第七章

免疫组化结果的分析和判断

（要求：理解， 熟记， 会用）

第一节 免疫组化结果的判断原则第一节 免疫组化结果的判断原则  

        免疫组化结果的判断原则概括起来有以免疫组化结果的判断原则概括起来有以

下几点：下几点：  

        ⒈⒈ 必须同时设对照染色必须同时设对照染色。没有对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。的免疫组化染色结果是不可信的。 ⒉⒉ 抗原表达必须在特定部位抗原表达必须在特定部位。如。如 LCALCA 应应定位在细胞膜上；定位在细胞膜上； CKCK 应定位在细胞浆内应定位在细胞浆内；；PCNAPCNA 及及 p53p53 蛋白应定位在细胞核内；蛋白应定位在细胞核内； EEMAMA 应定位在细胞膜上，等等。不在抗原应定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。。

        ⒊⒊ 阴性结果不能视为抗原不表达。阴性结果不能视为抗原不表达。由于由于

检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染

色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判

断时应注意。 断时应注意。

        ⒋⒋ 尽量避开出血、坏死及切片刀痕和尽量避开出血、坏死及切片刀痕和

界面边缘细胞的阳性表达，界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免特别是酶免

疫标记。因为这类阳性着色多系内源干疫标记。因为这类阳性着色多系内源干

扰，或系人为因素所致。扰，或系人为因素所致。

        ⒌⒌ 对免疫组化标记结果的意义不能绝对免疫组化标记结果的意义不能绝

对化，对化，应结合临床资料、应结合临床资料、 XX 线等影像学线等影像学

及实验结果综合分析。及实验结果综合分析。

第二节 第二节

对照染色设计对照染色设计

(( 一）对照染色的目的一）对照染色的目的

设对照的目的是为了排除假阴性和假阳设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三：性。假阴性的原因主要有三：①组织处理①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗体失不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗漏及抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的差错，或显色剂的选择、缓冲液的 pHpH 和和离子强度不当等。离子强度不当等。

假阳性均系由多种因素造成的非特异假阳性均系由多种因素造成的非特异

着色所致，原因主要有：着色所致，原因主要有：①自发荧光或内①自发荧光或内

源酶等干扰；②抗体试剂不纯源酶等干扰；②抗体试剂不纯 (( 特别是一特别是一

抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或

显色剂操作不当等；④显色剂操作不当等；④ FcFc 受体的干扰，受体的干扰，

等等。等等。

（二）对照的种类及其选用目的（二）对照的种类及其选用目的

对照染色大致可分为阳性组织对对照染色大致可分为阳性组织对

照、阴性组织及阴性试剂对照和自身照、阴性组织及阴性试剂对照和自身

对照四大类：对照四大类：

⒈⒈ 阳性组织对照阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原 指用已证实含有靶抗原

的同源及不同源组织切片或细胞涂片与的同源及不同源组织切片或细胞涂片与

待检实验切片同时作同样处理和免疫染待检实验切片同时作同样处理和免疫染

色的组织对照。正确的结果应呈现阳性色的组织对照。正确的结果应呈现阳性

，目的是为了证实所用免疫组化染色流，目的是为了证实所用免疫组化染色流

程的有效性，排除假阴性的可能。 程的有效性，排除假阴性的可能。

⒉⒉ 阴性组织对照 阴性组织对照 指用已证实不指用已证实不

含靶抗原的同步处理和免疫标记染含靶抗原的同步处理和免疫标记染

色的组织对照。正确的结果应为阴色的组织对照。正确的结果应为阴

性，目的是除外假阳性。性，目的是除外假阳性。

⒊⒊ 阴性试剂对照 阴性试剂对照 是指用于证实在免疫是指用于证实在免疫

组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗

体试剂的有效性和可靠性而所设立的同体试剂的有效性和可靠性而所设立的同

步免疫染色对照，包括有：步免疫染色对照，包括有：空白对照；空白对照；

替代对照；吸收试验和抑制试验，等。替代对照；吸收试验和抑制试验，等。

目的在于除外假阳性和证实所用免疫组目的在于除外假阳性和证实所用免疫组

化试剂及其技术方法的有效性和待检实化试剂及其技术方法的有效性和待检实

验切片免疫标记阳性结果的可靠性。验切片免疫标记阳性结果的可靠性。

⑴⑴ 空白对照空白对照 指以缓冲液（指以缓冲液（ PBSPBS 、、 TT

BSBS 等）取代第一抗体（主要的，必要等）取代第一抗体（主要的，必要

时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取

代），其他各步不变的试剂对照染色，代），其他各步不变的试剂对照染色，

结果应为阴性。 结果应为阴性。

⑵⑵ 取代对照取代对照 指以所用方法第一抗体同源动 指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体物的正常血清，或与本实验无关的抗体 (( 靶靶生物缺如的生物缺如的 )) 取代第一抗体，其他步骤不变取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。的试剂对照染色，结果应为阴性。

⑶⑶ 吸收试验吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的 是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。 性着色明显减弱（吸收不全时）。

⑷⑷ 抑制试验抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗是指用标记抗体和未标记抗

体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗

体）两者的混合物作试剂，其他步骤不体）两者的混合物作试剂，其他步骤不

变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳

性着色应成比例的减弱（等量或性着色应成比例的减弱（等量或 11 ：： 99

）。此试剂对照多用于直接法。 ）。此试剂对照多用于直接法。

这类阴性试剂对照的这类阴性试剂对照的选用原则选用原则是：是：

①空白对照不能省，其他对照在预实验①空白对照不能省，其他对照在预实验

中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂

；②对照必需与实验片同步进行染色；；②对照必需与实验片同步进行染色；

③对照的结果应附合要求。 ③对照的结果应附合要求。

⒋⒋ 自身对照 是指在同一标记切片上的自自身对照 是指在同一标记切片上的自

身组织成分的阴性背景对照。身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原即与靶抗原

阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构

的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与

阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除

内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移

位造成的错误结果。位造成的错误结果。

第三节 第三节

非特异染色非特异染色

非特异染色是指免疫组化染色过程非特异染色是指免疫组化染色过程

中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳

性，又称背景着色，能严重干扰免疫组性，又称背景着色，能严重干扰免疫组

化染色结果的正确判断，应竭力避免或化染色结果的正确判断，应竭力避免或

减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的

各个环节，可来自： 各个环节，可来自：

①① 内源性干扰内源性干扰 (( 自发荧光、内源酶、内自发荧光、内源酶、内

源性生物素等源性生物素等 )) ；②试剂污染；②试剂污染 (( 质量差质量差

，交叉反应，，交叉反应， FcFc 受体干扰等受体干扰等 )) ；③组织；③组织

处理不当处理不当 (( 组织固定不及时或固定不良组织固定不及时或固定不良

所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所

导致的游离试剂残留等导致的游离试剂残留等 )) 。。

纠正的方法视原因而异，可在预实纠正的方法视原因而异，可在预实

验基础上，采用有针对性的纠正对策，验基础上，采用有针对性的纠正对策，

即对症下药即对症下药 (( 具体纠正方法不展开讲了具体纠正方法不展开讲了

，同学们可以自己阅读讲义，同学们可以自己阅读讲义 p123-126) p123-126)

。。

第四节 第四节

阳性标记的形态特征和判断阳性标记的形态特征和判断

免疫组化标记具有一定形态特点，免疫组化标记具有一定形态特点，

若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记

结果的正确判断。特点包括定性、定位结果的正确判断。特点包括定性、定位

和定量三方面。和定量三方面。

免疫显色强度和阳性细胞密度是定免疫显色强度和阳性细胞密度是定

性定量指标，实际工作中常采用强度和性定量指标，实际工作中常采用强度和

密度结合的方法综合计量，与抗原含量密度结合的方法综合计量，与抗原含量

有关；阳性细胞的着色形态及组织分布有关；阳性细胞的着色形态及组织分布

特点主要是定位指标，与功能有关。特点主要是定位指标，与功能有关。

一、阳性标记免疫特征：分一、阳性标记免疫特征：分 "" 弱弱 (+)(+)

、中、中 (++)(++) 、强、强 (+++)"(+++)" 三级。免疫荧光法三级。免疫荧光法

（（ FITCFITC 为例） 则表现为浅绿色荧光、明为例） 则表现为浅绿色荧光、明

显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；

免疫酶标记（免疫酶标记（ HRP- DAB/HHRP- DAB/H22OO22 ））

则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和

褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。一般图褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。一般图

片照像，原则上多取强阳性区域。片照像，原则上多取强阳性区域。

二、阳性标记细胞学特征二、阳性标记细胞学特征（以（以 HRP-DAB/HHRP-DAB/H

22OO22 为例） 可分为为例） 可分为①胞膜型；②胞核型；③①胞膜型；②胞核型；③

胞质胞质 (( 浆浆 )) 型；④微绒毛型和⑤复合型型；④微绒毛型和⑤复合型（胞（胞膜膜 -- 胞质兼有，胞核胞质兼有，胞核 -- 胞质兼有，或微绒毛胞质兼有，或微绒毛-- 胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。图像。

三、阳性标记组织学特征三、阳性标记组织学特征（以（以 HRP-DAB/HHRP-DAB/H22

OO22 为例） 免疫组化染色阳性细胞在组织中为例） 免疫组化染色阳性细胞在组织中

的分布排列形式可以有如下的分布排列形式可以有如下 77 种：种：①局灶型①局灶型

；②弥漫型；③片块型；④网状型；⑤腺管；②弥漫型；③片块型；④网状型；⑤腺管

型；⑥腔缘型和⑦菊团型型；⑥腔缘型和⑦菊团型，等。这主要取决，等。这主要取决

于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细

胞在组织内的群体分布特点。胞在组织内的群体分布特点。

四、阳性标记强度特征四、阳性标记强度特征 依照细胞阳性着 依照细胞阳性着

色程度（抗原含量），可分为弱阳性（色程度（抗原含量），可分为弱阳性（

++ ）┅）┅ 11 分；中等阳性（分；中等阳性（ ++++ ）┅）┅ 22 分；分；

强阳性（强阳性（ ++++++ ）┅）┅ 33 分。依照阳性细胞分。依照阳性细胞

数量，可分为：弱阳性（数量，可分为：弱阳性（ + + ，指阳性细，指阳性细

胞总数在胞总数在 25%25% 以下）；以下）；

中等阳性（中等阳性（ ++,++, 指阳性细胞总数在指阳性细胞总数在 25%25%

—49%)—49%) ；强阳性（；强阳性（ +++ +++ ，指阳性细胞，指阳性细胞

总数在总数在 50%50% 以上以上 )) 。目前多采用积分综。目前多采用积分综

合计量。计算公式为：（合计量。计算公式为：（ ++ ）） %x1 +%x1 + （（

++++ ）） %x2+%x2+ （（ ++++++ ）） %x3%x3 ；总数值；总数值 <1<1

.0.0 者为（者为（ ++ ），）， 1.0-1.51.0-1.5 者为者为 (++),>1.5(++),>1.5

者为者为 (+++)(+++) 。至少随机观察。至少随机观察 5-105-10 个个 HPFHPF

。。

第五节 第五节

染色失败的可能原因染色失败的可能原因

免疫组化染色的基本要求有二：①免疫组化染色的基本要求有二：①

实验切片的阳性抗原定位准确，呈色鲜实验切片的阳性抗原定位准确，呈色鲜

明，背景着色浅或无，二者的比值应大明，背景着色浅或无，二者的比值应大

于于 11 （阳性（阳性 // 背景）；②对照染色的结背景）；②对照染色的结

果应附合要求。否则，所得实验结果都果应附合要求。否则，所得实验结果都

是错误的，或为假阳性或为假阴性。是错误的，或为假阳性或为假阴性。

假阳性是指实验切片呈阳性，阴性假阳性是指实验切片呈阳性，阴性

组织对照或组织对照或阴性试剂对照阴性试剂对照也呈阳性的结也呈阳性的结

果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰

，试剂不纯，交叉反应等有关。，试剂不纯，交叉反应等有关。

假阴性是指实验切片呈阴性，假阴性是指实验切片呈阴性，阳性组阳性组

织对照织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果及阴性试剂对照也均呈阴性的结果

，谓之假阴性。其原因与组织处理不当，，谓之假阴性。其原因与组织处理不当，

组织细胞抗原丢失或试剂错误组织细胞抗原丢失或试剂错误 (( 如漏加、如漏加、

错加、失效、变质等错加、失效、变质等 ),), 操作失误等有关。 操作失误等有关。

对照结果判断：对照结果判断：

表中表中 11 ～～ 55 结果无效，结果无效， 66、、 77结果可靠结果可靠

（＋）（＋）

（＋）（＋）

（＋）（＋）

（－）（－）

（＋）（＋）

（＋）（＋）

（－）（－）

检测标本含抗体，结果可靠检测标本含抗体，结果可靠（＋）（＋）（－）（－）（－）（－）77

检测标本不含抗体结合可靠检测标本不含抗体结合可靠（－）（－）（－）（－）（－）（－）66

非特异染色非特异染色（＋）（＋）（＋）（＋）（－）（－）55

阳性对照不含定位抗原阳性对照不含定位抗原（＋）（＋）（－）（－）（－）（－）44

阴性对照内含定位抗原阴性对照内含定位抗原((＋＋ )()(－－ ))（－）（－）（＋）（＋）33

非特异性染色非特异性染色（＋）（＋）（＋）（＋）（＋）（＋）22

抗体失活，操作有误抗体失活，操作有误（－）（－）（－）（－）（－）（－）11

结果判断结果判断检测结果检测结果替代对照替代对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照

染色失败原因：染色失败原因：

均为阴性均为阴性

均为弱阳性（除阴性对照）均为弱阳性（除阴性对照）

背景染色过深背景染色过深

阳性对照好，待检标本弱阳性阳性对照好，待检标本弱阳性

阳性对照无背景，待检标本背景深阳性对照无背景，待检标本背景深

判断原则：判断原则：

实验设计实验设计

抗体选择抗体选择

抗原定位性抗原定位性

抗原分布不均一性抗原分布不均一性

识别假阴性识别假阴性            抗原丢失或减弱抗原丢失或减弱 抗体失活抗体失活 操作不当操作不当

识别假阳性识别假阳性            抗原弥散抗原弥散 抗原异位表达抗原异位表达 瘤细胞吞噬瘤细胞吞噬 病变中正常组织残留病变中正常组织残留 抗体交叉反应抗体交叉反应 内源性物质着色内源性物质着色

                边缘反应、刀痕、皱折、坏死或挤压边缘反应、刀痕、皱折、坏死或挤压区域不作为判断依据，应用“ 正反法”原区域不作为判断依据，应用“ 正反法”原则则

免疫组化标准化：免疫组化标准化：抗原特异性抗原特异性

抗体交叉反应和标记谱系抗体交叉反应和标记谱系

方法规范化方法规范化

结果综合分析和判断结果综合分析和判断