第二十一章 第二十一章 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗

第一节 基因诊断

疾病的根本原因 : 疾病的各种表型的改变 是基因的改变造成的

基因诊断 : 采用分子生物学的技术方法来分析受检

者的某一特定基因的结构 (DNA 水平 ) 或功能 (RNA 水平 ) 是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。

一、基因诊断 (Genetic Diagnosis) 的含义

二、基因诊断的原理和方法

1 、基因诊断的原理： DNA 诊断 ---- 检测相关基因的机构及其

表 达功能特别是 RNA 产物是否正常。 RNA 诊断 ---- 对表达产物 mRNA 质和量

表 化的分析。

1 、基因诊断的方法 核酸分子杂交技术 聚合酶链反应 (PCR) 基因测序 基因芯片

（ 1 ） DNA 诊断 斑点杂交 等位基因特异寡核苷酸探针 (allele specific oligonucleotide, ASO) PCR/ 单链构象多态性分析（ SSCP ） (single strand conformation polymorphism, SSCP) 限制性内切酶谱分析法 DNA 限制性长度多态性 (restriction fragment length polymorphism, RLFP) 分

析

PCR/ 单链构象多态性分析（ SSCP ）

PCR 产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，

正常基因和变异基因的迁移位置不同，可分析确定致病基因的存在。

×

MstⅡ酶切位点 (GCTNAGG)

5´ 3´

正常基因

5´ 3´

突变基因

1.15kb

1.35kb

镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析

++

﹣﹣

0.2kb

1.15kb

1.35kb

正常人 突变携带着 患者

镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析

（ 2 ） RNA 诊断 RNA 印迹（ Northen blot ） 是检测基因是否表达、表达产物 mRN

A 的大小及基因表达的效率。 RT-PCR

三、基因诊断的应用1 、遗传疾病2 、感染性疾病（ 1 ）病毒性感染（ 2 ）细菌性感染（ 3 ）寄生虫（ 4 ）其他

3 、恶性肿瘤4 、法医学中的应用（ 1 ） DNA 指纹分析（ DNA fingerprinti

ng ）（ 2 ）短串联重复多态性分析　　（ short tandem repeat ， STR ）

遗传性疾病 ----DMD的分子诊断

遗传性疾病 ----DMD的分子诊断

X 染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病 , 发病率 为 1/3 500 个男孩 DMD 基因位于 Xp21.2-21.3 ，全长 2500Kb

DMD 基因的突变导致 dystrophin 缺陷 检测 DMD 基因的技术： Southern 印迹、多重 PCR

DMD 的基因检测 迪谢内肌营养不良 (DMD) 是一种高发病 率、高致残、高致死的 X 染色体连锁的遗 传性疾病，在 2500 个活产男婴中即有一 个患者。 致病基因 DMD 的全长为 250kb ，有 79 个外 显子。 DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失， 约占 60%~70% 。

DMD 基因外显子缺失的检测

感染性疾病的分子诊断

感染性疾病的分子诊断

定性或定量检测致病微生物的核酸， 已经用于病毒、细菌和寄生虫感染 的诊断。 动态、定量地检测病原体核酸能对 疗效判断和病情预后提供客观的依 据。

SARS相关冠状病毒的分子诊断

SARS 相关冠状病毒的分子诊断

2003 年 4月，香港研究者 Peiris 等报

告了 50 例 SARS 病人的临床表现和

病毒学研究结果证明，新冠状病毒

可能是 SARS 的致病原因。

（ Lancet, 2003, 361: 9365) 其它实验室陆续得出相同结论。

2003年 4月，德国汉堡 Bernhard-

Nocht热带医学研究所学者 Drosten

等用随机扩增技术，获得长度为 300 bp 的核苷酸序列。 根据这段序列，建立了检测新冠状 病毒的常规和实时定量 PCR 技术。

（ www.nejm.com.org on April 10, 2003 ）

引物和探针

BNIoutS2--BNIoutAs

BNI-1 片段， 189 bp

BNIinS--BNIinAs

BNI-1 片段的内套片段， 108bp BNITMSARS1—BNITMSARAs2

BNITMSARP(荧光素标记的探针） 产物长度： 77 bp

检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺 泡灌洗液 、血浆、粪便。 检测方法 1. 逆转录 -巢式 PCR

2. 逆转录 -实时 PCR

结 果

病人和接触者（具临床症状）的痰

液中用外套引物检测到了病毒。 病人的其它标本用套式 PCR 检测到 病毒。

有报道显示，在可能 SARS 病人 中， 病毒的检出率为 100% 。 在疑似 SARS 病人中的检出率为 23% 。 所有健康接触者中未检测到病毒。

检测病毒的 3 种方 法（血清学检测、 病毒分离、 PCR 技术）中， PCR 技 术的检出率最高。

讨 论 疾病的早期即可获得阳性结果（早 于血清转换期）。 特异性较高（ SARS 患者中的阳性 率约为 80% ，对照中的阴性率约为 98%~100% ）。 现有的方法敏感性较差，阴性结果 不能排除病毒感染。

讨 论 痰液中病毒 RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道 排放是主要传播途径。 血清中检测到极低浓度的病毒 RNA ，提示病毒 复制不仅发生于呼吸道。 病人恢复晚期的粪便中存在病毒 RNA ，说明粪 便可能也是一种传播途径。 鼻、咽拭子中含有的病毒 RNA 显著少于痰液， 提示不适合作为标本（有可能漏检）。

SARS 相关冠状病毒分子诊断中必须注意的问题

必须在规范的基因扩增实验室中进行。 应采取必要的质控规程，包括阳性对照 和阴性对照。 阳性结果时必须对原始样本重复检验或 者扩增基因的另一个片段或在另一个实 验室对同一样本进行检测。

其他感染性疾病的诊断

HBV 病毒 HIV 病毒

PCR 技术在细菌性食物中毒中的应用

简介细菌性细菌性食物中毒具有下列特点：食物中毒具有下列特点： 与饮食有密切关系与饮食有密切关系，患者只局限在食用过同 一种食，患者只局限在食用过同 一种食

物的人群中，去掉原因食品后，不再有新患者；物的人群中，去掉原因食品后，不再有新患者； 临床症状以急性胃肠炎为主要表现临床症状以急性胃肠炎为主要表现，症状基本相同；，症状基本相同； 短时间内有多人发病短时间内有多人发病；； 无人传染人的现象无人传染人的现象；； 有一定的地区性有一定的地区性，主要与人们膳食习惯有关；，主要与人们膳食习惯有关； 有明显的季节性，有明显的季节性，主要发生在夏秋季节，气温高细菌易主要发生在夏秋季节，气温高细菌易

于繁殖和产生毒素；于繁殖和产生毒素； 从病人与食物中从病人与食物中可分离出相同的病原菌可分离出相同的病原菌。。

简介

细菌性食物中毒细菌性食物中毒 感染型食物中毒感染型食物中毒：由于细菌污染食物后在其中 ：由于细菌污染食物后在其中 大量繁殖，人大量繁殖，人食入了含有大量活菌食入了含有大量活菌的食物 的食物 后，引起消化道感染而造成的中毒，后，引起消化道感染而造成的中毒，如沙如沙 门氏菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、链球门氏菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、链球 菌等。菌等。 毒素型食物中毒毒素型食物中毒：由于：由于细菌污染食物细菌污染食物后在其中后在其中 繁殖并繁殖并产生大量毒素产生大量毒素，人食入含有大量毒，人食入含有大量毒 素的食物后引起的中毒，素的食物后引起的中毒，如肉毒中毒如肉毒中毒。。

样品采集 剩余食物剩余食物 炊事用具炊事用具 呕吐物呕吐物 粪便粪便 外环境样品外环境样品

常规检验程序 (1-2 星期 ) 直接涂片、染色、镜检直接涂片、染色、镜检 活菌数测定（少数菌）活菌数测定（少数菌） 选择适当的增菌选择适当的增菌 鉴别培养基进行分离培养鉴别培养基进行分离培养 生化鉴定生化鉴定 血清学试验血清学试验 毒素测定毒素测定

常见的致食物中毒的细菌 沙门菌沙门菌 志贺菌志贺菌 O157O157 副溶血性弧菌副溶血性弧菌 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌 霍乱弧菌霍乱弧菌

单核利斯特菌单核利斯特菌 化脓性链球菌化脓性链球菌 小肠结肠耶尔森氏菌小肠结肠耶尔森氏菌 变形杆菌变形杆菌 空肠弯曲菌空肠弯曲菌 产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌 致腹泻性大肠杆菌致腹泻性大肠杆菌

样品样品 增菌增菌

直接处理直接处理

选择性培养 选择性培养 基增菌 基增菌

DNADNA提取提取

PCRPCR

PCR 快速检测致食物中毒的细菌

MM

肿瘤相关基因的检测

肿瘤相关基因的检测

肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关 基因）发生突变而导致的疾病。 肿瘤相关基因的突变只是增加了 个体对肿瘤的易感性而并不一定 马上产生肿瘤， 肿瘤的发生是一个多因素、多步骤 的过程。

生物芯片技术在今后的肿瘤发病机制研

究和肿瘤的诊断等方面将发挥越来越显

著的作用

P53导致肿瘤发生的 机制

Total RNA from HeLa or NCI-H23 cells were reverse-transcribed into cDNAs in the presence of Biotin-dUTP. The biotin-labeled cDNA probes were then hybridize

d individually to the Human TranSignal p53 Target Gene Array.

p53 Target Gene Array

法医学上的应用

个人认识亲子鉴定性别鉴定

第二节 基因治疗

一、基因治疗的概念1 、基因治疗的定义： 从基因角度： 对缺陷的基因进行修复 将正常有功能的基因置换 增补缺陷基因

从治疗角度 导入基因以改变患者细胞的基因表达

导入基因： 缺陷基因相对应的有功能的同源基因 缺陷基因无关的治疗基因

基因治疗的两种形式 体细胞基因治疗

种系基因治疗

只限于某一体细胞的基因的改变

只限于某个体的当代

对缺陷的生殖细胞进行矫正

当代及子代

2 、基因治疗的方式 基因矫正或置换 基因增补 基因封闭 其他

3 、导入的方式 体外导入（ ex vivo ）

体外将基因导入细胞内

再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内

使这种带外源基因的细胞在体内表达

达到治疗或预防的目的

体内导入（ in vivo ）外源基因直接导入体内有关的组织细胞

使其进入相应的细胞

并表达

基因治疗的基本程序治疗性基因的选择基因载体的选择

靶细胞的选择

基因转移

外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因回输体内

病毒载体非病毒载体体细胞生殖细胞间接体内疗法直接体内疗法

二、治疗的基因的选择 目前临床试验的治疗基因： 合适的能达到治疗 / 预防的目的基因的 cDNA ( 表 21-1)

目的基因的 cDNA 的获得 cDNA文库中目的基因的克隆 人工合成基因片段 PCR 法筛选扩增目的基因

三、载体系统 --运送基因的工具 病毒载体

非病毒载体

逆转录病毒载体 腺病毒 腺相关病毒 其他

脂质体 裸 DNA

逆转录病毒载体

逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期进入宿主细胞进入宿主细胞 双链双链 RNARNA 逆转录酶逆转录酶 双链双链 DNADNA前病毒前病毒 整合到宿主细胞基因组整合到宿主细胞基因组 DNADNA 中中 宿主细胞宿主细胞 RNARNA聚合酶聚合酶 IIII mRNAmRNA 病毒病毒 RNARNA 基因组基因组 作为合成相应 作为合成相应 病毒蛋白质病毒蛋白质的模板的模板

包装成包装成新的病毒颗粒新的病毒颗粒，离开宿主，离开宿主

LTRLTR gaggag polpol envenvφφ LTRLTR

长末端长末端重复序列重复序列

调节和调节和启动转录启动转录 产生病毒产生病毒

核心蛋白核心蛋白产生产生

逆转录酶逆转录酶产生病毒产生病毒外膜蛋白外膜蛋白

包装信号包装信号

DNADNA前病毒的结构特征前病毒的结构特征

逆转录病毒载体的构建 常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒 (MoMLV) 构建的各类逆转录病毒载体

LTRLTR gaggag polpol envenvφφ LTRLTR

长末端长末端重复序列重复序列

调节和调节和启动转录启动转录

包装信号包装信号

目的基因 标记基因

LTRLTR gaggag polpol envenv LTRLTR

GagGag 蛋白蛋白PoLPoL 蛋白蛋白

EnvEnv 蛋白蛋白包装细胞系包装细胞系

LTRLTR LTRLTR

靶细胞靶细胞

目的基因 标记基因

LTRLTR φφ LTRLTR目的基因 标记基因

1

2

3 4

5

假病毒颗粒的产生并感染靶细胞

逆转录病毒载体 重组逆转录病毒( 核酸部分只能是逆转录病

毒载体 )

辅病毒

四、基因治疗的临床试验

当前基因治疗试验： 治疗性试验 基因标记 非治疗性试验

治疗性试验

1 、基因标记2 、单基因疾病3 、恶性肿瘤（ 1 ）免疫基因治疗（ 2 ）自杀基因系统（ 3 ）抑癌基因（ 4 ）裂解肿瘤病毒4 、病毒性感染5、心血管疾病

遗传性单基因疾病

腺苷脱氨酶 (ADA) 缺乏的严重联合免疫缺陷 (SCID)

腺苷脱氨酶 (ADA) 缺乏的严重联合免疫缺陷 (SCID)

病因 : 淋巴细胞缺乏 ADA

酶

腺苷、 dATP堆积

破坏免疫功能

患儿很少活到成年

第一个基因临床治疗的方案 (1990.9.14,NIH) 治疗策略： 淋巴细胞 ADA 酶

恢复至正常水平的 5%-10%

维持免疫系统功能

改善病人症状

治疗基本步骤 :

ADA 基因 + 逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞

体外扩增回输病人体内

淋巴细胞 ADA 酶恢复至正常水平的 5%-10% 维持免疫系统功能 , 改善病人症状

恶性肿瘤的免疫基因治疗

基因工程“瘤苗”

基因工程“瘤苗” 策略：将刺激免疫反应的细胞因子基因 (IL-2/IL-12/IFN-γ)

转导肿瘤细胞，提高肿瘤细胞的免疫原性

转导细胞因子基因的肿瘤细胞在体内持续分泌细胞因子

增强抗肿瘤的免疫反应，形成局部的抗肿瘤免疫微环境

引发全身的抗肿瘤免疫机能

LTRLTR gaggag polpol envenv LTRLTR

GagGag 蛋白蛋白PoLPoL 蛋白蛋白

EnvEnv 蛋白蛋白包装细胞系包装细胞系 NIH313NIH313

LTRLTR LTRLTR

靶细胞靶细胞

IL-2 标记基因

LTRLTR φφ LTRLTRIL-2 标记基因

1

2

3 4

5

假病毒颗粒的产生并感染靶细胞

逆转录病毒载体 重组逆转录病毒( 核酸部分只能是重组逆转

录病毒载体 )

辅病毒

问题与展望

进一步寻找切实有效的基因 精密调控外源基因在人体内的表达 体细胞移植和重建的生物学研究 减少外源基因对机体的不利影响