Волгоградский государственный медицинский университет

Коррекция эндотелиальной дисфункции у крыс с

экспериментальным сахарным диабетом соединениями с

антиоксидантным действием

д.м.н., профессор Тюренков Иван Николаевич

Патогенез эндотелиальной дисфункции при сахарном диабете

Эндотелиальнаядисфункция

Сахарный диабет

Гипергликемия

ИнсулинорезистентностьГиперинсулинемия

Нарушение липидного баланса

крови в сторону атерогенных

липидов

тромбогенных и прокоагулянтных

факторов

Нейрогуморальная активация (активация РААС,

АТ II, тканевого АПФ, ремоделирование

сосудистой стенки, гипертрофия

кардиомиоцитов)

Нарушение в системе синтеза,

выделения и доступности NO

факторов воспаления(протеинкиназа С,С-реактивный белок,

гомоцистеин, протеин С), повышение

проницаемости сосудистой стенки

Смещение баланса вазодилатация-

вазоконстрикция в сторону последней (снижение ЭЗВД)

Оксидативный стресс (ПОЛ, КПГ, полиоловый путь обмена глюкозы,

образование пероксинитрита)

Материалы и методы исследования

Флавицин (100 мг/кг)Мексидол (100 мг/кг)

Комплексный морфо-функциональный подход в оценке эндотелиальной дисфункции:• Изучение вазодилатирующей функции (ЭЗВД при введении ацетилхолина, L-аргинина, N-L-аргинина; ЭНЗВД при введении нитроглицерина; мощности и стабильности NO-синтазной системы; индексы Пурселло и Гослинга)

• Изучение антитромботической функции (скорость образования тромба (артериальный тромбоз); фактор фон Виллебранда)

• Изучение противоспалительной функции (уровень СРБ, морфологические признаки воспаления эндотелия)

• Изучение антипролиферативной функции (пролиферация сосудистой стенки, уровень циркулирующих эндотелиоцитов, соотношение комплекса интима/медиа)

Эндотелиальная дисфункция на всех этапах исследования моделировалась стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом.

ЭСД вызывали введением стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг, в/в

Исходная скорость мозгового кровотока

0

5

10

15

20

25

30

Интакт ЭСД

Усл

.ед

.

**

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

ИндексПурселло

ИндексГослинга

ЭСД

Интакт

**

**

Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; ** - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Исходная скорость мозгового кровотока и эластичность и сопротивление сосудистой стенки при ЭСД

Оценка вазодилатирующей функции эндотелия при активации и блокаде синтеза эндогенного оксида азота у

животных с ЭСД

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

АЦХ L-аргинин НТГ N-L-аргинин

Пр

ир

ос

т кр

ов

ото

ка,

%

Интакт ЭСД

**

**

**

Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; ** - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Исходная скорость мозгового кровотока

0

5

10

15

20

25

30

Интакт ЭСД ЭСД+флавицин ЭСД+мексидол

Усл

.ед

.

**

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

ИндексПурселло

ИндексГослинга

ЭСД+мексидол

ЭСД+флавицин

ЭСД

Интакт

**

**

≠≠

≠

Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; ** - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,05); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Влияние флавицина и мексидола на исходную скорость мозгового кровотока и эластичность и сопротивление сосудистой стенки при ЭСД

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

АЦХ L-аргинин НТГ N-L-аргинин

Пр

ир

ост

, %

Интакт ЭСД ЭСД+Флавицин ЭСД+Мексидол

## ####

##

**

**

**

#

Оценка вазодилатирующей функции эндотелия и эндотелиопротективного действия флавицина и мексидола

при активации и блокаде синтеза эндогенного оксида азота у животных с ЭСД

Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; ** - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,05); ≠≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Изучение влияния мексидола и флавицина на стабильность и мощность эндотелиальной NO-

синтазной системы у животных с ЭСД

Введение АЦХ

0

5

10

15

20

25

30

35

Интакт ЭСД ЭСД+Флавицин ЭСД+Мексидол

При

рост

кро

вото

ка, %

1-е введение 5-е введение 10-е введение

**

**

**

##

##

########

Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; ** - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Cкорость тромбообразования у интактной группы и группы с ЭСД на модели

артериального тромбоза

0

5

10

15

20

25

1мин 3мин 5мин 7мин 9мин 11мин 13мин 15мин 17мин 19мин 21мин

Ско

ро

сть

кр

ов

ото

ка,

усл

.ед

.

Интакт ЭСД

**

****

**

Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; * - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,05); ** - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Влияние флавицина и мексидола на скорость тромбообразования у животных с ЭСД на модели

артериального тромбоза

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Мин.

Ско

ро

сть

кр

ов

ото

ка,

усл

.ед

.

Интакт ЭСД ЭСД+Флавицин ЭСД+Мексидол

≠≠≠≠

**

Примечание - ЭСД – группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; * - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,05); ** - достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,05); ≠≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,01); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Уровень фактора Виллебранта

0 20 40 60 80 100 120 140 160

ЭСД+Мексидол

ЭСД+Флавицин

ЭСД

Интакт

%

**

#

#

Влияние флавицина и мексидола на уровень фактора Виллебранда у

животных с ЭСД

Примечание - ЭСД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; **-достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,05); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

СРБ, мг/л

02468

1012141618 **

##

Изучение влияния флавицина и мексидола на уровень С-реактивного белка при ЭСД

Примечание - ЭСД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; **-достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,05); (Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Изучение влияния флавицина и мексидола на морфологическое состояние эндотелия

сосудов у животных с ЭСД (головной мозг)

Интакт ЭСД

Флавицин Мексидол

Изучение влияния флавицина и мексидола на уровень циркулирующих эндотелиоцитов при

ЭСД

Примечание - ЭСД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; **-достоверно по отношению к группе интактных животных (P≤0,01); ≠ - достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,05); ≠≠ достоверно по отношению к группе животных с ЭСД (P≤0,01);(Достоверность оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни)

Эндотелиальные клетки, фенотипически верифицированные с применением моноклональных атител к антигену CD34

А. - интактные животные

Б. – животные с ЭСД

А.

Б.

Уровень циркулирующих эндотелиоцитов

0

2

4

6

8

10

12

14

ЦЭ

/100 м

кл

**

## #

15

Примечание: овалами отмечены наиболее показательные эндотелиоциты

Электронная микроскопия эндотелиоцитовсосудов мозга крыс в норме, патологии и при применении флавицина

Интакт ЭСД ЭСД+Флавицин

Общая схема развития апоптоза [Yu Q., Gao F., Xin L, 2011]

17

Эндотелин (Clone RJT)Эндотелиальная-NOS (Clone

RN5)

Оптическая плотность (единицы яркости)*

Интакт 35,9±3,5 86,3±3,2

ЭСД 79,2±3,6♦ 34,4±2,7♦♦

ЭСД+Мексидол 50,2±1,9♪ 62,8±3,1♪

ЭСД+Флавицин 45,7±4,4♪♪ 74,4±2,4♪♪(♦ - р<0,05; ♦♦ - р<0,01-достоверно по отношению к группе интактных животных; ♪ - р<0,05; ♪- р<0,01 достоверно по отношению к группам животных с ЭСД (критерий Уайта-Вилкоксона).

Морфометрическая оценка экспрессии эндотелина и е-NOS у животных с ЭСД,

получавших флавицин и мексидол

18

Интенсивность экспрессии

Количество клеток

Интакт ЭСД Флавицин Интакт ЭСД Флавицин

Каспаза 3

+ +++ + + +++ +

TRAIL + +++ ++ + ++ +

NF-kB + +++ ++ + ++ +

Группы Апоптотический индекс %

Интактная 3,6±0,2

ЭСД 36,2±2,9♦♦

Флавицин 19,25±1,9♪

(♦ - р<0,05; ♦♦ - р<0,01-достоверно по отношению к группе интактных животных; ♪ - р<0,05; ♪- р<0,01 достоверно по отношению к группам животных с ЭСД (критерий Уайта-Вилкоксона).

Индексы апоптоза и пролиферации эндотелиоцитов

Иммуногистохимические характеристики эндотелиоцитов по Allred D.C. et al. (1998)

19

Флавицин

Эндотелиопротекция

4) снижение экспрессии эндотелина-1

1) улучшение: •вазодилатирующей•антитромботической•антипролиферативной•противовоспалительной функций эндотелия

2)снижение уровня маркеров апоптоза: •каспазы-3•TRАIL• NF-kB

3) увеличение активности e-NOS

Спасибо за внимание!