Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа

микробного загрязнения

Федеральное государственное автономное образовательное учреждениевысшего профессионального образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Кафедра биофизики

Кириллова Мария Александровна

Руководитель: к.б.н. Есимбекова Е. Н.

Красноярск 2012

Микробная загрязненность - показатель санитарного качества продуктов питания, воды,

чистоты поверхностей

Методы определения микробного загрязнения:

1. Микробиологические2. Биолюминесцентный метод,

основанный на измерении АТP3. Биолюминесцентный метод,

основанный на измерении FMN

2

http://biotest-by.com/

Цель

• Разработать метод анализа микробного загрязнения с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий, основанный на определении количества FMN в образце.

3

Материалы и методыРеакционная смесь

• 0,05 М фосфатный буфер• комплекс ферментов

люцифераза - оксидоредуктаза• 0,0025% тетрадеканаль• 5*10-5 ÷10-3 М NADH• 5*10-8÷10-6 М FMN

Исследуемый объект

• Escherichia Coli (BL21 codon Plus (DE3) RIPL), выращенные в лаборатории Фотобиологии ИБФ СО РАН на среде LB без антибиотиков в течение 18 часов при 30ºС.

• Образцы бактерий исследовали в стационарной фазе роста.

• Оптическая плотность при λ=590 нм D=6,4; 1 ед.опт.пл.=5*108 клеток/мл

4Люминометр Lumat LB9507

h

NADH:FMN-oxidoreductase (R)

NAD(P)H + H+ + FMN NAD(P)+ + FMNH2

Luciferase (L)

FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2О + h

Колонии E. coli

Калибровочная кривая для определения FMN

Максимальная чувствительность биферментной системы 1,2*10-9 М FMN 5

Анализируемые образцы Escherichia Coli (штамм BL21)

Образец №1. Интактные клеткиОбразец №2. Клетки, разрушенные

ультразвуковым дезинтегратором при частоте 44 кГц

Образец №3. Надосадочная жидкость после

центрифугирования разрушенных клеток (5000 об/сек, 12 мин)

6

Зависимость интенсивности свечения от количества бактериальных клеток (образец 2)

Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы составляет 3,9 млн. бактериальных клеток

7

Зависимость интенсивности свечения от количества бактериальных клеток (образец 3)

Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы составляет 5 млн. бактериальных клеток

8

Сравнение с АТР-системой

Система светлячков

• Предел обнаружения АТР – 10 -14 М.

• Предел обнаружения бактериальных клеток – 1000 кл / мл

Бактериальная система

• Предел обнаружения ФМН -1,2 ·10 -9 М

• Предел обнаружения бактериальных клеток – 3,9 млн. кл /мл

9

Санитарные правила и нормыГруппа продуктов Количество бактерий, КОЕ/г не

болееВода минеральная 100

Молоко 3*105

Мясо 103

Рыба свежая 5*104

Овощи 104– 5*105

Пиво 500

Мороженное 105

Масло сливочное 103 - 105

10

Выводы

• Для анализа бактериальной загрязненности образец достаточно подвергнуть разрушению ультразвуковым дезинтегратором

• Предел обнаружения бактериальных клеток –3,9 млн. кл /мл

• Чувствительность метода ниже чувствительности АТР-системы на 3 порядка

11

Перспективы • Возможна разработка биолюминесцентного метода

анализа бактериальной загрязненности, основанного на измерении NADH

• Предварительно полученные результаты указывают на высокую чувствительность биолюминесцентного метода к NADH (до 1·10-13 М), что сравнимо с чувствительностью люциферазы светляков к АТФ

• В дальнейшем планируется для упрощения процедуры проведения анализа разработка иммобилизованного ферментного препарата

12