Использование ДНК- биочипов для диагностики...

Использование ДНК-биочипов для диагностики вирусного гепатита С

Д.м.н., профессор кафедры инфекционных и тропических болезней КазНМУ им.С.Д.Асфендиярова Шопаева Г.А.

24.09.2014 г.

I-ый Казахстанский Медицинский Диагностический Форум «Инновационные технологии в радиологии (КТ, МРТ, ПЭТ, УЗИ), лабораторной и функциональной диагностике»23-24 сентября 2014 г., г.Астана

HCV-инфекция

• Значительный рост показателей заболеваемости в мире • Начиная с 1998 г., инфицированность населения вирусом

гепатита С (HCV) растет с опережающей по отношению к вирусу гепатита В (HBV) быстротой

• Частое поражение лиц молодого возраста• Высокий уровень хронизации (~ 75-85%)• Исход в цирроз (27%) и первичный рак печени (25%) *• Полиморфизм внепеченочных поражений• Трудности лабораторной диагностики• Отсутствие специфической профилактики

Мультидисциплинарная проблема* Alter MJ. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 2007.- 13. –

Р.2436–41. [PMCID: PMC4146761] [PubMed: 17552026]

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

годы

По

каза

тел

ь н

а 10

0 ты

с.н

асел

ени

я

0

2

4

6

8

10

12

14

По

каза

тел

ь н

а 10

0 ты

с.н

асел

ени

я

ОВГ ХВГ Линейный (ХВГ) Линейный (ОВГ)

Динамика многолетней заболеваемости острыми, хроническими вирусными

гепатитами в Республике Казахстан

Заболеваемость хроническими вирусными гепатитами (впервые

выявленные) в РК

3,68

8,34 8,629,35

11,31

1,82

3,8 3,84 3,95 4,03

0,090,43 0,46 0,37 0,24

1,58

3,99 4,074,59

6,75

0

2

4

6

8

10

12

14

2003 2004 2005 2006 2007

годы

пока

зате

ль н

а 10

0 00

0 на

селе

ния

Всего ХВГВ ХВГВ+Д ХВГС

Линейный (ХВГВ) Линейный (Всего) Линейный (ХВГС) Линейный (ХВГВ+Д)

Естественное течение HCV-

инфекции

Ekta Gupta, Meenu Bajpai, and Aashish Choudhary Hepatitis C virus: Screening, diagnosis, and interpretation of laboratory assays //Asian J Transfus Sci. 2014.- 8(1).- P.19–25.

Значение внепеченочных поражений при HCV-инфекции

Могут приобретать ведущее значение в клинической картине болезни и быть причиной позднего распознавания хронического гепатита С

«Маски» ХГ-С

ревматологические

дерматологические

гематологические эндокринологические офтальмологические

нефрологические

неврологические

0 1 2 3 4 5 6 1 5 1020

Хронический гепатит

Цирроз, ГЦК

РНК HCV

AЛT

HCV антитела

симптомы

месяцы годы

титр

Острый гепатит

Гепатит С

симптомы

• Клиническая диагностика• Лабораторная диагностика

• Широкое распространение малосимптомных и латентных форм инфекции, высокий хрониогенный потенциал, неблагоприятные исходы, отсутствие эффективной специфической профилактики предопределяют особую значимость решению проблем ранней диагностики заболевания, генотипирования и эпидемиологического мониторинга.

• Требуется развитие быстрых и надежных лабораторных методов ранней диагностики, мониторинга развития и течения ВГС.

Диагностика ВГС

Диагностика ВГС• Клиническая диагностика• Лабораторная диагностика (системы ранней диагностики ВГ)

Секвенирование

Масс-спектрометрия

Прямые методы обнаружения

Методы типирования

Антигенные

микрочипы

Серологические методы обнаружения

Иммуноферментный анализ

ПЦР в реальном времени

Технологии на основе использования биочипов

Различают 6 генотипов HCV,

которые делятся на различные

субтипы (от a до z)

На сегодня путем секвенирования изолятов HCV

идентифицировано более чем 83

субтипа

Высокая изменчивость генома HCV

Устойчивость к противовирусным

препаратам

Вирус гепатита С

Thong VD, Akkarathamrongsin S, Poovorawan K, Tangkijvanich P., Poovorawan Y. Hepatitis C virus genotype 6: Virology, epidemiology, genetic variation and clinical implication //World J Gastroenterol 2014, March 21.- 20(11).-P.2927-2940.

География генотипов HCV

Распределение генотипов HCV в популяции РК

G1, n=1043

55%G2,

n=19710%

G3, n=66735%

Центрально-Азиатская Гастроэнтерологическая Неделя, Алматы, 17-21 сентября, 2013

Казахстан

2; 18,6

3a; 22,8

Not determ.; 2,1

1b+3a; 1,1

1b+2; 3,2

1b; 52,3

Исследование в РК, n= 466Земан В.В., 2004

Определение генотипа/субтипа ВГС

имеет значение для выбора оптимальной

тактики терапии (продолжительность

ПВТ)

является предиктором

ответа на терапию

определяет прогноз HCV-

инфекции

эпидмаркирование

HCV

• Применение биочипов в исследовательских и диагностических целях представляет собой самую обширную область потенциального роста.

• Использование данной технологии позволяет определить соответствующую тактику лечения для каждого конкретного больного (персонифицированная терапия).

• С целью выявления и генотипирования вируса гепатита С разработана и используется тест-система INNO-LiPA HCV (“INNOGENETICS”, Belgium) на основе принципа обратной гибридизации со специфичными для определенного генотипа вируса гепатита С зондами, иммобилизованными в виде полос на нитроцеллюлозную мембрану1,2.

Диагностика ВГС. Использование биочипов

1 Stuyver L., Rossau R., Wyseur A. et al. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay //J.Gener.Virol. – 1993. – Vol.74. – P.1093-1102.2 Maertens G., Stuyver S., Rossau R., van Heuverswyn H. Process for typing HCV isolates // United States Patent. – 2003. – No6. – 548,244 B2.

Тип 1a 1b 2a 2b 3a 3bВыявление всех ВГС const

1ab

1а

1b

2a

2b

3а

3b

K+ на систему выявления

K+ на постановку анализа

Шаблоны для выявления анализируемой матрицы генотипа HCV

В 2005 г. в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, Россия) был разработан способ выявления анализируемой последовательности ДНК с использованием высокоселективных олигонуклеотидных зондов на основе модифицированных («мостиковых») олигонуклеотидов (зав.лабораторией д.м.н. Пышный Д.В.).

Принцип работы ДНК-чипа

• Разработка ДНК-чипа основана на обратной гибридизации иммобилизованного на твердофазный носитель HCV-специфичного олигонуклеотидного зонда с высококонсервативным участком кДНК HCV.

• Использование составных или «сшитых» тандемов трех коротких олигонуклеотидов позволяет достоверно отличать последовательности, содержащие одну нуклеотидную замену.

• Данный способ диагностики реализуется посредством тест-системы, содержащей пробирку с капроновым чипом (5х15 мм), промывочные и буферные, а такжеферментативные растворы.

С помощью предложенного нами, совместно с разработчиками ДНК-чипа, способа диагностики вирусного гепатита С с использованием ДНК-чипов, в основе которых лежит вышеописанный способ выявления последовательности ДНК, было протестировано 65 образцов крови от больных вирусным гепатитом С (в том числе в сочетании с туберкулезом легких), проживающих в г.Алматы.

Генотипирование HCV с помощью ДНК-чипов

1b 2a 3a

+ ВГС

1a + 1b

1b

3a

+ ВГС

2a

+ ВГС

2a + 1a

1b 2a 3aВГС11а, 21b2а2b3a

Субтипы ВГС1b 2a 3a

ВГС11а, 21b2а2b3a



Субтипы ВГС













1 2 5 7 8 11

Сканированные изображения ДНК-биочипов после проведения анализа на ПЦР-образцах ##1, 2, 5, 7, 8, 9, 11

номер ПЦР-образца

1b 2a 3a 3a 3a 1а 3b результат

генотипирования с помощью тест-

системы

9

№№ Метод №№ Метод №№ Метод

I II III I II III I II III1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 1b - 1b 23 - 3a2 3a 45 - 3a2 3a2 2a - 2a 24 - 32 3b 46 - 22 2a3 1b - 1b 25 - 1b2 1b 47 - 3a2 3a4 1b - 1b 26 - нет2 нет 48 - 1b2 1b5 3a - 3a 27 - 3a2 3a 49 - 3a2 3a6 1b - 1b 28 - 1b2 1b 50 - 22 2a7 3a - 3a 29 - 1b2 1b 51 - 3a2 3a8 3a - 3a 30 - 3a2 3a 52 - 3a2 3a9 1a - 1a 31 - 3a2 3a 53 - нет2 нет10 1b - 1b 32 - 3a2 3a 54 - нет2 нет11 3b 31 3b 33 - 1b2 1b 55 - 1b2 1b12 1b 1b1 1b 34 - 1b2 1b 56 - 1b1,2 1b13 1b 1b1 1b 35 - 1b2 1b 57 - нет1,2 нет14 3a 3а1 3a 36 - 3a2 3a 58 - нет1,2 нет15 3a 3а1 3a 37 - нет2 нет 59 - 1b1,2 1b16 1b 1b1 1b 38 - 1b2 1b 60 - 1b1,2 1b17 1b нет1 HCV 39 - 1b2 1b 61 - 1b1,2 1b18 1b 1b1 1b 40 - нет2 нет 62 - 3a2 3a19 - 1b1 1b 41 - 1b2 1b 63 - 3a2 3a20 - 1b1 1b 42 - 3a2 3a 64 - 21,2 2a21 - нет2 нет 43 - 3a2 3a 65 - 1b1,2 1b22 - 3a2 3a 44 - 3a2 3a

Результаты генотипирования с использованием новой тест-системы (метод III) сопоставлены с данными, полученными референс-методами – прямого секвенирования нуклеотидной последовательности 5’-UTR HCV (метод I); коммерчески доступными тест-системами «ДНК-технология», «АмплиСенс HCV-генотип» (г.Москва, Россия)(метод II)

Примечание:1 – генотипирование HCV с использованием тест-системы «ДНК-технология»2 – генотипирование HCV с использованием тест-системы «АмплиСенс HCV-генотип»

Таким образом,• Молекулярно-биологические методы повышают

эффективность этиологической диагностики в раннем периоде HCV-инфекции.

• Способ генотипирования HCV на основе олигонуклеотидных ДНК-чипов позволяет проводить одновременно детекцию и генотипирование вируса гепатита С, а также дифференцировать генотип 2 (2а, 2b) и определять субтип 3b вируса в отличие от широко используемых коммерческих тест-систем.

• Предлагаемый способ соответствует референс-методу (секвенирование) определения генетического материала.

• Перспективы развития молекулярной диагностики (в т.ч. биочипы) вирусных гепатитов на сегодняшний день связывают с нерешенными проблемами в этой области, в частности,

- прогноз течения и исхода заболевания- оценка степени активности гепатита и степени

фиброза печени без гистологического исследования

- прогноз эффективности ПВТ до ее начала- ранее выявление неэффективности лечения- ранняя диагностика рака печени.• Реализация принципа персонифицированной

терапии.• Качественно новый уровень решения проблем

ранней диагностики, лечения и профилактики ВГС.

Молекулярная диагностика. Реалии и перспективы …

Благодарности• Разработчикам методики генотипирования вируса гепатита С

с использованием олигонуклеотидных ДНК-чипов – сотрудникам лаборатории нанотехнологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г.Новосибирск (зав.лабораторией д.х.н. Д.В.Пышный).

• Cотрудникам ПЦР-лаборатории Научной лаборатории им.Г.Кюнцигера КазНМУ им.С.Д.Асфендиярова (заведующая – канд. мед. наук, доцент Ш.А.Бейсембаева).

• Исследование проведено в рамках Программы прикладных научных исследований Министерства здравоохранения РК «Разработка и внедрение высокоэффективных геномных технологий в диагностику и прогнозирование течения и исходов инфекционных заболеваний», 2006-2008, № ГР 0106РК00418.

Спасибо за внимание!

Использование ДНК- биочипов для диагностики...

Documents