硕 士 研 究 生

开题报告

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开题报告

人鼻咽癌细胞系人鼻咽癌细胞系 CNE-2ZCNE-2Z 内存有肿内存有肿瘤干细胞的证据及其特异性标志物瘤干细胞的证据及其特异性标志物

的鉴定的鉴定

硕士研究生开题报告硕士研究生开题报告

研究生 ：邵世宏

导 师：姚运红 副 教授

时 间： 2004 年 10 月 22号

硕士研究生开题报告

立题依据立题依据第一部分第一部分

干细胞、肿瘤干细胞概念及研究干细胞、肿瘤干细胞概念及研究现状现状

干细胞 一类具有自我更新能力和多向分化潜能的早期未分化细胞，存在于正常组织中 , 可分为胚胎干细胞和成体干细胞

•胚胎干细胞

来自于胚胎发育桑葚期的内细胞团，可以分化成各种人体细胞、组织和器官。

•成体干细胞

持续停留在某种组织内，具有自我更新能力，能够分化产生本系统内所有类型成熟细胞，并具有可塑性。

肿瘤干细胞

存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉。

•人们已经成功的从急性淋巴细胞白血病、乳腺癌及脑肿瘤患者组织中分离出各自的干细胞，并确定了其表面特异性标志物。

研究现状

•成体干细胞具有可塑性，其移植治疗是目前研究的热点

干细胞和肿瘤细胞的相似点

1. 都具有自我更新和无限增殖的能力，区别在于：干细胞更新增殖具有自稳定性，而瘤细胞则无；

2. 一些相似的信号通路参与干细胞和肿瘤细胞的自我更新，如 Wnt 、 Notch和 Sonic hedgehog(shh)信号转导系统；

3. 都具有很高的端粒酶活性 ；

4. 形态学上都比较幼稚，胞核大，胞浆少，可见核分裂相，不同的是：瘤细胞多为病理性核分裂相，而干细胞则是正常的核分裂相；

干细胞、肿瘤干细胞、肿瘤细胞三者之间的联系

正常干细胞的增殖与分化

胚胎起源细胞（受精卵）

分化，增殖

胚胎干细胞

自我更新

成体干细胞自我更

新

分化成熟

成熟终末细胞，增殖能力有限，无自我更新能力

内在性状的改变

三者间的关系

增殖能力受限的祖细胞

正常干细胞

自我更新

恶性肿瘤前干细胞

肿瘤干细胞

自我更新

自我更新

突变或生存微环境的改变获得自我更新能力

克隆演进，进一步恶化

分化受限，成熟受阻

已分化的癌细胞失去自我更新能力，只有有限的增殖能力

• 肿瘤很可能是干细胞在长期的自我更新过程中由于多基因突变导致干细胞生长失去调控，而停止在分化的某一阶段无限增殖所形成的异常的组织或器官。

以上资料表明：

•肿瘤组织中存在着一类具有干细胞性质的细胞，具有自我更新、无限增殖分化和转移成瘤能力，我们称之为肿瘤干细胞。

•肿瘤是一种干细胞疾病

我们认为在鼻咽癌组织内也存在着肿瘤干细胞，其增殖分化驱动了鼻咽癌的发生发展、转移复发和鼻咽癌细胞的异质性。

因此，在鼻咽癌细胞系 CNE-2Z内也存在着肿瘤干细胞。

以前的实验数据证明：人鼻咽癌细胞系CNE-2Z为异质性群体，其中含有不同增殖能力和转移能力的肿瘤细胞；

CD44、 P53、 EGFR、 β-catenin 、 Survivin 、 E－cadherin

鼻咽癌干细胞生物学标志物？

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实验目的实验目的第二部分第二部分

1. 检测人鼻咽癌、淋巴结转移性鼻咽癌组织及鼻咽炎组织内CD44 、 P53 、 EGFR 、 β-catenin 、 Survivin 、 E-cadherin基因及蛋白表达水平。

2. 在鼻咽癌细胞系 CNE-2Z中分离表达与干细胞生长及鼻咽癌转移密切相关的生物学标记物（ CD44、 P53、 EGFR、 β-catenin、 Survivin、 E-cadherin）的癌细胞并计数，观察其在裸鼠体内的成瘤率。

3. 结合不同标记物的鼻咽癌细胞成瘤的细胞数，分离联合标记的鼻咽癌细胞，观察其在裸鼠体内的成瘤率，确定比较可靠的鼻咽癌内干细胞表面生物学标记物；

第三部分第三部分

技术路线技术路线

人鼻咽癌活检组织、淋巴结转移性鼻咽癌组织及鼻咽炎组织

组织切片

RT-PCR 、 IHC 、 ISH 、 Western-blotCD44 、 P53 、 EGFR 、 β-catenin 、 Survivin E-cadherin

分析比较其差异性

基因及蛋白表达

人鼻咽癌细胞系 CNE-2Z

HE染色

人鼻咽癌细胞系 CNE-2Z

分离不同标记的鼻咽癌细胞并计数，不同标志不同细胞数接种裸鼠，观察成瘤率

用最少细胞数成瘤的标记物，分离联合标记的鼻咽癌细胞不同细胞数接种裸鼠，观察成瘤率

确定鼻咽癌干细胞特异性标志物

主要实验方法 ISH IHC﹑ ﹑

- 检测人鼻咽炎及鼻咽癌组织CD44、 P53、 EGFR、 β-catenin、 Survivin E-cadherin蛋白表达及 mRNA的分布

主要实验方法 RT-PCR、 Western-bot、 IHC

-检测鼻咽癌细胞系 CNE-2Z内CD44、 P53、 EGFR、 β-catenin、 Survivin、 E-cadherin基因及蛋白表达水平

主要实验方法

荧光标记流式细胞仪 －分离不同标记CD44、 P53、 EGFR、 β-catenin、 E-cadherin的鼻咽癌细胞并计数

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预期结果预期结果第四部分第四部分

1. 鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞系 CNE-2Z内高表达 CD44、 P53、 EGFR、 β-catenin、 Survivin、而 E-cadherin为低表达；与鼻咽炎组织对比有显著性差异。

2. 不同标记的癌细胞在裸鼠体内成瘤率不同，有的没有成瘤能力。

3. 联合标记的癌细胞占有极少的比例，极少量的这种细胞就能在裸鼠体内稳定成瘤。

4. 分离出来的癌细胞应该具备自我更新和分化成不同阶段癌细胞的能力，经培养后形成异质性细胞群体。

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经费预算经费预算第五部分第五部分

编号 项目 经费

(元 )

1 细胞培养基本材料及裸鼠 8000.00

2 ISH试剂盒 4000.00

3 IHC、荧光标记流式细胞仪试剂盒及基本材料

9000.00

4 RT-PCR 、 Western blot 4000.00

合计： 25000.00

具体花费视实验情况决定

时间安排 2004 、 11～ 2005、 2完成临床资料的收集及实验，鼻咽癌细胞系 CNE-2Z的复苏培养及裸鼠养殖前的准备工作；

2005、 3 ～ 2006、 3 完成鼻咽癌细胞体外实验及裸鼠体内试验，分离培养鼻咽癌干细胞，观察其生物学性质；

2006、 4～ 2006、 5 撰写毕业论文，准备答辩