大肠杆菌杂交系统及应用

演讲人：冯燕丽

2003 年 4 月 25日

原理原理依赖转录激活过程；

报告基因的表达水平与 bait （已知蛋白）与 target （已知蛋白）蛋白间作用强度呈正相关性；

双杂交系统：筛选已知相互作用的蛋白 或与特定蛋白作用的未知蛋白 生化方法：需要纯化蛋白或抗体

方法方法材料： bait 、 target 载体 报告细胞 其他必要因素 要求： bait 载体， pBT , 3.1kb, 编码全 长细菌噬菌体 cl 蛋白 target 载体 ,pTRG, 4.3kb, 控制 RNA 多聚酶 亚基和连接区的转录 报告细胞 ,XL1-Blue MRF’, 无任何限

制系统 , 与 cDNA 文库建立方法兼容

已知蛋白 (bait) 全长细菌噬菌体蛋白 cI cI （ N- 端 DNA 结合区和 C- 端二硫基） 结合位置：在操纵子序列的上游

目标蛋白（ target ） RNA 多聚酶 亚基 N- 端

报告细胞中进行 :

bait target 作用后启动两个报告基因 ampr 、 lacZ

具体 : bait 与 target 作用时，其恢复和稳定 RNA 多聚酶

启动子的结合，激活报告基因（ AmpR ）转录 ； 报告基因 半乳糖苷酶基因，同一启动子，通过 可见的表型变化来证实 bait 与 target 间的相互作用

另一系统另一系统依赖信号转导途径的重建；利用两蛋白间的作用导致片断间的功能

性互补，从而引起 cAMP 合成。 cAMP再激活分解代谢操纵子（乳糖或麦芽糖）转录，产生可见的特征性的表型变化。

材料： DHP1

（ E.coli cya 菌株，腺苷酸环化酶缺失型）

表达载体 pCm-AHL1

pT25p 、 pT18( 含两个互补片断 T25 、 T18 ，组成 Bordetella pertussis 腺苷酸环化酶的媒触区）

方法： 1 、设计功能互补的 CyaA 的 T25 和 T18

片断； pT25p 、 pT18 共转 DHP1 ； 在加入 maltose 中培养； 检测：全表达呈红色，不表达呈白色 2 、用功能互补反应在体内检测蛋白间作 用

表 1 Analysis of complementation in DHP1 strain

Plasmids Phenotype on MacConkey/maltose

None white

pCm-AHL1 red/24hr

pT25pT18 white/72hr

pT25pT18-zip white/72hr

pT25-zippT18 white/72hr

pT25-zippT18-zip red/24hr

表 2 Complementation between various chimeric protein

Plasmids Phenotype on MacConkey/maltose

pT25-TyrpT18 -Tyr red/40hr

pT25 -Tyr pT18 white/96hr

pT25pT18 –Tyr white/96hr

pT25-Tyr pT18 white/96hr

pT25-zippT18 –Tyr white/96hr

pT25-prp11pT18 –prp21 red/40hr

说明：互补受整合到 T25 、 T18 的多肽的特异性识别控制

嵌合蛋白的互补作用也依赖其配体的特定性作用

结论结论优势：与酵母双杂交系统的比较 传统酵母双杂交系统 BacterioMatch 双杂交系统

生长时间 6 天 1 天或过夜培养转化率 106 109

DNA 操作过程 额外转化过程到 E.coli 直接克隆筛选 DNA 分离 酵母染色体 DNA 与质粒共沉淀 简单、方便的制备 （去除了一步转化）克隆分析 繁琐的纯化后进行 直接进行 结果评价 假阳性多 假阳性少

* 决定细菌杂交系统能更灵敏检测难发现特定蛋白结合体 对待测蛋白的特性要求低，因此可适合更大蛋白库筛选

应用应用用于研究蛋白 -DNA 、蛋白 - 蛋白间相互

作用

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