Масс спектрометрия

12
1 Масс спектрометрия Масс спектрометрия или Масс спектроскопия Абсолютная и относительная масса 12C = 12.000000 Молекулярная вес Мr (отн. ед) и Молекулярная масса (в Да) Ионы в электрическом и магнитном поле q + B o ut o f page In cre asing m ass + Io n so u rc e v F B B outof page M otion of particle zB r 2 2 acc mV где z –заряд иона, m – его масса, V acc - разница потенциалов приложенного электрического поля, r - радиус кривизны траектории иона, B - величина приложенного магнитного поля acc V r z m 2 2 2 B Легкие ионы будут иметь маленький радиус кривизны. Этот радиус будет увеличиваться с ростом массы иона и ускоряющего потенциала поля. Кинетическая энергия иона Е кин Сила Лоренца (электрическая ускоряющая сила) (отклоняющая магнитная сила)

Upload: erin-love

Post on 03-Jan-2016

61 views

Category:

Documents


3 download

DESCRIPTION

Масс спектрометрия. Масс спектрометрия или Масс спектроскопия. Абсолютная и относительная масса 12C = 12.000000. Молекулярная вес М r (отн. ед) и Молекулярная масса ( в Да). Ионы в электрическом и магнитном поле. - PowerPoint PPT Presentation

TRANSCRIPT

Page 1: Масс спектрометрия

1

Масс спектрометрияМасс спектрометрия

или

Масс спектроскопия

Абсолютная и

относительная масса12C = 12.000000

Молекулярная вес Мr (отн. ед)

и

Молекулярная масса (в Да)

Ионы в электрическом и магнитном поле

q+

B out o fpage

Increas ing m ass

+

Ion source

v

FBB out ofpage

Motion ofparticle

zBr

22 accmV

где z –заряд иона, m – его масса, Vacc- разница потенциалов приложенного электрического поля, r - радиус кривизны траектории

иона, B - величина приложенного магнитного поля

accV

r

z

m

2

22B

Легкие ионы будут иметь маленький радиус кривизны.

Этот радиус будет увеличиваться с ростом массы

иона и ускоряющего потенциала поля.

Кинетическая энергия иона Екин Сила Лоренца

(электрическая ускоряющая сила) (отклоняющая магнитная сила)

Page 2: Масс спектрометрия

2

Перенос ионов из раствора в газовую фазу требует большой энергии и не происходит самопроизвольно. Например, перенос иона Na+ требует 98 ккал/моль. Поэтому перенос десятков тысяч ионoв в газовую фазу из раствора в масс спектрометре требует очень большой затраты энергии

От ионов в растворе - к ионам в газовой фазе

Способы получения ионов

1) Удаление электронов из молекулы для получения позитивно заряженного катиона, который может быть ускорен либо увеличением отрицательного градиента или уменьшением позитивного градиента поля.

2) Добавление электрона к молекуле для получения отрицательно заряженного аниона. В этом случае знак ускоряющего напряжения противоположен знаку, требуемому для катиона.

3) Удалением или добавления протона. В этом случае результирующая масса будет отличаться на ±1 от массы исходного нейтрального иона.

Техника ионизации

Электронная ионизация

Ионизация полем

Бомбардировка быстрыми атомами

Плазменная ионизация

Лазерная ионизация с использованием матрицы

(MALDI)

Ионизация электрораспылением

(ESI)

Page 3: Масс спектрометрия

3

Лазерная ионизация с использованием матрицы (MALDI)

Laser pulse

A naly te m olecu le

UV - absorbing m atrix

(a) (b) (c)

Матрица – ключевой элемент техники.

Ее главная роль:

содержать хромофор, поглощающий лазерное излучение. Последнее не

должно затрагивать хромофоры исследуемой молекулы.

Матрица испаряясь переходит в газовую фазу, увлекая за собой

исследуемую молекулу.

Специфика лазерного излучения.

Два типа лазеров используются в технике MALDI:

Инфракрасный лазер, возбуждающий вибрационные моды и УФ - лазер, возбуждающий электронные переходы в молекуле. Длина импульса обычно составляет 100 нс или меньше. Большие длины импульсов обычно приводят к тепловому разложению образца.

Специфика масс- спектрометра

Поскольку большинство лазерных источников являются пульсирующими, то для регистрации используются такие методы как метод времени пролета или метода ионного циклотронного резонанса. Точность определения массы составляет ± 0.01% (±1 Da при молекулярной массе 10 кДa).

Page 4: Масс спектрометрия

4

Ионизация электрораспылением

1e - 1e mBar-7 -1 0

Nanoflow e lectrosprayionisation

Free jet expansionin the ion source

Disassem bly in thecollis ion cell

Mass analysis

Схематическое представление прохождения ионов от кончика иглы, содержащего раствор биологических макромолекул, до детектора масс спектрометра. Раствор белка (объем - 1-2 μл, концентрация - 5 μM) выходит из тонкого капилляра (внутренний диаметр около 10 μм). К концу капилляра, покрытого золотом, прикладывается высокое напряжение (обычно несколько кВ), вызывая распад капель на очень мелкие капли. Десольватация последних приводит к появлению облака молекул, которые детектируются масс спектрометром. Точность определения молекулярных масс составляет 0.001-0.005%.

Page 5: Масс спектрометрия

5

Инструменты и техника регистрации в масс спектрометрии

A

BSource Slit

Magnet

Collector Slit

ESA

-V + V cos tdc rf

+V + V cos tdc rf

Filament Electriclens

Top and bottomend cap electrodes

Ringelectrode

Electronmultiplier

Toamplifier

Electrongate

+

Time-domainsignal

FT

MassSpectrum

Transmitterplate

Trap plateB

Receiver plate

rf excite

Signalout

FourierTransform

FourierTransform

Time Frequency

-V + V cos tdc rf

+V + V cos tdc rf

+V + V cos tdc rf

-V + V cos tdc rf

QI

QII

S

D

RF only q (collection cell)

Single and double focusing mass spectrometers

Fourier transform mass spectrometry

Ion cyclotron resonance mass spectrometry

Quadrupole mass filter

Quadrupole ion trap

Triple mass filter

Page 6: Масс спектрометрия

6

Определение масс белков

ESI-FTIR масс спектр двух белков: цитохрома c и миоглобина лошади.

Концентрация образца 0.4 нM.

Общее количество белка около 135 зM (~ 80 000 молекул).

1 зепто моль = 10-21 моля

МАЛДИ спектр высокого разрешения белка [Arg8]-вазопресина.

Основной спектр 1084.446 относится к «моноизотопному» пику протонированного

белка.

Три пика более высокой массы относятся к вкраплению в белок изотопа 13C, доля

встречаемости которого в природе равна 1.108%.

1084.446

+1Da

+2Da

+3Da

Моноизотопная масса

horse cytochrome c

horse myoglobin [Arg8]-вазопресин

Page 7: Масс спектрометрия

7

Применяя формулу (А) для расчета молекулярной массы цитохрома c с использованием двух соседних пиков с = 952.3 и = 1031.3, получим для следующее значение:

Это означает, что 12 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой, равной 1031.3.Молекулярная масса в этом случае рассчитывается как М = n2 (m2 -1) и равна 12363.6.

Рассматривая следующие два пика с относительными массами = 884.3 и = 952.3, мы получим:

или Z = 13, т.е. 13 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой 952.3. Рассчитанная из этих пиков молекулярная масса равна 12366.9.

Молекулярная масса нейтральной молекулы M может быть найдена из значений регистрируемых масс m1 и m2

и (что эквивалентно значениям m/z) и числа добавленных зарядов или протонов n1 и n2 :

М = n2 (m2 - 1) (A)

где n1 = n2+1 и

n2 = (m1 -1) / (m2 - m1) Следовательно, M, можно рассчитать, если брать пики регистрируемых масс попарно.

04.123.9523.1031

3.9511

12

12

mm

mn

989.123.8843.952

3.8841

12

1

2

mm

mn

Цитохром с

Page 8: Масс спектрометрия

8

Сворачивание белков: конечные и промежуточные состоянияFolded Protein

Unfolded Protein

ESI - MS

ESI - MS

m/z

m/z

Цитохром c Апомиоглоин Кислая денатурация миоглобина

Различные pHРазличные моменты

времени

Page 9: Масс спектрометрия

9

20

Виртуальный двумерный форез

Вертикальная полоска: одномерный полиакриламидный гель, окрашенный.серебром. Каждый участок его дубликата ( не окрашенного серебром) анализируется масс

спектрометрией.

Page 10: Масс спектрометрия

10

Нуклеиновые кислоты и их комплексы с белками. Проблема: «любовь НК» к ионам.

Гистограмма средних масс образца ДНК. Доминантный пик 2.88 MДa соответствует Na-бактериальной ДНК плазмиде (pBR322), а меньший пик ее димеру (Benner, 1997).

Расчетное значение молекулярной массы 30S субьединицы равно 852187 ± 3918 Дa. Эта величина на 0.6% отличается от «точного значения», вычисленного из составляющих ее компонентов (16S РНК и белков).

5 мМ Мg

1 mM Mg

bacterial plasmid (pBR322)

Димер

Мономер

Page 11: Масс спектрометрия

11

peptides

peptides

Extract cellular proteins

Trypsin treatm ent

Liquid chromatograhyseparation

Mass Spectrometry

2D gel

charge

Trypsin treatment

Cell or tissue sample

Статический и динамический протеомы и масс-спектрометрия

Две стратегии анализа протеома методом масс спектрометрии (Godovach-Zimmermann and Brown, 2001).

Page 12: Масс спектрометрия

12

Формирование изображения с помощью масс спектрометрии

Методология пространственного анализа ткани методом MALDI-MS. Замороженные секции помещаются на металлической плате и покрываются UV- абсорбирующей матрицей. Затем они помещаются в масс-спектрометр и сканируются лазерным лучом. (Stoeckli et al., 2001, Nature Medcine, 7, p.494).

Масс спектрометрическое изображение замороженных секций ткани мозга мыши.

(а) Оптическое изображение замороженной секции на золотой подложке.

(b) Распределение белков с m/z = 8528 в области центральной коры головного мозга

(c) Тоже для m/z 6716 в области медиальных сучковатых ядер.

(d) Тоже для m/z 2564 в области среднего мозга.