24h，观察结果。

　　本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

提问：志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生 H2S。应该产生什么现象？

　　　大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生 H2S。应该是什么现象？

　　　沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生 H2S，多数产气。

下面照片所示 2-3-4 ，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌？

三、血清学试验 血清学检验是报据抗原与抗体在体外发生特异性结合，并在一定条件下出现各种抗原一抗体反应的现象，如凝集反应、沉淀反应等。因抗体存在于血清等体液中，在试验中一般采用血清，故而又称为“血清学反应”。血清学反应可用已知抗原检测未知抗体，也可以用已知抗体检测未知抗原，这一技术常用来对某些病原菌进行鉴定，以及对某些疾病作早期诊断，在食品卫生微生物学检验工作中，血清学检验也是一项很重要的检验方法。

(一 )血清学反应的基本特点

1 ．高度的特异性和交叉性 2 ．可逆性 3 ．需要合适的浓度比抗原与抗体的结合，两者之间需要适当比例，才能结合成大的分子集团沉淀下降成可见的反应现象。

4 ．两阶段性

( 二 )影响血清学反应的主要因素 1 ．电解质 一般用 0． 85％的氯化钠溶液作为抗原

和抗体的稀释液，如无电解质存在，则不出现可见反应。

2 ． pH值 适合的 pH值是抗原抗体反应的必要条件之一，大多数血清学反应的适宜pH值为 6～ 8 。 pH值过高或过低可直接影响抗原、抗体的理化性质，如pH值降至 3 时，因接近细菌的等电点，引起非特异性的酸凝集，造成假象，影响血清学反应的可靠性。

3 ．温度 一般常在 37℃左右进行试验。 4 ．杂质异物 反应中如存在与反应无关的蛋白质、类脂、多糖等非特异性物质时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应。

( 三 ) 常用的血清学检验方法 1 凝集反应 2 沉淀反应 3 免疫荧光标记技术 4 补体结合反应 5 中和反应