高效液相色谱法：高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方

法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：高压： 150-350*10150-350*105 5 PaPa 高效：大于高效：大于 3000030000 塔板塔板 // 米米 高灵敏：高灵敏： 1010-9-9g g （紫外检测）、（紫外检测）、 1010-11-11g g （荧光检测）（荧光检测）

第十章 高效液相色谱分析法 第十章 高效液相色谱分析法 HPLCHPLC （（ High Pertormance Liquid ChromatographHigh Pertormance Liquid Chromatograph

yy ，，））

§10-1§10-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点

一、一、 HPLCHPLC 与与 GCGC 差别差别 11 ．分析对象的区别．分析对象的区别 GCGC ：适于能气化、热稳定性好、且沸点较：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的占有机物的 20%20% HPLCHPLC ：适于溶解后能制成溶液的样品（包括：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的 80%80%

22 ．流动相差别的区别．流动相差别的区别GCGC ：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。力，只与固定相有相互作用。 HPLCHPLC ：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和变流动相极性和 pHpH 值也对分离起到调控作用，当值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。也可以增大分离选择性。33 ．操作条件差别．操作条件差别GCGC ：加温操作：加温操作HPLCHPLC ：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）

11 ．贮液罐（滤棒，可滤．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质）去颗粒状物质）22 ．高压泵（输液泵）．高压泵（输液泵）33 ．进样装置．进样装置44 ．色谱柱——分离．色谱柱——分离55 ．检测器——分析．检测器——分析66 ．废液出口或组分收集器 ．废液出口或组分收集器 77 ．记录装置．记录装置

二、高效液相色谱仪流程图二、高效液相色谱仪流程图

三、三、 HPLCHPLC 的特点和实际应用的特点和实际应用

11 、利用其高柱效（、利用其高柱效（ n=10n=1044 片片 // 米），有效分离极复米），有效分离极复杂 杂

体系中的痕量组分。体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质反相色谱分离水溶液中的物质 -------- 生化物质。生化物质。22 、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等）基酸、常见阴阳离子等）33 、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。离高分子化合物。44 、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。合物。

§10-2 §10-2 基本理论和条件选择基本理论和条件选择

基础基础理论理论

热力学理论：塔板理论——平衡理论热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——动力学理论：速率理论—— VanderVander 方方

程程一、塔板理论一、塔板理论

理理 nLH / 22

21

2 )(16)(54.5)(W

t

W

ttn RRR

理

effeff nLH / 2

21

'2

'

)(54.5)(16W

t

W

tn RReff

0

'

t

tk R

2)1

(k

knneff

理

（填充柱）： uCuBAHGC /

（毛细管柱）或 uCuBH /

dpA 2 dpA

gm DDB 22 gR DBtB ，

M

TD

TD gg 或

llgsm CCCCCC l

l D

dfC

2

T

DL

1.1.

二、速率理论（与二、速率理论（与 GCGC 对比）对比）

22 ）涡流扩散项及其影响）涡流扩散项及其影响

（忽略纵向扩散项后）： uCAHHPLC

mDB 2T

Dm

相忽略大低，流动相柱温 BT

RtnHu

uHscmu

，但柱效，

时，/1

min/1mlu 选择兼顾柱效和分析时间，

2.2.

讨论：讨论： 11 ）流动相流速对）流动相流速对 HPLCHPLC 板高的影响（与板高的影响（与 GCGC 对比）对比）

dpA 2 dpA

柱效，， nHAdp

33 ）传质阻抗项及其影响 ）传质阻抗项及其影响 ）（忽略固定相传质阻抗smmssmm CCCCCC

忽略固定相传质阻抗

态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静

uCuCAHHPLC smm ：

msmm D

dpCC

2

mD

dpC

2

T

Dm

柱效，nHCdp

柱效，nHDm

，柱阻，

，但易产生气泡

m

m

DT

CDT

11 ． ．

2

2

1

1

4 k

knR

uCAH 流动相采用粘度小、低流速的

匀的固定相：采用粒度小、填充均n

'

'

'

'

1

2

1

2

1

2

1

2

R

R

R

R

V

V

t

t

k

k

K

K

温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性

0

'

t

t

V

VK

VC

VC

W

Wk R

m

s

mm

ss

m

s

小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k

三、 影响分离的因素三、 影响分离的因素

1. 1. 固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （（ dp≤10μmdp≤10μm ）） 首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱2. 2. 流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 约约 1ml/min1ml/min 3. 3. 柱温的选择：柱温的选择： 选室温选室温 252500CC左右左右

四、四、 HPLCHPLC 法中分离条件的选择法中分离条件的选择

一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（ LSCLSC ） ） (liquid-solid adsorption chromatography)(liquid-solid adsorption chromatography)二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（ LLCLLC ）） (liquid-liquid partition chromatography,(liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatographychemical bonded phase chromatography三、离子色谱法（三、离子色谱法（ ICIC ）） （（ ion-exchange chromatography and ion-exchange chromatography and ion pair chromatography)ion pair chromatography)四、空间排阻色谱法（四、空间排阻色谱法（ SECSEC ）） （ （ steric exclusion chromatographysteric exclusion chromatography

§10-3§10-3 各类高效液相色谱法简介各类高效液相色谱法简介

11 ．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异 活性中心能力的差异

分离前提：分离前提： KK不等或不等或 kk不等不等

)1(0m

R V

SKtt

mV

SKk

一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（ LSCLSC ）） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂 流动相为液体，固定相为固体吸附剂

22 ．固定相：与．固定相：与 LCLC 比，固定相粒径不同（比，固定相粒径不同（ <10<10μmμm ））

（（ 22 ）高分子多孔小球：）高分子多孔小球： YSGYSG

原理：吸附原理：吸附 ++ 分配分配 蒹小孔凝胶作用蒹小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物适用：分离弱极性化合物

（（ 11 ）硅胶 ）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶 无定形 全多孔硅胶 无定形 YWG 5~6YWG 5~6μm 5×10μm 5×1044

球形 球形 YQG 3~4YQG 3~4μm 8×10μm 8×1088

堆积硅珠 堆积硅珠 YQG 3~4 YQG 3~4 μm 8×10μm 8×1088 理想理想 原理：吸附原理：吸附 特点：峰易拖尾特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物

33 ．流动相：底剂（烷烃）．流动相：底剂（烷烃） + + 有机极性调节剂 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 例： 正己烷或庚烷 + + 氯仿氯仿 - - -- - -

44 ．影响．影响 kk的因素：与固定相性质和流动相性质有关的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性↑，洗脱能力↓，溶质分子极性↑，洗脱能力↓， k↑k↑，， ttRR↑↑ 溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，溶剂系统极性↑，洗脱能力↑， k↓k↓， ， ttRR↓↓ 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间55 ．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱．出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱66．硅胶吸水量↑，．硅胶吸水量↑， LSC→LLCLSC→LLC• 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大• 硅胶含水量硅胶含水量 >17% >17% 分配色谱 硅胶失活→载体分配色谱 硅胶失活→载体 吸附的水→固定液吸附的水→固定液

11 ．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异22 ．固定相：载体．固定相：载体 ++固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性→固定液——极性→ NLLCNLLC 固定液——非极性→固定液——非极性→ RLLCRLLC33 ．． 正相色谱—— 固定液极性 正相色谱—— 固定液极性 > > 流动相极性流动相极性 （（ NLLNLL

CC ）） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 反相色谱——固定液极性 < < 流动相极性流动相极性（（ RLLCRLLC ）） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分适于分离非极性组分

二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（ LLCLLC ））

（一）常规化学键合相（一）常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面

11 ．分离机制：分配 ．分离机制：分配 + + 吸附（以吸附（以 LLCLLC 为基础）为基础） 22 ．特点：．特点： 不易流失不易流失 热稳定性好热稳定性好 化学性能好化学性能好 载样量大载样量大 适于梯度洗脱适于梯度洗脱

44 、化学键合固定相、化学键合固定相

（二）反相键合相固定相（二）反相键合相固定相11 ．分离机制：疏溶剂理论 ．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强，正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑ ， 作用时间↑ ， k↑k↑，组分，组分 ttRR↑↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱，反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， 作用时间↓， k↓k↓，组分，组分 ttRR↓↓22 ．固定相：．固定相：极性小的烷基键合相极性小的烷基键合相 CC88 柱，柱， CC1818 柱（柱（ ODSODS柱——柱—— HPLCHPLC约约 80%80%问题）问题）33 ．流动相：．流动相：极性大的甲醇极性大的甲醇 -- 水或乙腈水或乙腈 -- 水水 流动相极性 流动相极性 > > 固定相极性固定相极性 底剂 底剂 + + 有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂） 例：水 例：水 + + 甲醇，乙腈，甲醇，乙腈， THFTHF

44 ．流动相极性与．流动相极性与 kk的关系：的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，流动相极性↑，洗脱能力↓， k↑k↑，组分，组分 ttRR↑↑55 ．出柱顺序：极性大的组分先出柱．出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱66．适用：非极性．适用：非极性 ~~中等极性组分（中等极性组分（ HPLC80%HPLC80%问题）问题）

（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱11 ．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力诱导力、或氢键作用力22 ．固定相：极性大的氰基或氨基键合相．固定相：极性大的氰基或氨基键合相33 ．流动相：极性小（同．流动相：极性小（同 LSCLSC ）） 底剂 底剂 + + 有机极性调节剂 有机极性调节剂 例：正己烷 例：正己烷 + + 氯仿氯仿 -- 甲醇，氯仿甲醇，氯仿 -- 乙醇乙醇

44 ．流动相极性与．流动相极性与 kk的关系：的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分流动相极性↑，洗脱能力↑，组分 ttRR↓↓，， k↓k↓55 ．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱出柱极性大的组分后出柱66．适用：．适用：• 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似分离物质也相似• 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等分析极性大物质、糖类等

11 ．反相离子对色谱法（．反相离子对色谱法（ IPCIPC 或或 PICPIC ）） 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加与其中的反离子形成中性离子对，增加 kk和和 ttRR，以改善分离，以改善分离

11 ）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季胺盐→分析酸四丁基季胺盐→分析酸22 ））影响影响 kk 的因素的因素aa ．与．与 mm 的极性有关（同反相色谱）的极性有关（同反相色谱）bb ．与．与 RR 的链长有关：的链长有关： R↑R↑ 长，极性↓小，长，极性↓小， ttRR↑↑ ，， kk↑ ↑

33 ）适用：较强的有机酸、碱）适用：较强的有机酸、碱

三、离子色谱法（三、离子色谱法（ ICIC ））

22 ．反相离子抑制色谱．反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相 pHpH 值，抑制值，抑制组分解离，增加其组分解离，增加其 kk和和 ttRR，以达到改善分离的目的，以达到改善分离的目的

11 ）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pHpH 一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液22 ）） kk的影响因素：的影响因素：与流动相极性有关，还与与流动相极性有关，还与 pHpH 值有关值有关 选择流动相：应同时考虑极性及选择流动相：应同时考虑极性及 pHpH 值 值 酸性物质——加入酸酸性物质——加入酸 HAc tHAc tRR↑↑，， k↑ k↑ 碱性物质——加入碱碱性物质——加入碱 NHNH33·H·H22O tO tRR↑↑，， k↑ k↑ 调节调节 pHpH范围：范围： 3.0~8.03.0~8.0 pH>8.0 pH>8.0 破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合 pH<3.0 pH<3.0 腐蚀柱子腐蚀柱子33 ）适用：极弱酸碱物质）适用：极弱酸碱物质 pH=3~7pH=3~7 弱酸；弱酸； pH=7~8pH=7~8弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物

22 ．对流动相的要求：．对流动相的要求：

11 ）与固定液不反应）与固定液不反应22 ）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度 k=1~10k=1~10 k=2~5 k=2~5 最理想的最理想的33 ）与检测器匹配：）与检测器匹配： UVUV （常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学荧光，电化学44 ）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈））使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气使用前过滤、脱气

33 ．洗脱方式 ．洗脱方式

11 ）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱））等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似类似 GCGC 的等温度洗脱的等温度洗脱22 ）梯度洗脱：）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类在一定分析周期内不断变换流动相的种类 和比例和比例 即不断改变其极性（两个泵） 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似 GCGC 的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）

§10-4 §10-4 高效液相色谱仪高效液相色谱仪

11 ．泵：．泵： 恒压泵：流量精度不稳恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用恒流泵：常用22 ．进样装置．进样装置 11 ）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） ）隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） GCGC 系统压力较小，可以系统压力较小，可以 HPLCHPLC 系统压力太大，必须停泵进样（早期）系统压力太大，必须停泵进样（早期） 22 ）阀进样：不必停泵，六通阀）阀进样：不必停泵，六通阀

液相色谱液相色谱

33 ．色谱柱：直径．色谱柱：直径 4~6mm,4~6mm,柱长柱长 10~30cm10~30cm 柱效评价：色谱系统适应性试验柱效评价：色谱系统适应性试验 RR，， nn ，， ffss（拖尾因子）（拖尾因子） 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗柱再生：维护、保养、柱子的冲洗44 ．检测器．检测器 11 ）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 22 ）荧光检测器：只能分析自身发光的物质）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高灵敏度高 33 ）示差折光检测器：利用折光率的差别）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格灵敏度低，温度要求严格 44 ）电化学检测器）电化学检测器 55 ）化学发光）化学发光