第十四章基因工程常用技术

1. 了解基因工程常用技术2. 掌握细菌的转化和转染3. 理解定点突变的诱发因素4. 掌握核酸分子杂交5. 理解 PCR 技术6. 理解 DNA 序列分析方法7. 了解基因组文库的构建方法

教学目的和要求

基因工程常用技术① 凝胶电泳② 细菌的转化和转染③ 核酸分子杂交④ 定点突变⑤PCR⑥RFLP⑦RAPD⑧DNA 序列分析⑨ 目的基因的分离和转基因植物、转基因动物等技术。

凝胶电泳： 分辨 DNA 范围 使用浓度 琼脂糖凝胶 几百 -2 万 bp 0.3-2.0%

聚丙烯酰胺凝胶 6-1000bp 3-20%

凝胶电泳制备方法：样品制备→凝胶制备→电泳→染色→观察。应用于分析；纯化。

细菌的转化和转染转化：指受体细胞从周围介质总共吸收外来 DNA

片段，使其基因型和表型发生相应变化转染：转化的特殊形式，是用离体状态的噬菌体、

病毒核酸感染细胞，以改变受体遗传组成 关键：①受体细胞是否处于感受态。诱导方法

为：快速生长的细菌 +0℃、 CaCl2 低渗溶液→细胞肿胀呈球状（感受态） +DNA→ 吸附 +42℃短暂处理 +MgCl2→ 吸收②为防止限制，提高转化效率，可选用无限制作用的突变体。

定点突变的诱发 这项技术是加拿大的 M.Smith70 年代创造，获 199

3 年诺贝尔化学奖。 也称位点专一诱变。是一种反向遗传学方法。即将

克隆基因在体外按预先的设计利用核酸酶、诱变剂等来诱发位点特异性突变，或将预先确定的碱基改变引入人工合成的寡核苷酸再组入基因中，然后将已知缺失、插入、碱基替换、移码等不同类型的突变基因导入受体细胞，再进行选择、分析突变表型。

这里仅介绍寡核苷酸定点突变

寡核苷酸定点突变原理及步骤

核酸分子杂交 1968 年由 Boy Britten 等人发明 原理： DNA 或 RNA （带互补的特定核苷酸

序列）→混合（退火）→同源区段形成双链结构→杂种核酸分子（来源不同）

类型： Southern 杂交； Northern 杂交；原位杂交（ boltting ）

Southern 杂交：将电泳凝胶中的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同 DNA或 RNA探针杂交检测同源片段的方法。见图

Southern 杂交

图 .Southern 转移和分子杂交的过程

Northern 杂交 又称 RNA印迹技术，是将 RNA 分子从电泳凝

胶转移到 NC 滤膜上进行杂交的一项技术。 由 J.C.Alwinex 等在 1979 年建立 它与 Southern 杂交十分相似，不同之处只是

从凝胶中转移到滤膜的是 RNA而不是 DNA 类似的转移蛋白质的方法叫Western 杂交 应用 Northern 杂交技术可以了解特定基因的

表达情况。

原位杂交 在 Southern 杂交技术的基础上发展起来的 菌落（或噬菌斑）杂交，其方法是将培养皿中的菌落印迹到 NC 滤膜上，溶菌，使变性的 DNA与滤膜牢固结合。然后按照 Southern 杂交的方法进行分子杂交和显影。常用于目的克隆（菌落）的筛选。（见下图） 细胞和组织的原位杂交首先要制备组织样品，步骤包括组织固定、脱水、石蜡包埋和切片。转移至滤膜并在原位进行杂交，放射性同位素标记的

DNA 或 RNA探针与待测 DNA 的互补配部位，可通过放射性自显影显示出来。

PCR 技术 PCR ： polymerase chain reaction 的缩写 叫做聚合酶链式反应技术 1985 年，美国 Kerry Mullis 发明 荣获 1993 年诺贝尔化学奖 原理：引物延伸反应产生的子链 DNA经热变

性为单链后，有可作为模板，在引物和 DNA聚合酶的作用下指导新的子链的合成。

需要：引物（一对）；酶（如 TagDNA 聚合酶）； dNTP ；缓冲液；水（超纯水）

PCR扩增的几个方面 关于扩增参数：①启动温度②循环 “变性”

（ 94℃； 30′ ）→“退火”（温度由引物确定；30′ ）→“延伸”（ 72℃；时间由扩增的长度而定）。注：退火温度 [±4×(G+C)+2(A+T)]③循环次数 25~30次④最后延伸时间要长一些。

优点和问题：可对痕量 DNA 进行大量扩增。 TagDNA 聚合酶复制忠实性差，错误掺入率为 2×10-4 ， 30轮后可达 0.25% ，比 Klenow 酶高 4倍。

应用 ① gene扩增②探针制备③临床④法医学

RFLP 和 RAPD 技术 RFLP ：限制性片段长度多态性（ restriction fr

agment length polymorphism ） DNA 分子（来源不同）；基因组 DNA （不同

生物）→长度不同的限制性片段。对于一种酶和一种 DNA 来说，所产生的限制性片段都是特异的，所以，这些片段的电泳图谱可以作为这种 DNA 的“指纹”，故又叫指纹分析。

RAPD ：随机扩增多态性，用于 DNA“个性” DNA 样品→ PCR扩增→得到一组数目及长度

不同的 DNA 片段→电泳， EB 染色→电泳图谱

DNA 序列分析 Maxam-Gilbert 和 W.Gilbert 建立 基本原理： DNA 片段（末端带有放射性标记）→特定位点断裂→一组长度不同的片段→电泳自显影 X光片上显示谱带→读出 DNA 碱基顺序。

步骤：化学降解时，将 DNA 样品分为四份，放入不同的反应系统中。见下图

双脱氧 -M13 体系 DNA 序列分析法 待测片段克隆到M13载体上，其优点①制备足够的 DNA 片段②使用一种通用引物③ M13复制产生的单链 DNA释放到细胞外。

目的基因的分离 通常是先建立基因文库，然后从基因文库中筛选和鉴定含目的基因的克隆。 基因文库（ gene library ）：是指含有插入片段的重组体 DNA 分子的一个集合体，这些分子加在一起就构成了一个生物体的整个基因组。

（一）基因组文库的建立 cDNA 文库：从某一生物或特定器官和组织中

获得的总 DNA ，经反转录产生 cDNA ，以 cDNA 构建的克隆群体就叫这种生物（或器官和组织）的 cDNA 文库。

主要优点：⑴筛选目的基因较容易，因为一个完全 cDNA 基因文库所含的克隆数，比一个完全的基因组 DNA 文库所含的克隆数要少的多⑵ cDNA 克隆中不存在内含子序列，这有利于在原核细胞中表达。

（二）基因组文库（ genome bank ） 基因组文库即 gDNA 文库，是指包含某种生物的

基因组全部 DNA 的基因文库。哺乳类的基因文库多用λ 噬菌体构建，计算得到的噬菌斑数目可确定基因文库是否包括了 99% 的基因组 DNA 。

基因组文库大小： N=㏑（ 1-p ） /㏑（ 1-f ） N ：所需的重组体数目； p ：是从一个基因文库中分离得到的单拷贝基因的 概率； f ：是外源 DNA 片段平均大小占整个基因组长度的 百分数。该公式还可简化为 N=4.61×G/f ，其中 G 是基因组的大小

本章小结1. 基因工程常用技术凝胶电泳、细菌的转化和转染、核酸分子杂交、定点突变、 PCR 、 RFLP 、 RAPD 、 DNA 序列分析、目的基因的分离和转基因植物转基因动物等技术2. 细菌的转化和转染3. 定点突变的诱发4. 核酸分子杂交Southern 杂交、 Northern 杂交、原位杂交5. DNA 序列分析双脱氧 -M13 体系 DNA 序列分析法6. 基因组文库的建立