СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК, ФИБРОБЛАСТОВ РАЗЛИЧНОЙ ПЛОИДНОСТИ И СТАБИЛЬНЫХ

ГИБРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИХ СЛИЯНИЕМ

Короткевич Екатерина Юрьевна

Новосибирский государственный университет

Научный руководитель: к.б.н., в.н.с. Киселева Е.В.Институт цитологии и генетики СО РАН

2010 г.

Цель: выявить особенности структурной организации гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых и дифференцированных клеток мыши, а также сравнить строение плюрипотентных клеток мыши в условиях in vivo и in vitro.

Задачи:1. Провести морфологический анализ эмбриональных стволовых клеток линии

E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из мышей 129/Ola Mus musculus, и сравнить их с клетками предимплантационных эмбрионов (от зиготы до бластоцисты) для оценки влияния культивирования на ультраструктуру клеток ВКМ.

2. Изучить морфологию ди- и тетраплоидных фибробластов мыши линии DD/c и сравнить их структурную организацию.

3. Сравнить ультраструктуру двух типов стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК и ди- или тетраплоидных фибробластов мыши, с родительскими клетками для выявления особенностей реорганизации клеток при взаимодействии геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток.

4. Провести сравнительный морфометрический анализ ядерно-цитоплазматического отношения и поверхностно-объемного отношения ядер в плюрипотентных, дифференцированных и гибридных клетках для получения количественной информации об организации клеток с различной степенью дифференцировки.

4. Провести сравнительный морфометрический анализ ядерно-цитоплазматического отношения и поверхностно-объемного отношения ядер в плюрипотентных, дифференцированных и гибридных клетках для получения количественной информации об организации клеток с различной степенью дифференцировки.

1. Провести морфологический анализ эмбриональных стволовых клеток линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из мышей 129/Ola Mus musculus, и сравнить их с клетками предимплантационных эмбрионов (от зиготы до бластоцисты) для оценки влияния культивирования на строение клеток ВКМ.

2. Изучить морфологию ди- и тетраплоидных фибробластов мыши линии DD/c и сравнить их структурную организацию.

3. Сравнить ультраструктуру двух типов стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК и ди- или тетраплоидных фибробластов мыши, с родительскими клетками с целью выявления особенностей реорганизации клеток при взаимодействии геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток.

ЗиготаЭСК ЭСК-подобный

гибрид

Фибробласто-подобный

гибрид

Бластоциста

ДФМ

ТФМ

..?..

ВКМ

...

Методы исследования:-Световая микроскопия полутонких срезов-Просвечивающая электронная микроскопия-Морфометрический анализ

Клеточные культуры и ранние эмбрионы мыши:

ЭСК – эмбриональные стволовые клетки (линия E14Tg2aSc4TP6.3, получена из мышей 129/Ola Mus musculus) (Pratt, 2000);

ДФМ – диплоидные эмбриональные фибробласты (получены из 12.5-дневных эмбрионов мышей линии DD/c Mus musculus);

tDD – тетраплоидные фибробласты (получены из ДФМ);

tef4 – стабильные гибридные клетки (17 пассажей), полученные при слиянии ЭСК и ДФМ (Круглова, 2008);

tef-t8 – стабильные гибридные клетки (28 пассажей), полученные при слиянии ЭСК и ТФМ (Круглова, 2008);

эмбрионы – получены из мышей линии 129/Ola (стадия зиготы, 2-х и 4-х клеточного зародыша, морулы, блатоцисты).

Используемые в работе клеточные культуры и эмбрионы были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН к.б.н., н.с. А.А. Кругловой и к.б.н., с.н.с. Е.А. Кизиловой, соответственно.

Материалы и методы

Особенности организации эмбриональных стволовых клеток

Я

М

М

Яд

ВА

ЯЯд

Б

Световая микроскопия Окраска метиленовым синим

Электронная микроскопия

10 мкм

2 мкм50 мкм

А

ЯМ

М

Б

М

М

В

ЭПРМ

М

Особенности ультраструктурной организации митохондрий в эмбриональных стволовых клетках

Впервые обнаружено, что ЭСК могут отличаться по морфологии митохондрий. В цитоплазме одних клеток присутствуют митохондрии со светлым матриксом и узкими кристами (Рис. А), в то время как цитоплазма других клеток содержит митохондрии с темным матриксом и расширенными кристами (Рис. Б). Наряду с этим встречаются клетки, в которых присутствуют оба типа митохондрий (Рис. В).

Масштаб 1 мкм

Стадии раннегоэмбрионального развития мыши

Зигота 2-кл 4-кл Морула Бластоциста

20 мкм

1 мкм

Д р о б л е н и е

Сравнительный морфологический анализ ЭСК и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты

ЭПРМ

М

М

М

Фрагменты ЭСК Фрагменты клеток ВКМ

Я

Я

1 мкм

5 мкм 5 мкм

1 мкм

Л

КФ

ЭПР

Ф

Яд

Яд

М

М

Сравнительный морфологический анализ ЭСК, диплоидных фибробластов (ДФМ) и тетраплоидных фибробластов мыши (ТФМ), а также стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК с ДФМ, ЭСК с ТФМ.

Эмбриональные стволовые клетки: округлая форма, крупное слегка изрезанное ядро, низкая плотность органелл в цитоплазме, узкие цистерны ЭПР

Тетраплоидные фибробласты:вытянутая форма, сглаженная ядерная оболочка, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмалеммой

Диплоидные фибробласты: Вытянутая форма, сглаженная ядерная оболочка, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмолеммой

ЭСК-подобные гибриды:округлая форма, крупное ядро,

высокая изрезанность ядерной оболочки, низкая плотность органелл в цитоплазме, узкие

цистерны ЭПР

Фибробластоподобные гибриды:вытянутая форма, глубокие узкие инвагинации ядерной оболочки, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмалеммой

Масштаб 20 мкм

Особенности ультраструктурной организации фибробластов мыши в культуре

Я

М

ЭПР

5 мкм

0,5 мкм

0,5 мкм

Яд

МЭПР

Сравнительный морфологический анализ ЭСК и гибридов, полученных слиянием ЭСК с диплоидными фибробластами

Я

Я

М

Эмбриональная стволовая клетка ЭСК-подобный гибрид

Масштаб 5 мкм

Яд

Яд

Сравнительный морфологический анализ фибробластов и гибридов, полученных слиянием ЭСК с тетраплоидными фибробластами

Я

Я

Фрагмент фибробласта Фрагмент фибробласто-подобного гибрида

Яд

Масштаб 5 мкм

29 %

Морфометрический анализ ядерно-цитоплазматического соотношенияв гибридных и исходных клетках

Анализ клеток на полутонких срезах проводился с использованием программы AxioVision.

Ядерно-цитоплазматическое отношение – отношение площади ядра к площади всей клетки на срезе, проходящем через середину ядра.

Средняя площадь клетки на срезе

Средняя площадь ядра на срезе

Ядерно-цитоплазматические отношения

Пл

ощ

ад

ь яд

ра

, м

км2

Пл

ощ

ад

ь кл

етк

и,

мкм

2

Яд

ер

но-ц

ито

пла

зма

тиче

ски

й и

нде

кс

* *

*

Морфометрический анализ поверхностно-объемного отношения ядер гибридных и исходных клеток

Поверхностно-объемное отношение (отношение площади поверхности ядра к его объему) оценивали с помощью тестовой системы линий (открытая квадратная решетка), накладываемой случайным образом на срез клетки, проходящий через середину ядра (Груздев, А.Д.; Weible, E.R., 1969)

Пов

ерхн

остн

о-об

ъем

ное

отно

шен

ие,

мкм

2 /м

км3

Пов

ерхн

остн

о-об

ъем

ное

отно

шен

ие,

мкм

2 /м

км3

**

Выводы1.ЭСК существенно отличаются от клеток ВКМ бластоцисты по строению

эндоплазматического ретикулума, отсутствию гранулярных и кристаллических включений, пучков фибрилл в цитоплазме и типу межклеточных контактов. В длительно культивируемых ЭКС мыши впервые обнаружен новый тип митохондрий, который не похож ни на один из многочисленных видов гетерогенной по морфологии популяции митохондрий ВКМ.

2.Тетраплоидные фибробласты сходны по ультраструктурной организации с диплоидными фибробластами и отличается от них несколько большими размерами клетки и ядра.

3.Гибридные клетки, полученные при слиянии ЭСК и диплоидных фибробластов, имеют сходную структурную организацию с ЭСК, тогда как гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК и тетраплоидных фибробластов, сходны по морфологии с фибробластами. Оба типа гибридов характеризуются более высокой по сравнению с исходными родительскими клетками изрезанностью ядерной оболочки, к внутренней мембране которой прикрепляется компактный гетерохроматин.

4.Сходство гибридных клеток по морфологическим и морфометрическим параметрам с ЭСК либо фибробластами скорее обусловлено плоидностью соматического партнера.