Масс спектрометрия
DESCRIPTION
Масс спектрометрия. Масс спектрометрия или Масс спектроскопия. Абсолютная и относительная масса 12C = 12.000000. Молекулярная вес М r (отн. ед) и Молекулярная масса ( в Да). Ионы в электрическом и магнитном поле. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
1
Масс спектрометрияМасс спектрометрия
или
Масс спектроскопия
Абсолютная и
относительная масса12C = 12.000000
Молекулярная вес Мr (отн. ед)
и
Молекулярная масса (в Да)
Ионы в электрическом и магнитном поле
q+
B out o fpage
Increas ing m ass
+
Ion source
v
FBB out ofpage
Motion ofparticle
zBr
22 accmV
где z –заряд иона, m – его масса, Vacc- разница потенциалов приложенного электрического поля, r - радиус кривизны траектории
иона, B - величина приложенного магнитного поля
accV
r
z
m
2
22B
Легкие ионы будут иметь маленький радиус кривизны.
Этот радиус будет увеличиваться с ростом массы
иона и ускоряющего потенциала поля.
Кинетическая энергия иона Екин Сила Лоренца
(электрическая ускоряющая сила) (отклоняющая магнитная сила)
2
Перенос ионов из раствора в газовую фазу требует большой энергии и не происходит самопроизвольно. Например, перенос иона Na+ требует 98 ккал/моль. Поэтому перенос десятков тысяч ионoв в газовую фазу из раствора в масс спектрометре требует очень большой затраты энергии
От ионов в растворе - к ионам в газовой фазе
Способы получения ионов
1) Удаление электронов из молекулы для получения позитивно заряженного катиона, который может быть ускорен либо увеличением отрицательного градиента или уменьшением позитивного градиента поля.
2) Добавление электрона к молекуле для получения отрицательно заряженного аниона. В этом случае знак ускоряющего напряжения противоположен знаку, требуемому для катиона.
3) Удалением или добавления протона. В этом случае результирующая масса будет отличаться на ±1 от массы исходного нейтрального иона.
Техника ионизации
Электронная ионизация
Ионизация полем
Бомбардировка быстрыми атомами
Плазменная ионизация
Лазерная ионизация с использованием матрицы
(MALDI)
Ионизация электрораспылением
(ESI)
3
Лазерная ионизация с использованием матрицы (MALDI)
Laser pulse
A naly te m olecu le
UV - absorbing m atrix
(a) (b) (c)
Матрица – ключевой элемент техники.
Ее главная роль:
содержать хромофор, поглощающий лазерное излучение. Последнее не
должно затрагивать хромофоры исследуемой молекулы.
Матрица испаряясь переходит в газовую фазу, увлекая за собой
исследуемую молекулу.
Специфика лазерного излучения.
Два типа лазеров используются в технике MALDI:
Инфракрасный лазер, возбуждающий вибрационные моды и УФ - лазер, возбуждающий электронные переходы в молекуле. Длина импульса обычно составляет 100 нс или меньше. Большие длины импульсов обычно приводят к тепловому разложению образца.
Специфика масс- спектрометра
Поскольку большинство лазерных источников являются пульсирующими, то для регистрации используются такие методы как метод времени пролета или метода ионного циклотронного резонанса. Точность определения массы составляет ± 0.01% (±1 Da при молекулярной массе 10 кДa).
4
Ионизация электрораспылением
1e - 1e mBar-7 -1 0
Nanoflow e lectrosprayionisation
Free jet expansionin the ion source
Disassem bly in thecollis ion cell
Mass analysis
Схематическое представление прохождения ионов от кончика иглы, содержащего раствор биологических макромолекул, до детектора масс спектрометра. Раствор белка (объем - 1-2 μл, концентрация - 5 μM) выходит из тонкого капилляра (внутренний диаметр около 10 μм). К концу капилляра, покрытого золотом, прикладывается высокое напряжение (обычно несколько кВ), вызывая распад капель на очень мелкие капли. Десольватация последних приводит к появлению облака молекул, которые детектируются масс спектрометром. Точность определения молекулярных масс составляет 0.001-0.005%.
5
Инструменты и техника регистрации в масс спектрометрии
A
BSource Slit
Magnet
Collector Slit
ESA
-V + V cos tdc rf
+V + V cos tdc rf
Filament Electriclens
Top and bottomend cap electrodes
Ringelectrode
Electronmultiplier
Toamplifier
Electrongate
+
Time-domainsignal
FT
MassSpectrum
Transmitterplate
Trap plateB
Receiver plate
rf excite
Signalout
FourierTransform
FourierTransform
Time Frequency
-V + V cos tdc rf
+V + V cos tdc rf
+V + V cos tdc rf
-V + V cos tdc rf
QI
QII
S
D
RF only q (collection cell)
Single and double focusing mass spectrometers
Fourier transform mass spectrometry
Ion cyclotron resonance mass spectrometry
Quadrupole mass filter
Quadrupole ion trap
Triple mass filter
6
Определение масс белков
ESI-FTIR масс спектр двух белков: цитохрома c и миоглобина лошади.
Концентрация образца 0.4 нM.
Общее количество белка около 135 зM (~ 80 000 молекул).
1 зепто моль = 10-21 моля
МАЛДИ спектр высокого разрешения белка [Arg8]-вазопресина.
Основной спектр 1084.446 относится к «моноизотопному» пику протонированного
белка.
Три пика более высокой массы относятся к вкраплению в белок изотопа 13C, доля
встречаемости которого в природе равна 1.108%.
1084.446
+1Da
+2Da
+3Da
Моноизотопная масса
horse cytochrome c
horse myoglobin [Arg8]-вазопресин
7
Применяя формулу (А) для расчета молекулярной массы цитохрома c с использованием двух соседних пиков с = 952.3 и = 1031.3, получим для следующее значение:
Это означает, что 12 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой, равной 1031.3.Молекулярная масса в этом случае рассчитывается как М = n2 (m2 -1) и равна 12363.6.
Рассматривая следующие два пика с относительными массами = 884.3 и = 952.3, мы получим:
или Z = 13, т.е. 13 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой 952.3. Рассчитанная из этих пиков молекулярная масса равна 12366.9.
Молекулярная масса нейтральной молекулы M может быть найдена из значений регистрируемых масс m1 и m2
и (что эквивалентно значениям m/z) и числа добавленных зарядов или протонов n1 и n2 :
М = n2 (m2 - 1) (A)
где n1 = n2+1 и
n2 = (m1 -1) / (m2 - m1) Следовательно, M, можно рассчитать, если брать пики регистрируемых масс попарно.
04.123.9523.1031
3.9511
12
12
mm
mn
989.123.8843.952
3.8841
12
1
2
mm
mn
Цитохром с
8
Сворачивание белков: конечные и промежуточные состоянияFolded Protein
Unfolded Protein
ESI - MS
ESI - MS
m/z
m/z
Цитохром c Апомиоглоин Кислая денатурация миоглобина
Различные pHРазличные моменты
времени
9
20
Виртуальный двумерный форез
Вертикальная полоска: одномерный полиакриламидный гель, окрашенный.серебром. Каждый участок его дубликата ( не окрашенного серебром) анализируется масс
спектрометрией.
10
Нуклеиновые кислоты и их комплексы с белками. Проблема: «любовь НК» к ионам.
Гистограмма средних масс образца ДНК. Доминантный пик 2.88 MДa соответствует Na-бактериальной ДНК плазмиде (pBR322), а меньший пик ее димеру (Benner, 1997).
Расчетное значение молекулярной массы 30S субьединицы равно 852187 ± 3918 Дa. Эта величина на 0.6% отличается от «точного значения», вычисленного из составляющих ее компонентов (16S РНК и белков).
5 мМ Мg
1 mM Mg
bacterial plasmid (pBR322)
Димер
Мономер
11
peptides
peptides
Extract cellular proteins
Trypsin treatm ent
Liquid chromatograhyseparation
Mass Spectrometry
2D gel
charge
Trypsin treatment
Cell or tissue sample
Статический и динамический протеомы и масс-спектрометрия
Две стратегии анализа протеома методом масс спектрометрии (Godovach-Zimmermann and Brown, 2001).
12
Формирование изображения с помощью масс спектрометрии
Методология пространственного анализа ткани методом MALDI-MS. Замороженные секции помещаются на металлической плате и покрываются UV- абсорбирующей матрицей. Затем они помещаются в масс-спектрометр и сканируются лазерным лучом. (Stoeckli et al., 2001, Nature Medcine, 7, p.494).
Масс спектрометрическое изображение замороженных секций ткани мозга мыши.
(а) Оптическое изображение замороженной секции на золотой подложке.
(b) Распределение белков с m/z = 8528 в области центральной коры головного мозга
(c) Тоже для m/z 6716 в области медиальных сучковатых ядер.
(d) Тоже для m/z 2564 в области среднего мозга.