טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני :...

31
עעעעע עעעעעע עעעעעע ע ע עעע עעעעע עע עעעעע עעעעעע עעע: עעעעע עעעעעעעע

Upload: loan

Post on 12-Jan-2016

80 views

Category:

Documents


0 download

DESCRIPTION

טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות. תאי גזע עובריים בתרבית. המאפיינים העיקריים של תאי גזע עובריים: התחדשות עצמית בלתי מוגבלת פלוריפוטנטיות. עכבר – 1981 אדם – 1998. תנאים בסיסים למחקר בתאי גזע עובריים. שליטה על גדילת התאים במצב בלתי ממוין בתרבית - PowerPoint PPT Presentation

TRANSCRIPT

Page 1: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

שילוב ל ידיטיפול במחלות גנטיות ע: שיבוט וריפוי גנישל

החזון והמציאות

Page 2: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

תאי גזע עובריים בתרבית

1981עכבר –

1998אדם –

גזע • תאי של העיקריים המאפייניםעובריים:

מוגבלת בלתי עצמית התחדשות פלוריפוטנטיות

Page 3: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

תנאים בסיסים למחקר בתאי גזע עובריים

בתרבית ממוין בלתי במצב התאים גדילת על שליטה

התאים על ספציפית התמיינות השריית יכולת

תאי גזע עובריים

Page 4: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

גידול בתרבית - גופיפים

עובריים

הזרקה לעכברים -טרטומות

תאי גזע עובריים לא

ממוינים

התמיינות סטוכסטית

אנדודרם

מזודרם

אקטודרם

התמיינות תאי גזע עובריים

Page 5: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

התמיינות תאי גזע עובריים

תאי גזע עובריים לא ממוינים

אקטודרם

התמיינות מושרה

אנדודרם

הנדסה גנטית

הוספת פקטורים ספציפים

לתרבית

Page 6: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

( של תאים reprogrammingתכנות מחדש )סומאטיים

“The reversal of the differentiation state of a mature cell to one that is characteristic of the undifferentiated

embryonic state”

Gurdon, 1962

Page 7: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

שיבוט למטרת ריפוי Therapeutic Cloning

Gene & cell therapy

Cloning

ES cells isolation

Page 8: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

הפריית מבחנה

בלסטוציסט

בידוד תאי המסה הפנימית

גידול בתנאים מתאימים ליצירת תאי גזע עובריים

שיבוט

שיבוט למטרות ריפוי לעומת שיבוט למטרות רבייה

לא באדם!

Page 9: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

cloning

First somatic cloning in mammals

Wilmut I. et al, Nature, 1997

Lamb 6LL3 - Dolly

כבשה

1996

Page 10: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

מינים משובטים

עכבר

1996

עז

1999

פרה

1998

חזיר

2000

חתול

2002

zebra-fish

2002

ארנב

2002

פרד

2003

סוס

2003

כלב

2005

חולדה

2003

Page 11: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

שיבוט בבני אדם

Science. 2005 Jun 17;308(5729):1777

Science. 2004 Mar 12;303(5664):1669

Page 12: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

מאמר הבית

William M. Rideout, III 6, , 1, Konrad Hochedlinger 6, , 1, , 2, Michael Kyba 6, , 1, George Q. Daley 1, 3 and Rudolf Jaenisch , , 1, 4

Page 13: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

-/- Rag2עכברי

לא , recombinase RAG2, ללא האנזים•

.VDJ rearrangement-ה מתבצע

, SCID הם עכברי -/-RAG2עכברי •

.B תאי Tללא תאי

בתנאים סטריליים העכברים חיים בצורה •

נורמאלית

ניתן לתקן את מערכת החיסון של •

העכברים ע"י הזרקת תאי גזע

WTהמטופואטים מעכברי

Page 14: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

Proof of principle for therapeutic cloning combined with gene therapy

Page 15: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

Tetraploid embryo complementationtwo cell embryos (diploid) one cell embryos (teraploid)

teraploid blastocysts injection of ES cells

Eakin GS et al. Dev Dyn. 2003; 228: 751

electrofusion

Page 16: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

הם אכן פלוריפוטנטיםntES תאיההוכחה ש

Tetraploid embryo complementation

והתאים ES- העובר נוצר מתאי ה•. הצליחו הטטרפלואידים תורמים ליצירת השלייה

(4/14 )28% עכברונים חיים 4לקבל

Page 17: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

ע"י RAG2-תיקון המוטציה ברקומבינציה הומולוגית

האלל המוטנטי, מכיל 3מחדר בתוך אקסון

הקונסטרוקט לצורך תיקון המוטציה

תוצר הרקומבינציה ההומולוגית

האלל המתוקן לאחר הוצאת סמן

הסלקציה Rag2+R-/

LoxPLoxP

Page 18: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

) יוצר מערכת /-Rag2 +Rהאלל המתוקן (חיסון תקינה

•Tetraploid embryo complementation הזרקת תאיntES Rag2+R -/

T ותאי B בתאי rearrangements לזיהוי PCRאנליזת •T ותאי B עם נוגדנים כנגד תאי FACSאנליזת •

Page 19: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

) יוצר מערכת חיסון תקינה/-Rag2 +Rהאלל המתוקן (in-vivoתיקון --/- Rag2בעכברי

HSCכתורמים של /-Rag2+Rשימוש בעכברי •(Hematopoietic stem cells) לעכברי Rag2-/-

T ותאי B עם נוגדנים כנגד תאי FACSאנליזת –

ntES cells מתוקנים" מעכברי" Rag2 -/- יכולים ליצור תאי מח עצם נורמאלים.

Page 20: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

Repaired ntES EBs

hematopoietic stem cells

Hematopoietic cytokinesHOXB4

GFP

Rag2 -/-

WT

והשתלתם ntES על תאי in vitroהשריית התמיינות -/- Rag2בעכברי

6מים

14 י

מים י

Page 21: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

Rag2עכברי במדוע התאים נדחו -/-?

העמידות כנגד ההשתלה היא תכונה •-/-Rag2ספציפית של עכברי ה

MHCהתאים מבטאים רמה נמוכה של •

הורגים תאים המבטאים רמה NKתאי •MHCנמוכה של

מבטאים רמה -/-Rag2יתכן שעכברי • NK cellsגבוהה של

Page 22: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

האם הדחייה נובעת מתגובה של תאי NK?

NKלא תאי להשתלת התאים לעכברים •

hematopoietic stem cells

Rag2-/- ,C null

Rag2 +/- ES

Page 23: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

Rag2 -/- ,γCתוצאות ההשתלה בעכברי null

התאים לא נדחו•95% מהתאים בדם הפריפרי ביטאוGFP

וכמות )גרנולוציטים( תאים מילואידיםבעיקר•T ותאי Bקטנה מאד של תאי

Bתאי Bתאי גרנולוציטיםTתאי

Page 24: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

-/-NK סיכום1) VDJ recombination restored

2) Low level of T/B cells in blood.

3) High level of granulocytes.

Page 25: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

סיכום ומסקנותמטרת העבודה – תיקון פגמים גנטים בעכבר ע"י שילוב •

gene therapy" ו therapeutic cloningשל " מוטנטים ntES משוחזרת בתאי Rag2פעילות האנזים •

שתוקנו ע"י רקומבינציה הומולוגית- התקבל שחזור מסויים של מערכת החיסון בעכברי ה•

SCID שתי בעיות עיקריות:•

NK cellsדחייה ע"י –התמיינות לימפואידית נמוכה ביותר–

תמילואידי"דוחף" לכיוון התמיינות שHoxB4 מביטוי שליתכן שזה נובע •

פרוטוקולים משופרים של התמיינות יפתרו כנראה את הבעיה.

Page 26: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

אסטרטגיות שונות "לתכנת מחדש" תאים

Jaenisch R & Young R., Cell 2008

Page 27: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

תכנות מחדש ע"י הדבקה רטרו-ויראלית של iPS-induced pluripotentפקטורים ידועים )

stem cells)

Jaenisch R & Young R., Cell 2008

Page 28: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

Morphological Changes Following Infection with the 4 Factors

WT-MEFsMorphological changes (Day 7)

mIPS colonies at Day>20

Mouse iPS- First reported 2006

Fibroblasts Human iPS

Human iPS- First reported December 2007

Page 29: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

שילוב ל ידיטיפול במחלות גנטיות ע( וריפוי iPS"תכנות מחדש" )“ של

:גני החזון והמציאות

Page 30: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

Treating Sickle-Cell Anemia with iPS Cells

Hanna J et al., Science 2007

The future ?

L.C

Page 31: טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

) בשעה שתיים 29.12.08שבוע הבא- הרצאה של יעקוב ביום שני|(בחדר סמינרים- מומלץ!