第六章 基因的表达与调控第六章 基因的表达与调控(( 上上 ) ) －－原核基因表达调控－－原核基因表达调控

模式模式

第六章 基因的表达与调控第六章 基因的表达与调控(( 上上 ) ) －－原核基因表达调控－－原核基因表达调控

模式模式66 ．． 1 1 原核基因表达调控总论原核基因表达调控总论

66 ．． 2 2 乳糖操纵子与负控诱导系统乳糖操纵子与负控诱导系统66 ．． 3 3 色氨酸操纵子与负控阻遏系统色氨酸操纵子与负控阻遏系统

66 ．． 4 4 转录后调控转录后调控

•原核生物暴露在环境中，食物供应无保障，只有根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。它有一套准确地调节基因表达和蛋白质合成的机制。

• 如果每个基因等同翻译，每一个多肽应有相同的拷贝数。

• 结论是否定的，基因的表达是被控制的。有些蛋白质的数目相当固定，另一些则变化很大； 50 种核糖体蛋白数量十分稳定。糖酵解体系的酶数目也极恒定。DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶等代谢过程中十分必需的酶或蛋白质（组成型合成蛋白）的合成速率不受环境变化或代谢状态的影响。

• 而另一种类型则被称为适应型或调节型(adaptive or regulated) ，这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。例如，一般情况下，一个大肠杆菌细胞中只有 15 个分子的 β- 半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每个细胞中这个酶的量可高达几万个分子。其他参与糖代谢的酶，氨基酸、核苷酸合成系统的酶类，其合成速度和总量都随培养条件的变化而改变。

• 细菌中的基本调控机制有如下规律 : 一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这种“开 - 关” (on-off) 活性是通过调节转录来建立的，即通过调节 mRNA 的合成来实现的。

• 一个系统处于“ off” 状态时可能是本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞合成 1 ～ 2 个 mRNA 分子和极少量的蛋白质分子。必须明白所谓“关”实际的意思是基因表达量特别低，或者无法检测。

6 ． 1 原核基因表达调控总论

• 生物的遗传信息是以基因的形式储藏在细胞内的 DNA( 或 RNA) 分子中的。随着个体的发育， DNA 有序地将遗传信息，通过转录和翻译的过程转变成蛋白质，执行各种生理生化功能，完成生命的全过程。从 DNA到蛋白质的过程，叫做基因表达 (gene expression) ，对这个过程的调节就称为基因表达调控 (gene regulation 或 gene control) 。

•基因调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。要了解动、植物生长发育的规律、形态结构特征和生物学功能，就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念。

基因表达调控在两个水平上体现

• (1) 转录水平上的调控 (transcriptional regulation);

• (2) 转录后水平上的调控 (post-transcriptional regulation) ，包括①mRNA加工成熟水平上的调控 (differential processing of RNA transcript);②翻译水平上的调控 (differential translation of mRNA) 。

•对于原核生物，以营养状况 (nutritional status) 和环境因素 (environmental factor) 为主要的基因表达影响因素。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level) 和发育阶段 (developmental stage) 是基因表达调控的最主要手段，而营养和环境因素的影响力大为下降。

• 在转录水平上对基因表达调控取决于 DNA 的结构、 RNA 聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。

6.1.1 原核基因调控机制的类型与特点

•原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为负转录调控 (negative transcription regulation) 和正转录调控 (Positive transcription regulation) 。

负转录调控系统• 在负转录调控系统中，调节基因的物质是阻遏蛋白 (repressor) －－阻止结构基因转录。其作用部位是操纵区。它与操纵区结合，转录受阻。

• 负控诱导系统－－阻遏蛋白不与诱导物结合时，阻遏蛋白与操纵区相结合，结构基因不转录，阻遏蛋白结合上诱导物时，阻遏蛋白与操纵区分离，结构基因转录。

• 负控阻遏系统－－阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。

正转录调控系统• 在正转录调控系统中，调节基因的产物是激

活蛋白 (activator) ，激活蛋白结合与 DNA的启动子及 RNA 聚合酶后，转录才会进行。

• 在正控诱导系统中，诱导物的存在使激活蛋白处于活性状态，转录进行。

• 在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态，转录不进行。

细菌中的转录调控系统

可诱导调节•基因在特殊物质的作用下，由原来

关闭的状态转变为活化状态称为诱导调节。大肠杆菌在只含乳糖的培养基中开始时生长不好；等合成了利用乳糖的一系列酶，具备了利用乳糖作为碳源的能力时又开始生长。

•怎样获得这一能力的：在诱导物乳糖的诱导下开动了乳糖操纵子，表达它所编码的 3 个酶。这 3个酶使细菌可以利用乳糖作为碳源。象乳糖操纵子这类基因就是可诱导基因，这类酶被称为诱导酶，这个生化过程被称为酶的诱导合成。

可阻遏调节• 基因平时是开启的，处在产生蛋白质的工作

过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。

•比如大肠杆菌生活中必须有色氨酸，一般情况下，该操纵子开启，生产色氨酸合成酶基因表达正常。如果在细菌培养基中加入色氨酸，细菌可利用它来维持生活而不需要再合成，细菌就在 2-3min内关闭该操纵子。

•某一代谢途径最终产物合成酶的基因可以被这个产物本身所关闭。这种基因被称为可阻遏基因，这些酶被称为可阻遏酶，这个现象被称为可阻遏现象，这些起阻遏作用的小分子被称为阻遏物。

可诱导的操纵子•是一些编码分解代谢糖和氨基酸的蛋白的

基因。这些糖和氨基酸平时含量很少，细菌并不分解利用它们，而是利用一般的能源物质――葡萄糖的水解来提供能源，因此，这些操纵子常常是关闭的。一旦生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用乳糖作为能源时，就要打开这些基因。

可阻遏基因•它们是一些合成各种细胞代谢过程中

所必须的小分子物质 ( 如氨基酸、嘌呤和嘧啶等 ) 的基因，由于这类物质在生命过程中的重要地位，这些基因总是打开着的。只有当细菌生活环境中有充分供应时，才关闭这些基因，停止其合成。

弱化子对基因活性的影响•在这种调节方式中，起信号作用的

是有特殊负载的氨酰 -tRNA 的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰 -tRNA 的浓度。当操纵子被阻遏， RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段 DNA序列被称为弱化子。

•当基因转录使转录产物（ RNA ）到不同长度时，核糖体会在对应的 DNA位置上；此时 RNA可以形成某种形式的二级结构；由此决定延伸复合物的结合能力，从而决定基因能否继续转录。

细菌的应急反应• 细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿

－－氨基酸的全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌会产生一个应急反应－－停止包括生产各种 RNA 、糖、脂肪和蛋白质的几乎全部生物化学反应过程。

• 实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸 (ppGpp) 和鸟苷五磷酸 (pppGpp) 。产生这两种物质的诱导物是空载 tRNA 。

• 当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的 tRNA ，这种空载的 tRNA会激活焦磷酸转移酶，使 ppGpp 大量合成。

• ppGpp 的出现会关闭许多基因，以应付这种紧急状况。 ppGpp 影响 RNA 聚合酶与这些基因转录起始位点的结合，使基因被关闭。

• ppGpp 与 pppGpp 的作用范围十分广泛，它们影响一大批操纵子而被称为超级调控因子。

6 ． 2 乳糖操纵子－－负控诱导系统

•6.2.1 操纵子 : 操纵子模型是与特殊代谢途径有关的基因转录的协同调控模型。操纵子是基因表达和调控的单元，典型的操纵子包括 :

•结构基因：编码那些在某一特定的生物合成途径中起作用的、其表达被协同调控的酶。

•调控元件：如操纵序列，是调节结构基因转录的一段 DNA序列。

•调节基因：其产物能够识别调控元件，例如阻抑物，可以结合并调控操纵基因序列。

6 ． 2 ． 2 乳糖操纵子•大肠杆菌能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳源的酶只有当乳糖成为惟一的碳源时才会被合成。大肠杆菌乳糖操纵子 (lactose operon)包括 3个结构基因 :Z、 Y和 A 。这三个结构基因被同一个转录单元 lacZYA 所编码，它有一个启动子 Plac。

• 乳糖操纵子的这三个结构蛋白是作为一个多顺反子的 mRNA 一起表达的。 lacZYA 转录单元含有一个操纵基因位点 0la

c，它位于 Plac启动子 5’端的 -5至 +21之间。该位点可被乳糖阻抑物相结合。当该蛋白结合到操纵基因上时，便成为转录的强抑制物。

• 乳糖阻抑物被一个独立的调节基因 lac I所编码， lac I也是乳糖操纵子的一部分 ;lac I 位于 Plac的上游。

• lacZ 编码 β- 半乳糖苷酶，它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。

• lacY 编码半乳糖苷透性酶，它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁。

• lacA编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶。

• lacI基因编码乳糖阻抑物，当以同亚基四聚体形式存在对具有活性。它对于 lac操纵序列结合位点 0lac具有很强的亲和力，并且对 DNA 也有较高的亲和力。 Zac操纵序列位点由具有回文结构的 28bp碱基组成 (回文结构是指当一条链以 5’到 3’的顺序从左向右读对其 DNA序列与它的互补链也以 5’至 3’的方向从右向左读时完全相同 ) 。

• 操纵序列的这种反向重复对称正好与由四个相同亚基组成的乳糖阻抑物的内部对称相匹配。当乳糖缺乏时，阻抑物占据了操纵序列的结合位点， RNA 聚合酶不能通过操纵序列。

• 乳糖阻抑物和 RNA 聚合酶能够同时结合到乳糖启动子和操纵序列位点上。乳糖阻抑物使聚合酶结合到乳糖启动子上的能力增加了两个数量级。当乳糖阻抑物结合到0lac操纵序列上时，聚合酶是结合到相邻的Plac启动子序列上的，只是不能通过之。

• 当缺少诱导物时，乳糖阻抑物阻碍了几乎全部的 lacZYA 的转录而使之保持很低的转录水平。将乳糖加入细胞中后，细胞本身所含的低量的透性酶使它能吸收乳糖， β-半乳糖苷酶则催化一些乳糖转化为异乳糖。

•异乳糖可以作为诱导物结合到乳糖阻抑物上。从而引起阻抑物四聚体构象的变化，从而降低其对乳糖操纵序列的亲和力，乳糖阻抑物从操纵序列上脱离下来可以使聚合酶 (已经位于邻近的启动子上 )迅速开始 lacZYA 基因的转录。

•因此，加入乳糖或合成诱导物如异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 能非常迅速地刺激乳糖操纵子结构基因的转录。若随后将诱导物清除掉则会导致诱导性转录的立即终止，这是因为游离的乳糖阻抑物会立即重新占据操纵序列上的位点，而 lac ZYA RNA 的转录物是极不稳定的。

•Plac启动子不是强启动子。其原因是 Plac及其相关的启动子没有强的 -35序列，其中一些甚至只有弱的 -10 的共有序列。为了实现高水平的转录，它们需要一种特定的激活蛋白即 cAMP受体蛋白 (CRP) 的活化。

• cAMP即环式 AMP，其在生物表达调控过程中起着重要作用。葡萄糖的降解代谢会抑制一些操纵子的转录。 cAMP在细胞中的增加对这些操纵子的转录是有利的。葡萄糖降解物能抑制细胞内 cAMP产生。

• 这是因为 ATP是 cAMP的直接代谢前体，担任这种转化的酶是腺苷酸环化酶 (adenylcyclase) ，此酶受葡萄糖代谢降解物的直接抑制从而造成 cAMP不能产生。

• CRP也可称为分解代谢激活蛋白或 CAP是以以二聚体形式存在的。当葡萄糖存在时，大肠杆菌不需要像乳糖这样的替代碳源。因此代谢操纵子如乳糖操纵子通常不被激活。原因是当葡萄糖存在时会降低细胞内cAMP的水平， CRP自身不能独立与 DNA 结合；当葡萄糖缺乏时，大肠杆菌细胞内cAMP水平上升， CRP结合到cAMP上。 CRP-cAMP复合物可结合到紧邻 RNA 聚合酶结合位点上游的乳糖操纵子的启动子 Plac上游。能使 DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子 -RNA 聚合酶结构，使转录效率提高 50倍。

• 而阻遏物则是一个抗解链蛋白 (antimeltingpmte五 n) ，阻止形成开放结构，从而抑制 RNA 聚合酶的功能。

lac 操纵子小结• 通常情况（葡萄糖供应正常）阻遏蛋白与操纵序列

结合，基因不转录。• 细胞外的乳糖通过透性酶吸收到细胞内；细胞内的

β- 半乳糖苷酶将乳糖转变为异乳糖。异乳糖结合到乳糖阻抑物上使之从操纵序列上脱离，聚合酶迅速开始 lacZYA 基因的转录。这就是负控诱导。

• 然而，还需要细菌生长系统中缺少葡萄糖，使 cAMP含量增加，才有足够量的 cAMP与 CRP结合形成CRP-cAMP复合物结合于 Plac上游。使 DNA双螺旋发生弯曲，转录才可以有效地进行。

6.3 色氨酸操纵子与负控阻遏系统

• 色氨酸操纵子包括色氨酸合成途经中相关的 5 个结构基因。该操纵子编码一个转录单元，即从色氨酸启动子 Ptrp 和操纵基因位点Otrp向下游转录出 7kb的转录物。像许多涉及氨基酸生物合成的操纵子一样，色氨酸操纵子也具有当细胞内缺乏生物合成途径所需的色氨酸时，可使这些基因协同表达的进化系统。

色氨酸阻抑物•独立的操纵子 trpR编码的产物 --- 色氨酸阻抑物，能与色氨酸操纵子的操纵基因位点特异性相互作用。操纵基因序列是色氨酸阻抑物的结合位点。操纵基因序列有部分对称序列。操纵基因的部分对称序列与色氨酸启动子序列在 -21 和 +3碱基之间重叠。中心结合区是 18个碱基的回文结构。色氨酸阻抑物能结合色氨酸并且只有当它与色氨酸结合形成复合物后才能结合到操纵基因上。

• 阻抑物是含有两个亚基的二聚体。这一阻抑物二聚体含有一个中心区域和两个灵活的 DNA 解读头部 (DNA-reading head) ，这两个解读头部分别由一个亚基的羧基端形成。只有当色氨酸结合到阻抑物上时，这些解读头部才会处于证确的距离，侧链才会处于正确的构象从而与色氨酸操纵基因的 DNA连续的大沟相互作用 ，这样色氨酸操纵子所编码的酶的终产物，即色氨酸才可作为共阻抑物起作用，并且通过终产物抑制自身的合成。该阻抑物将转录的起始减少了大约70倍。

弱化子• 色氨酸操纵子对转录水平的调控与阻抑物有关。另外，如果在操纵基因和 trpE基因编码序列之间的一段序列缺失，会导致基本转录水平和活化 ( 解阻抑 )-- 转录水平的上升。该段序列称为弱化子，它位于 trpE起始密码子前面 162nt 的转录前导序列的 123 ～ 150位。弱化子是一个不依赖ρ因子的终止子区城，在一小段富含GC的回文结构之后是 8个连续的U残基。如果这段序列能在 RNA 转录物中形成发夹结构，就可以作为一个高效的转录终止子，因而只有 14Obp 的转录物被合成。如果弱化子缺失，转录将被通读，结构基因将被转录。

前导 RNA 结构• 色氨酸操纵子 RNA 的前导序列含有 4 个序列互补区，能形成不同的碱基配对的 RNA 结构。它们被称为序列 1 、 2 、 3 和 4 。弱化子发夹结构是序列 3 和 4配对的产物 (3:4 结构 ) 。序列1 和 2 也是互补的，能形成另一个发夹结构 1:2 。然而序列 2还和序列 3互补。如果序列 2 和 3形成 2:3发夹结构， 3:4弱化子发夹结构就不能形成，转录就不会终止。在正常情况下， 1:2 和 3:4发夹结构的形成在能量上是有利的。

前导肽•前导 RNA序列中含有一个有效的核糖体结合位点并能形成由前导 RNA 27――68号碱基所编码的 14 个氨基酸的前导肽。这段前导肽的第 10 和第 11 个密码子编码连续的色氨酸残基。色氨酸是稀有氨基酸；通常两个色氨酸密码子连续出现的可能性很小，在色氨酸含量很低的情况下核糖体将会在这个位点停滞。前导肽的作用就是决定色氨酸的含量并控制转录的终止。

弱化作用• 大肠杆菌中，翻译在 mRNA边转录时边进行。色氨酸前导肽编码序列的 3'端与互补序列 1重叠，两个色氨酸密码子都在序列 1内，终止密码子在序列 1 和 2之间。由于色氨酸 ( 色氨酸操纵子合成的酶的最终产物 ) 是翻译过程中所必需的，因此细胞对它的含量很敏感，它决定了在 mRNA 中终止子 (3:4)发夹结构是否形成。

• 在色氨酸操纵子转录进行的过程中， RNA聚合酶在序列 2 的末端停滞直到核糖体开始翻译前导肽（即当前导肽开始翻译时， RNA 聚合酶才又继续沿 DNA 模板链前进合成RNA ）。在色氨酸含量很高的情况下，核糖体迅速在两个色氨酸密码子处插入色氨酸，这样翻译可直达前肽导末端。核糖体封闭了序列 2 ，当 RNA 聚合酶把 3区和 4区转录出来时， 3:4发夹得以形成，当 RNA 聚合酶到达终止序列时，由于 3:4发夹使转录可能被终止。这一过程被称为弱化作用。

• 另一种情况是 : 如果色氨酸缺乏时，翻译过程中将缺少其氨酰－ tRNA ，核糖体将在两个色氨酸密码子上滞留，封闭了序列 1 。这使得序列 2 能自由地与序列 3形成发夹结构（即抗终止子）。终止子 (3:4)发夹结构不能形成，转录继续到 trpE及其下游。因此终产物色氨酸含量的高低决定了转录是提早终止 (弱化 ) ，还是继续转录完整个操纵子。

弱化的重要性• 仅仅依靠弱化作用，色氨酸的存在就使色氨酸操纵子

的转录被抑制了 10倍。与色氨酸阻抑物的作用 (70倍 ) 合在一起，这就意味着色氨酸水平对色氨酸操纵子的表达施加了 700倍的调节效果。至少在六种与氨基酸的生物合成相关的操纵子中有弱化作用。例如 his操纵子含有编码一个有连续 7个组氨酸密码子的多肽的前导序列。并不是所有这些操纵子都像色氨酸操纵子那样有协同调控。例如 his操纵子就没有阻抑物 -操纵基因调控，弱化作用是其惟一的反馈调控机制。

6·4 转录后调控• 基因表达的转录调控是生物最经济的调

控方式――既然是用不着某种蛋白质，其 mRNA由于用不着就不必转录。但转录生成 mRNA以后，再在翻译或翻译后水平进行 " 微调 "，是对转录调控的补充，它使基因表达的调控更加适应生物本身的需求和外界条件的变化。

6·4·1 翻译起始的调控

• 遗传信息翻译成多肽链起始于而 mRNA 上的核糖体结合位点 (RBS) 。所谓 RBS，是指起始密码子 AUG上游的一段非翻译区。在 RBS中有 SD(Shine-Dalg-arno)序列，长度一般为 5 个核苷酸，富含 G、A ，该序列与核糖体 16SrRNA 的 3'端互补配对，促使核糖体结合到mRNA 上，有利于翻译的起始。RBS的结合强度取决于 SD序列的结构及其与起始密码 AUG之间的距离。 SD 与 AUG之间相距一般以 4-10 个核苷酸为佳， 9个核苷酸最佳。

• mRNA 的二级结构是翻译起始调控的重要因素。 mRNA 5’端合适的空间结构有利于核糖体的 30 S亚基与之相结合。SD序列的微小变化，往往会导致表达效率上百倍甚至上千倍的差异，这是由于核苷酸的变化改变了形成 mRNA 5’端二级结构的自由能，影响了核糖体 30 S亚基与 mRNA 的结合，从而造成了蛋白质合成效率上的差异。

6·4·2 稀有密码子对翻译的影响

• 大肠杆菌 DNA复制时，冈崎片段之前的 RNA引物是由 dnaG基因编码的引物酶催化合成的，细胞对这种酶的需求量不大，而引物酶过多对细胞是有害的。 dnaG、 rpoD及 rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子，而这 3 个基因产物在数量上却大不相同，每个细胞内 50 个拷贝的 dnaG蛋白， 2800 个拷贝的 rpoD 蛋白； 40000 个拷贝的 rpsU蛋白。细胞通过翻译调控，解决了这个问题。即由基因转录出来的三个蛋白相应的 mRNA 拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。

•研究 dnaG序列发现其中含有不少稀有密码子。分别计算大肠杆菌中 25 种结构蛋白和 dnaC、 rpoD序列中 64 种密码子的利用频率，可以看出 dnaG与其他两类有明显不同 ( 表6-11) 。很明显，稀有密码子 AUA在高效表达的结构蛋白及 σ因子中均极少使用，而在表达要求较低的 dnaG蛋白中使用频率就相当高。

• 许多调控蛋白在细胞内含量也很低，这些蛋白的编码基因中密码子的使用频率和 dnaG相似，而明显不同于结构蛋白。由于细胞内对应于稀有密码子的 tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。

6·4·3 重叠基因对翻译的影响

• trp 操纵子由 5 个基因 (trpE、 D 、 C、 B、A) 组成，在正常情况下，操纵子中 5 个基因产物是等量的，但 trpE突变后，其邻近的 trpD产量比下游的 trpBA产量要低得多。研究 trpE和 trpD以及 trpB和 trpA两对基因中核苷酸序列与翻译偶联的关系，发现 trpE基因的终止密码子和 trpD 基因的起始密码子共用一个核苷酸。

• trpE --苏氨酸 --苯丙氨酸 --终止• ACU----UUC----UGA----UGG -- CU• AUG----GCU• 甲硫氨酸 --丙氨酸 ---trpD•由于 trpE的终止密码子与 trpD 的起始密码重叠， trpE翻译终止时核糖体立即处在起始环境中，这种重叠的密码保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。偶联翻译是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。

思考题•1 、简述乳糖操纵子的调控模型。•2 、画出色氨酸操纵子模型并清

楚调控机理。