第三节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化

一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性电离（二）蛋白质的胶体性质（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（四）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的呈色反应

（一）蛋白质的两性电离蛋白质是由氨基酸构成的，其两端及

侧链都含有可解离的酸性基团或碱性基团，因此在不同 pH 的介质中，蛋白质的带电状态就不同。

PrNH3

+

COOHPr

NH3+

COO-Pr

NH2

COO-

OH-

H +

OH-

H +

¼æÐÔÀë×ÓpH=pI

ÑôÀë×ÓpH<pI

ÒõÀë×ÓpH>pI

蛋白质的等电点（ pI ） • 概念概念：当蛋白质溶液处于某一 pH 时，蛋

白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。

• pI 是蛋白质的特征性常数。• 利用蛋白质两性电离的性质，可通过电

泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。

• pH > pI 带负电荷 • pH < pI 带正电荷 • 体内多数蛋白 pI 为 5.0 左右 ， pH 为 7.45 时 多数蛋白带负电荷。• 如 pI 偏于碱性－碱性蛋白质 鱼精蛋白 组蛋白• 如 pI 偏于酸性－酸性蛋白质 胃蛋白酶 丝蛋白

（二）蛋白质的胶体性质

• 颗粒大小：在 1 ～ 100nm 之间。属胶体。因此溶于水，成为亲水胶体。

• 稳定亲水胶体的因素： 水化膜 表面电荷 不通透性：半透膜 毛细血管壁

- - ---

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-++

++

+

+

++ +

+

+

+

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--

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--

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（三 ) 蛋白质的变性、沉淀和凝固1. 变性（变性（ denaturationdenaturation ））• 概念概念 : 在某些理化因素作用下，蛋白质

分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。

• 变性本质：变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。

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核糖核酸酶

• 变性因素：物理因素：加热、加压、超声波、 紫外线化学因素：胍、脲、有机溶剂、 强酸强碱、 SDS - 巯基乙醇、 重金属离子 生物碱试剂

•蛋白质变性后的理化和生物学性质改

变： 溶解度↓ 生物活性丧失及易被蛋白酶水解 粘度↑ 结晶能力消失、•应用：消毒灭菌

低温保存生物制剂

• 复性 (renaturation) ：蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性。

• 不可逆变性2. 沉淀 (precipitation)

• 蛋白质的沉淀：蛋白质的肽链相互聚集而从溶液中析出的现象。

+ +++

+

++

- --

-

- --+

-

蛋白质胶体颗粒的沉淀

（沉淀）（疏水胶体） （疏水胶体）

• 蛋白质的凝固作用（ coagulation ）• 蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，

仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将 pH

调至 pI ，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用。

（四）蛋白质的紫外吸收

•波长： 280nm

•引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸和酪氨酸 ( Trp, Tyr) 的共轭双键。

•可用于蛋白质的定量

（五）蛋白质的呈色反应• 茚三酮反应：肽和氨基酸的自由氨基与茚三酮生成蓝紫色化合物。

• 双缩脲反应：蛋白质和肽类分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈紫红色。

• 呈色反应可用于蛋白质的定性和定量。

二、蛋白质的分离和纯化（一）丙酮沉淀及盐析（二）电泳（三）透析（四）层析（五）分子筛（六）超速离心

（一）丙酮沉淀及盐析原理：破坏亲水胶体的两个稳定因素。• 丙酮沉淀： 0 ～ 4℃， 10倍于蛋白质体积 的丙酮，沉淀后立即分离。• 盐析：将大量中性盐（如硫酸铵）加到 蛋白质溶液中，破坏蛋白质在水 溶液中的稳定因素，而使之从溶 液中沉淀析出的现象。

（二）电泳（ electrophoresis ）

蛋白质在电场中可向其所带电荷相反的方向移动，这种现象叫电泳。

由于不同的蛋白质带电多少、分子量大小及分子形状不同，因此在电场中泳动的速度就不同，从而可将蛋白质分离开来。

应用：分离蛋白质和测分子量

（三）透析（ dialysis ）蛋白质是高分子化合物，不能透过半

透膜。将蛋白溶液装入用半透膜制成的透析袋中，可将蛋白质溶液中的小分子化合物除去，这种方法叫透析。

如在袋外放吸水剂（如聚乙二醇）还可达到浓缩的目的。

应用：除盐和浓缩

超 滤

利用超滤膜在压力下使大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤。

超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。

（四）层析（ chromatography ）

离子交换层析：根据蛋白质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离目的。

应用：分离蛋白质

阴离子交换树脂

（五）分子筛

根据多孔载体对不同大小，形状的蛋白分子的排阻能力不同而将各个组分分开的一种层析，又称凝胶过滤层析。

应用：分离蛋白质、除盐

（六）超速离心（ ultracentrifugation ）

•不同蛋白质的密度与形态各不相同，在离心力场中沉降的速度也不同，从而将其分离。

•蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（ S ）表示。

• S与蛋白质大体上和分子量成正比关系。

• S与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系数小－沉降快；而疏松颗粒的摩擦系数大－沉降慢。

•应用：蛋白质的分离纯化和测分子量。

多肽链 AA序列分析改进的 Sanger法

1. 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成。2. 测定多肽链的 N-端与C-端的氨基酸残

基。3. 把肽链水解成肽段，再分离纯化肽段。4. 测各肽段的氨基酸排列顺序。5. 经过组合排列对比，得出完整肽链中氨

基酸顺序。

水解肽链的方法及特征裂解剂 裂解位点胰蛋白酶 Lys 、 Arg （ C ）胰凝乳蛋白酶 Phe 、 Tyr 、 Trp （ C ）弹性蛋白酶 Ala 、 Gly 、 Ser 、 Val （ C ）胃蛋白酶 Phe 、 Trp 、 Tyr （ N ）溴化氰 Met （ C ）羟胺 Asn—Gly

通过核酸推演的方法

分离编码蛋白质的基因

测DNA序列

排列出 mRNA的序列

按照三联体密码推演出氨基酸的序列

本次课重点蛋白质的三、四级结构蛋白质的 pI维持蛋白质胶体稳定的因素蛋白质的变性蛋白质的紫外吸收蛋白质分离纯化的方法及基本原理

复 习 题1. 名词解释：肽单元 模序 结构域 蛋白质的一 、二、三、四级结构2.蛋白质的基本组成单位是什么？有多少种？按侧链的结构和功能不同可分为几类？各包括哪些氨基酸？3.蛋白质的二级结构有几种？各有何特征，

由什么化学键维持？