課程名稱 : 進階實驗課程 B—細胞科技實驗               學分數 :1學分 ( 實驗 )負責教師 : 黃昭祥、楊堉麟、葉怡玲                         授課時間 :96/08/04, 05, 11, 12教室 : 尖端生物技術科技人才培育計畫實驗室                                          

主題：•細胞轉染技術與分析 •運用流式細胞儀觀察細胞程式性死亡

PART II

96 well( 一 , 二組 )1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B P NRKCONNF-kB

NRKCON

C-Myc

NRKBMP

2 NF-kB

NRKBMP

2C-

Myc

BMP:

1ug

C

D

E

F P NRKCONNF-kB

NRKCON

C-Myc

NRKBMP

2 NF-kB

NRKBMP

2C-

Myc

BMP:2ug

G

H

96 well( 三 , 四組 )1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B P NRKCONNF-kB

NRKCON

C-Myc

NRKBMP

2 NF-kB

NRKBMP

2C-

Myc

BMP:4ug

C

D

E

F P M13CONNF-kB

M13CON

C-Myc

M13BMP

2 NF-kB

M13BMP

2C-

Myc

BMP:1ug

G

H

96 well( 五 , 六組 )1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B P M13CONNF-kB

M13CON

C-Myc

M13BMP

2 NF-kB

M13BMP

2C-

Myc

BMP:2ug

C

D

E

F P M13CONNF-kB

M13CON

C-Myc

M13BMP

2 NF-kB

M13BMP

2C-

Myc

BMP:4ug

G

H

訊息誘導出的轉錄因子（蛋白質）

SEAP 分泌型鹼性磷酸酵素

SEAP 基因

BMP-2基因產物誘導 SEAP基因表現 （本次實驗）

BMP-2 基因

Signal transduction

BMP2

receptor

pMyc-SEAP

Myc element

訊息誘導出的轉錄因子（蛋白質）

SEAP 分泌型鹼性磷酸酵素

SEAP 基因

BMP-2基因產物誘導 SEAP基因表現 （本次實驗）

BMP-2 基因

Signal transduction

BMP2

receptor

pMyc-SEAP

Myc element

實驗設計用意探討 BMP-2基因表現是否可以誘導特定轉錄因子表現。

SEAP DETECTION SYSTEM

WHY

原理簡介

WHY 冷光 better than 螢光 ？LOW BACKGROUND:HIGH S/N RATIOHIGH SENSITIVITY (due to above reasons)EVEN BETTER THAN ISOTOPE

偵測波長決定偵測靈敏度

靈敏

Gamma-ray X-ray 冷光 螢光 可見光

偵測波長決定偵測解析度

解析度

Gamma-ray X-ray 冷光 螢光 可見光

0.1mm1nm0.1nm

EMS FMS LMS

m

Pathway Profiling System Detection system一 . 材料 :Assay Buffer , chemiluminescent enhancer , 5X

Dilution Buffer , 25mM CSPD （冷光受質） Positive control placental alkaline phosphatase  二 . 試驗前配置的working solution : 1. 1X Dilution Buffer : 以 Mini-Q water 將 5X

Dilution Buffer 做 1:5 稀釋2. 1.25mM CSPD Substrate working solution : 將

25mM CSPD chemiluminescent substrate 與chemiluminescent enhancer 做 1:19 稀釋

各重要成分介紹

  三 . 步驟 :1. 將 15l sample 加到 96-well plates 的每個 well 裡2. 再加入 45 l 的 1X Dilution Buffer 至每個 sample well 中

，混合均勻3. 將 step 2 的 diluted sample 在 65Oc的水浴漕裡，反應 30分鐘

4. 反應 30 分鐘後，再將 96-well plate 放在冰上 2~3 分鐘回溫5. 再加入 60l 的 Assay buffer 至每個 sample well 裡，反應

5 分鐘6. 再加入 60l 的 diluted CSPD Substrate 至每個 sample

well 中，反應 10 分鐘7. 並在 step6 之後的 30 分鐘內，以 x-ray 方式壓片 /洗片（定影 , 顯影）

Why heating 65’C 考

Why Assay buffer Rx 5 ‘ 考

預期結果P NRK

CONNF-kB

NRKCON

C-Myc

NRKBMP

2 NF-kB

NRKBMP

2C-

Myc（第一組為例）

結論？

結論？

結論？

結論？

結論？

預期結果

結論？

（第一組為例 BMP: 1ug ）

（第二組為例 BMP: 2ug ）

（第三組為例 BMP: 4ug ）

P NRKCONNF-kB

NRKCON

C-Myc

NRKBMP

2 NF-kB

NRKBMP

2C-

Myc

使用細胞NRK: NORMAL RAT KIDNEY (fibroblast

cells)MDCK: MADIN DARBY CANINE KIDNEY

(tubule)M13: MURINE MESANGIAL CELLS

Apoptosis 組別實驗內容規劃.壹 NRK 、 NRK+ 植物萃取物 A

.貳 NRK+ 植物萃取物 B 、 NRK+H2O2

.參 NRK+pCMV-BMP2

.肆 M13 、 M13 +BSA

.伍 MDCK 、 MDCK+Mannitol 、 MDCK+H2O2

.陸 M13 +H2O2

步驟1. 首先將上清液移至 15ml 離心管。2. 加入 1ml 的 PBS wash 細胞，勿沖洗避免細胞剝落。3. 將上清液移至步驟 1 的離心管。4. 加入 1ml 的 Tyrpsin 在 37℃ 反應 5min 。5. 加入 3ml 的 PBS 將細胞洗下並移到步驟 1 的離心管。6. 加入 3ml 的將細胞徹底洗下並移到步驟 1 的離心管。7. 使用 2000 rpm 離心細胞 5min 後，再以同轉數再離心 1min 。8. 倒去上清液，並可使用 200μl 的 Tip 吸乾殘餘的 PBS ，移入 Flow

管。9. 加入 100uL 染劑 , 於 RT 培養 30 分鐘 , 持續震盪10. 加入 200μl 的 Binding buffer 並充分混合均勻。11. 上機分析，分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。 Read FL-1 (Annexin) and FL-2 (PI)

試劑置備與參數設定staining sol’n配製：  32μl annexin V-FITC + 800 μL binding

buffer + 32 μL Propidium iodine(PI) = 600μl Flow cytometer設定參數P1 - FSC LinP2 - SSC LinP3 – FL-1 (Annexin-V) LogP4 – FL-2 (PI) Log

Detection of ROS

Introduction

盡可能避光

H2DCFDA

IntracellularEsterase

Oxidized by ROS

黃綠螢光

Detect by Flow cytometer

ROS DETECTION PRINCIPLE

1. 刺激時間終了後 此盤刺激過的細胞不做任何變動 並加入約 50uM/ml （ 1mM stock solution 加 100μl 至各 well ）的 H2DCF-DA 在 37℃ 反應 30min 。

2. 把上清的 medium 移到 15ml 離心管 。3. 使用 2ml PBS wash 細胞然後把 PBS 移到步驟 2 的離心管。4. 再加入 2ml PBS 並在室溫反應 10min 。5. 將此 PBS 移到步驟 2 。6. 加入 0.5ml trypsin 在 37℃ 反應 5 min 。7. 然後使用步驟 2 的離心管內的 PBS+Medium 的混合液沖洗細胞並移到步驟 2 。8. 以 2000 rpm 離心 5min 。9. 倒去上清液 , 再加入 2 ml PBS 並 mix 細胞，使細胞打散。10. 再以 2000 rpm 離心 5min 。11. 倒去上清液 , 然後再加入 1 ml Flow cytometer 專用的 PBS 並混 合均勻。12. 將步驟 11 移動到 Flow cytometer 專用的試管13. 上機分析上機分析，分析前請再次混合均勻避免細胞沉澱。

實驗步驟

NRK

CON CON+DCFH CON+DCFH

植物萃取物A + DCFH

第 1 組 實驗組別規劃

植物萃取物A + DCFH

植物萃取物A + DCFH

植物萃取物 A 對纖維母細胞氧化壓力的影響

NRK

CON CON+DCFH CON+DCFH

第 2 組

植物萃取物B + DCFH

植物萃取物B + DCFH

植物萃取物B + DCFH

植物萃取物 B 對纖維母細胞氧化壓力的影響

NRK

CON CON+DCFH CON+DCFH

pCMV-BMP2+DCFH

第 3 組

BMP-2 基因表現對纖維母細胞氧化壓力的影響

pCMV-BMP2+DCFH

pCMV-BMP2+DCFH

M13

CON CON+DCFH BSA+DCFH

H2O2+DCFH BSA+DCFHH2O2

第 4 組 ( 只做上面一排 )

H2O2 與白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響

MDCK

CON CON+DCFH Mannitol+DCFH

CON+DCFH Mannitol+DCFH

CON

第 5 組

高滲透壓對遠端腎小管細胞氧化壓力的影響

M13

CON CON+DCFH BSA+DCFH

H2O2+DCFH BSA+DCFHH2O2

第 6 組 ( 只做下面一排 )

高 H2O2 或白蛋白對腎絲球細胞氧化壓力的影響

預期結果

ControlDCFH

Treatment +DCFH

( 增加 ROS) ( 不增加 ROS)