Лазерната микродисекция- Лазерната микродисекция- безценният инструмент на безценният инструмент на

молекулярната патология и молекулярната патология и диагностика, съдебната диагностика, съдебната

медицина и съвременната медицина и съвременната науканаука

Център по молекулна медицинаЦентър по молекулна медицина

Нова биомедицинска революция

Предизвикателството пред патологията е да интегрира клиничните,

морфологичните и молекулярните измерения на заболяванията

От молекулярната биология до От молекулярната биология до патологията и медицината: патологията и медицината:

важността на тъканните биологични важността на тъканните биологични пробипроби

Тъканите показват морфолигичната Тъканите показват морфолигичната природа на заболяванетоприрода на заболяването

Откриването и характеризирането на Откриването и характеризирането на молекулните механизми на заболяванетомолекулните механизми на заболяването

Валидиране на нови потенциални Валидиране на нови потенциални биомаркерибиомаркери

АрхивАрхив Предизвикателство: събирането на проби, Предизвикателство: събирането на проби,

етичност, процесиране (стабилност на етичност, процесиране (стабилност на биомолекулите), комплексностбиомолекулите), комплексност

.....................тъканите са комплексни

В близост до тумора има разнообразни клетъчни

субпопулации

Защо тъкани?Защо тъкани? Култивирани клетъчни линииКултивирани клетъчни линии

Предимства: самореплициращи се, дават Предимства: самореплициращи се, дават добър добив ДНК, РНК и белтъцидобър добив ДНК, РНК и белтъци

Недостатъци: отнема време да се създадат, Недостатъци: отнема време да се създадат, скъпо е, не винаги е успешно създаването им. скъпо е, не винаги е успешно създаването им. Въпреки че клетъчните линии носят Въпреки че клетъчните линии носят генетичните промени в тумора, от който генетичните промени в тумора, от който произлизат, допълнителни промени произлизат, допълнителни промени възникват по време на последователните възникват по време на последователните пасажи или само определени туморни клетки пасажи или само определени туморни клетки (например агресивни) се размножават. (например агресивни) се размножават. Генната експресия в култивираните клетки Генната експресия в култивираните клетки може да е много различна от тази на тумора, може да е много различна от тази на тумора, защото те вече не са под контрола на тъканни защото те вече не са под контрола на тъканни елементиелементи

Защо тъкани?Защо тъкани?

Ксенографтно обогатяване на Ксенографтно обогатяване на клетъчните култури- същите клетъчните култури- същите ограниченияограничения

Техники за сортиране на клетки- Техники за сортиране на клетки- плътностни градиенти, флуоресцентно активирано клетъчно сортиране, антитяло-белязани имуно частички и афинитетно-белязани магнитни частички. Необходимо е обаче да се направи суспензия от клетки.

Развитието на Развитието на микродисекциятамикродисекцията

Микродисекция е била използвана Микродисекция е била използвана много преди изобретяването на много преди изобретяването на LMLM (лазерна микродисекция) (лазерна микродисекция) Lowry and PassonneauLowry and Passonneau- използвали - използвали

лиофилизирани тъканни срезилиофилизирани тъканни срези Goelz et alGoelz et al- използвали парафинови - използвали парафинови

блокчетаблокчета

Недостатъци на ръчните Недостатъци на ръчните методи на микродисекцияметоди на микродисекция

Изисква се голяма сръчностИзисква се голяма сръчност Въздушните течения могат да доведат до Въздушните течения могат да доведат до

загуба на микродисектирания материал загуба на микродисектирания материал при преноса от пипета или много тънко при преноса от пипета или много тънко типче в центрофужна епруветкатипче в центрофужна епруветка

Риск от контаминацияРиск от контаминация Трудност в изолирането на дифузно Трудност в изолирането на дифузно

разположени клеткиразположени клетки ВремеемкиВремеемки

В опит да се подобри ръчното изолиране било въведено използването на тиксо, което да покрива избраната за микродисектиране област от въздушни течения и тремор на ръката на оператора

Развитието на лазерната Развитието на лазерната микродисекция (микродисекция (LM)LM)

Meier-Ruge et al-Meier-Ruge et al- 1976, инициират развитието на LM като използват примитивна UV лазерна технология, която заема голямо пространство, но постигат микродисекция на клетъчни субпопулации от хетерогенни тъкани по-точно от всички ръчни методи

Shibata- 1993- UV лъч, който да разрушава ДНК на нежеланите компоненти от тъканта (Selective ablation of unwanted regions)

Emmert-Buck et al- 1996 в Emmert-Buck et al- 1996 в NIHNIH- - Arcturus Arcturus EngineeringEngineering

LM LM разкрива нови разкрива нови възможностивъзможности

Молекулярни анализиМолекулярни анализи Онкология/ ПатологияОнкология/ Патология Изследване на единични клеткиИзследване на единични клетки ЦитогенеткаЦитогенетка Живи клетки от клетъчни култириЖиви клетки от клетъчни култири Изследвания на мозъкаИзследвания на мозъка КриминологияКриминология ЕмбриологияЕмбриология

LCM на определена хипоталамусна област

Видове Видове LMLM IR LCMIR LCM- инфрачервеният лазерен пулс - инфрачервеният лазерен пулс

води до локално топене на води до локално топене на EVA EVA полимер, адхезиране на клетките към полимер, адхезиране на клетките към стопената мембрана. При охлаждане стопената мембрана. При охлаждане мембраната отново се втърдява и мембраната отново се втърдява и клетките се отделят от неяклетките се отделят от нея

UV LMUV LM-фотоизпарение на нежеланата -фотоизпарение на нежеланата тъкан, обграждаща желаната област тъкан, обграждаща желаната област чрез много тесен лазерен лъч чрез много тесен лазерен лъч

Комбиниращи Комбиниращи IR IR и и UV- Arcturus Veritas UV- Arcturus Veritas ии Acturus XT Acturus XT

Принцип на Принцип на IR-LCMIR-LCM

Преди LCM

След LCM

LCM филм

Апарати осъществяващи Апарати осъществяващи IR IR LCMLCM

Arcturus/MDS, IncArcturus/MDS, Inc PixCell IIPixCell II AutoPixAutoPix

Arcturus PixCell II

Arcturus AutoPix

UV LMUV LM

UVUV базирани системи за базирани системи за LMLM

Laser Microdissection (LMD/Leica)Laser Microdissection (LMD/Leica) Cut and catapulting system Cut and catapulting system

(PALM/Zeiss)(PALM/Zeiss) Mmi-CellCut (MMI AG)Mmi-CellCut (MMI AG)

LMD/Leica

PALM/Zeiss

Mmi-CellCut

(MMI AG)

Смесен тип Смесен тип LMLM Съчетават Съчетават UV UV и и IR IR в един апарат:в един апарат:

Arcturus VeritasArcturus Veritas Acturus XTActurus XT

Arcturus Arcturus VeritasVeritas

Acturus Acturus XTXT

Алтернатива на лазерната Алтернатива на лазерната микродисекция: Eppendorf PPMD микродисекция: Eppendorf PPMD

microdissectormicrodissector

По- евтин, но с по-ниска прецизност и

точност

Характеристики на най-често Характеристики на най-често използваните техники за използваните техники за

микродисекциямикродисекция

ТехнологияТехнология Laser-capture Laser-capture microdissectionmicrodissection

Laser-pressure Laser-pressure catapultingcatapulting

Ultrasonic piezo Ultrasonic piezo power power

microdissectionmicrodissection

Източник Източник на енергияна енергия

IR лазер UVUV лазер лазер УлтразвукУлтразвук

ПринципПринцип Термично Термично активиращ се активиращ се

филм, филм, образуващ образуващ комплекс с комплекс с

тъкантатъканта

UV UV лазерът лазерът реже около реже около таргетната таргетната

тъкан- тъкан- фотоизпарениефотоизпарение

Ултразвук Ултразвук инициирано инициирано движение на движение на

метален тип по метален тип по таргетната тъкантаргетната тъкан

Минимален Минимален размерразмер

7.5 7.5 µmµm 0.5 µm, 1 µm0.5 µm, 1 µm 1.5 µm1.5 µm

МикроскопсМикроскопски стъклаки стъкла

Незаредени, Незаредени, обикновениобикновени

Обикновени и Обикновени и такива с такива с

мембранамембрана**

Няма данниНяма данни

Видове Видове пробипроби

FFPE, FFPE, замразени замразени

тъкани, тъкани, цитологични цитологични препарати, препарати,

живи клеткиживи клетки

FFPE, FFPE, замразени замразени

тъкани, тъкани, цитологични цитологични препарати, препарати,

живи клетки, живи клетки, органелиорганели

FFPE, FFPE, замразени замразени тъкани, тъкани,

цитологични цитологични препарати, препарати,

трудни тъканитрудни тъкани

Влияние Влияние върху върху

биомолекулбиомолекулитеите

Няма влияние. Няма влияние. Има минимално Има минимално

нагряваненагряване

Нагряването Нагряването може да има може да има

ефект, но ефект, но температ. температ.

промени са промени са временнивременни

Няма данниНяма данни

Видове проби и Видове проби и изисквания към пробитеизисквания към пробите

Чрез Чрез LM LM могат да се микродисектират могат да се микродисектират отделни клетки, клетъчни области, отделни клетки, клетъчни области, хромозоми или дори части от хромозоми или дори части от хромозомихромозоми

Видове проби и Видове проби и изисквания към пробитеизисквания към пробите

Чрез Чрез LM LM могат да се микродисектират могат да се микродисектират отделни клетки, клетъчни области, отделни клетки, клетъчни области, хромозоми или дори части от хромозомихромозоми или дори части от хромозоми

Пробите могат да са Пробите могат да са FFPE, FFPE, замразени замразени тъкани и цитологични препаратитъкани и цитологични препарати

Факторите въздействащи на интегритета Факторите въздействащи на интегритета на биомолекулите са: начин и тип на биомолекулите са: начин и тип съхранение на пробите, времето за съхранение на пробите, времето за съхранение преди микродисекцията, съхранение преди микродисекцията, метода за фиксация и метода на метода за фиксация и метода на микродисекциямикродисекция

Очакван добив след Очакван добив след лазерна микродисекциялазерна микродисекция

1 клетка = 6-7 1 клетка = 6-7 pg pg геномна ДНКгеномна ДНК

1 клетка = 10-30 1 клетка = 10-30 pg pg тотална РНКтотална РНК 80-85% 80-85% rRNArRNA 15-20% 15-20% tRNAtRNA, , snRNAsnRNA 1-5% 1-5% mRNAmRNA

Белтъчното Белтъчното съдържание зависи съдържание зависи от типа органи и от от типа органи и от степента на степента на белтъчна белтъчна деградациядеградация

rRNA

tRNA, snRNA, miRNA

mRNA

Предимства на лазерната Предимства на лазерната микродисекциямикродисекция

Бързина (особено Бързина (особено UV LM)UV LM), прецизност, , прецизност, гъвкавост и възможност за документиране на гъвкавост и възможност за документиране на експериментитеекспериментите

Избягват се сложните стъпки, осъществявани Избягват се сложните стъпки, осъществявани от оператораот оператора

Не разрушава съседни тъканиНе разрушава съседни тъкани Могат да се изолират клетки разпръснати сред Могат да се изолират клетки разпръснати сред

други клетъчни популациидруги клетъчни популации Приложение в молекулната генетична Приложение в молекулната генетична

диагностикадиагностика При При UV UV системите за разлика от системите за разлика от IR IR системите системите

няма контакт с тъканта, няма риск от няма контакт с тъканта, няма риск от контаминацияконтаминация

Ограничения на лазерната Ограничения на лазерната микродисекциямикродисекция

Намалена оптична резолюция на Намалена оптична резолюция на оцветените и дехидратирани тъканни оцветените и дехидратирани тъканни срези поради липсата на предметно стъклосрези поради липсата на предметно стъкло

Трудности при прецизното Трудности при прецизното микродисектиране на комплексни тъкани микродисектиране на комплексни тъкани с ограничени архитектурни с ограничени архитектурни характеристики (лимфоидни неоплазии, характеристики (лимфоидни неоплазии, дифузно инфилтрирани карциноми).дифузно инфилтрирани карциноми). Специални багрила или имунохистохимично Специални багрила или имунохистохимично

оцветяванеоцветяване Използване на дифюзерИзползване на дифюзер

Ограничения на лазерната Ограничения на лазерната микродисекциямикродисекция

При При contact-lift off contact-lift off метода често има метода често има затруднения в събирането на избраните затруднения в събирането на избраните клетки от препарата, което може да се клетки от препарата, което може да се дължи на здраво прикрепяне на тъканта към дължи на здраво прикрепяне на тъканта към положително заредено предметно стъкло положително заредено предметно стъкло или на остатъчна влага останала в тъкантаили на остатъчна влага останала в тъканта

При При FFPE FFPE препаратите наличие на повреди в препаратите наличие на повреди в ДНК, РНК и белтъците => ограничения в ДНК, РНК и белтъците => ограничения в PCR PCR базираните методи за изследване- базираните методи за изследване- трябва да се амплифицират къси ампликонитрябва да се амплифицират къси ампликони

IR LCM IR LCM не са добри за дисектиране от срези не са добри за дисектиране от срези по-тънки от 10по-тънки от 10µmµm

Предизвикателства Предизвикателства пред пред LMLM

Всички микродисекционни системи са Всички микродисекционни системи са микроскоп базирани:микроскоп базирани: Оператор-зависимиОператор-зависими Хистопатологично обучение е необходимоХистопатологично обучение е необходимо

ПроцесивностПроцесивност Събирането на голям брой клетки за някои Събирането на голям брой клетки за някои

видове анализи понякога е невъзможновидове анализи понякога е невъзможно Не винаги са подходящи за много малки Не винаги са подходящи за много малки

мишенимишени Отделни клетки или разпръснати клетки, Отделни клетки или разпръснати клетки,

субклетъчна микродисекциясубклетъчна микродисекция

Източници на биологичен материал

Хирургични срези

Цитологични препарати

Замразени

В парафин

ИХХ оцветен

и

FISHTouch Prep Смир

Клетъчен блок

Thin Prep

Cyto Spin

Стабилизиране на пробите

Подготовка на микроскопските препарати

LM

Изолиране

Анализи

Приложения на Приложения на LMLM

ДНК базирани анализиДНК базирани анализи РНК базирани анализиРНК базирани анализи

Протеин базирани анализиПротеин базирани анализи микроРНК базирна анализимикроРНК базирна анализи

Откриване на нови Откриване на нови биомаркерибиомаркери

ДиагнозаДиагноза

ПрогнозаПрогноза

Таргетна терапияТаргетна терапия

Микрочипове

aCGH

Цялостна геномна

амплификация

Primer extension preamplification

SSCP

RFLP

X- хормозомноинактивиране

LOH

Епигенетични промени

Генетични мутации

ДНК базирани Анализи

ДНК базирани анализиДНК базирани анализи

LOHLOH

ДНК базирани ДНК базирани изследвания- изследвания- LOHLOH

LOH LOH анализите при изследване на рак се анализите при изследване на рак се използва за картиране на туморсупресорни използва за картиране на туморсупресорни гени и за изучаване честотата на промяна на гени и за изучаване честотата на промяна на определени туморсупресори при различни определени туморсупресори при различни видове туморивидове тумори

LOH LOH за анализ на клоналността:за анализ на клоналността: Анализ на клоналността на мултифокалните Анализ на клоналността на мултифокалните

туморитумори Клонален анализ на първичните и Клонален анализ на първичните и

метастазиралите тумориметастазиралите тумори Клонален анализ на прогениторни клетки в Клонален анализ на прогениторни клетки в

мултикомпонентни туморимултикомпонентни тумори

ДНК базирани изследвания- ДНК базирани изследвания- клонален анализ на клонален анализ на XX свързаното свързаното

алелспецифично хиперметилиранеалелспецифично хиперметилиране

Клетките получени от една Клетките получени от една прогениторна клетка имат прогениторна клетка имат инактивиране на една съща Х инактивиране на една съща Х хромозомахромозома

За доказване на клонална За доказване на клонална неопластична трансформациянеопластична трансформация

РНК базирани анализиРНК базирани анализи

Изследване на експресионен Изследване на експресионен профилпрофил

Серийни анализи на генната Серийни анализи на генната експресияекспресия

МикрочиповеМикрочипове

ПротеомикаПротеомика

Western BlotWestern Blot 2D-PAGE2D-PAGE ЗимограмиЗимограми Обратно фазови чиповеОбратно фазови чипове Мас спектроскопски техникиМас спектроскопски техники

Примери за Примери за приложението на приложението на LMLM

Възникване на рака на Възникване на рака на стомахастомаха

Изолиране на inner cell mass cells (белите

стрелки)

Трофектодермални клетки (черни стрелки)

LCM на

ендосперм

LCM на крио срези на глобуларната фаза на Arabidopsisembryo

LCM LCM за изучаването на за изучаването на молекулните промени при молекулните промени при

меланомамеланома

Простатна тъкан

преди LCM

LCM туморен епител

LCM тумор асоциирана строма

Простатна тъкан

преди LCM

LCM нормален

епител

LCM нормална

строма

Приложението на Приложението на LM LM в в криминалистикатакриминалистиката

STR STR анализите- основен метод за анализите- основен метод за ДНК базирана идентификацияДНК базирана идентификация Повечето следи съдържат клетки от Повечето следи съдържат клетки от

повече от един източник => повече от един източник => изолиране на ДНК от повече от един изолиране на ДНК от повече от един индивид -> микс от генотипи и трудно индивид -> микс от генотипи и трудно интерпретиране на резултатитеинтерпретиране на резултатите

Често клетките на жертвата са много Често клетките на жертвата са много повече от клетките на извършителяповече от клетките на извършителя

Трудно интерпретиращи се Трудно интерпретиращи се резултати:резултати: Ниска ДНК концентрацияНиска ДНК концентрация ДНК деградацияДНК деградация Присъстивие на инхибиториПрисъстивие на инхибитори

Изход- Изход- LMLM

Недостатъци на разработените Недостатъци на разработените методи за разделяне на методи за разделяне на

сперматозоиди от други клеткисперматозоиди от други клетки

Диференциален лизис метод- за Диференциален лизис метод- за разделяне на спермата от епителните разделяне на спермата от епителните клеткиклетки Получават се две фракции (ДНК от Получават се две фракции (ДНК от

извършителя и ДНК от жертвата), но извършителя и ДНК от жертвата), но разделянето НЕ винаги е пълноразделянето НЕ винаги е пълно

У- хромозомен У- хромозомен STR STR анализанализ У хромизомите са идентични при всички У хромизомите са идентични при всички

роднини по бащина линияроднини по бащина линия

Недостатъци на разработените Недостатъци на разработените методи за разделяне на методи за разделяне на

сперматозоиди от други клеткисперматозоиди от други клетки Филтрационен методФилтрационен метод

70% от сперматозоидите преминават през филтъра, 70% от сперматозоидите преминават през филтъра, а епителните клетки остават на повърхносттаа епителните клетки остават на повърхността

1-2% от епителните клетки също успяват да 1-2% от епителните клетки също успяват да преминат през филтърапреминат през филтъра

Флуоресцентно активарано клетъчно Флуоресцентно активарано клетъчно сортиранесортиране Прилага се единствено за вагинални лаважи. НЕ Прилага се единствено за вагинални лаважи. НЕ

може да се прилага за вагинални натривки или може да се прилага за вагинални натривки или архивен материал, нито за разделяне в тъканни архивен материал, нито за разделяне в тъканни препаратипрепарати

Недостатъци на разработените Недостатъци на разработените методи за разделяне на методи за разделяне на

сперматозоиди от други клеткисперматозоиди от други клетки Магнетично активирано клетъчно сортиранеМагнетично активирано клетъчно сортиране

Трудно се открива моноклонално антитяло Трудно се открива моноклонално антитяло специфично свързващо антиген на повърхността специфично свързващо антиген на повърхността на сперматозоидитена сперматозоидите

Антитен стабилен в деградирали съдебни пробиАнтитен стабилен в деградирали съдебни проби Микро изфабрикувано устройство за Микро изфабрикувано устройство за

разделяне на сперматозоиди от епителни разделяне на сперматозоиди от епителни клетки на клетки на Horsman et al- Horsman et al- базира се на базира се на различни физични свойства на клеткитеразлични физични свойства на клетките Само 25% от сперматозоидите се възстановяват Само 25% от сперматозоидите се възстановяват

(остават интактни)(остават интактни)

Всички тези методи са неефикасни при сепарацията, при използването на минимално количество материал или невъзможност за използването на архивен материал

За да се направи пълен ДНК профил са необходими 15-20 интактни сперматозоида, които могат да бъдат осигурени чрез LM.

Разработващи се Разработващи се методиметоди

Изолиране и на други мъжки клетки- Изолиране и на други мъжки клетки- добра алтернатива при добра алтернатива при азооспермените извършителиазооспермените извършители Полово специфично белязане на келтки Полово специфично белязане на келтки

за за LCM- FISH- LCM- FISH- У хромозомни У хромозомни специфични пробиспецифични проби

Изолиране на женски клетки (от Изолиране на женски клетки (от кондоми)кондоми) Белязана на Х и У хромозомите с Белязана на Х и У хромозомите с

различни флуоресцентни багриларазлични флуоресцентни багрила

ПриложенияПриложения на на LM LM в в криминалистикатакриминалистиката

Събиране на фоликули от косми с цел по-Събиране на фоликули от косми с цел по-ефикасно изолиране на ДНК без ефикасно изолиране на ДНК без контаминиращи вещества (инхибитори като контаминиращи вещества (инхибитори като кератин)кератин)

Изолиране на кръвни клетки от различни Изолиране на кръвни клетки от различни клетъчни смеси- например от кръв и слюнкаклетъчни смеси- например от кръв и слюнка

LCM LCM за получаване на ДНК профили от за получаване на ДНК профили от биологични проби, когато са смесени с биологични проби, когато са смесени с отломки, замърсители, прах, мръсотияотломки, замърсители, прах, мръсотия Изолиране на клетки от букална лигавица Изолиране на клетки от букална лигавица

смесени с почвасмесени с почва

ПриложенияПриложения на на LM LM в в криминалистикатакриминалистиката

Отделяне на Отделяне на клетки от лепенки, клетки от лепенки, използвани за използвани за събиранее на събиранее на улики от коли, улики от коли, трупове и др.трупове и др.

Бъдещето на Бъдещето на LM- LM- Expression Expression Microdissection (xMD), Microdissection (xMD), Automated Automated

Cell RecognitionCell Recognition Имуно-базирана Имуно-базирана

микродисекционна технология за микродисекционна технология за бърза, специфична и полу-бърза, специфична и полу-автоматична тъканна автоматична тъканна микродисекциямикродисекция

Не е необходима микроскопска Не е необходима микроскопска идентификация на таргетните клеткиидентификация на таргетните клетки Срезите са ИХХ белязани. Препарата се Срезите са ИХХ белязани. Препарата се

покрива с термочувствителен филм, покрива с термочувствителен филм, следва облъчване на цялото и поле и следва облъчване на цялото и поле и накрая филмът се отделя със накрая филмът се отделя със захванатите таргетни клеткизахванатите таргетни клетки

Процесират се около 50 000 клетки Процесират се около 50 000 клетки за секундаза секунда

Елиминират се трудностите при Елиминират се трудностите при селекцията на таргетни клетки селекцията на таргетни клетки поради не добрата картинапоради не добрата картина

Оператор- независима системаОператор- независима система

Благодаря за Благодаря за вниманието !вниманието !