柞蚕功能基因研究进展——沈阳农业大学柞蚕研究所刘彦群研究组

汇报人：刘彦群、李玉萍

2011.03

一、研究组简介二、研究进展三、当前重点研究工作

汇报内容

背景： 在家蚕基因组与功能基因组研究取得巨大进展和成功的背景下，我们于 2008 年组建了柞蚕基因组与功能基因组研究组。

一、研究组简介

人员： 固定成员已由最初的 2 人增长为 6人（刘彦群、李玉萍、夏润玺、王欢、李群、秦利）。 现有研究生 6 人，今年准备招生 4人。包括特种经济动物饲养、动物学两个专业。

一、研究组简介

研究领域：（ 1 ）以构建的柞蚕全长 cDNA 文库和完成的柞蚕转录组信息资源为平台，克隆和鉴定柞蚕特异基因和重要功能基因；（ 2 ）利用基因组学技术和分子系统学方法，开展柞蚕遗传与进化研究。

一、研究组简介

目前承担的国家自然科学基金课题：（ 1 ）面上项目（柞蚕蛹滞育解除期高丰度表

达的 KK-42 结合蛋白基因的功能分析； 2011.01 ~ 2011.12 ；刘彦群）。

（ 2 ）青年科学基金（柞蚕 mtDNA 控制区遗传多样性与系统进化； 2009.01 ~ 2011.12 ；刘彦群）。

（ 3 ）面上项目（柞蚕神经肽 PBAN 的受体鉴定及其作用的信号转导分析； 2011.01 ~ 2013.12 ；魏兆军、李玉萍）。

一、研究组简介

发表论文： 2008 年至今， 在《 International Journal of Biological Sciences 》、《 Annals of the Entomological Society of America 》、《 Journal of Insect Science 》、《 Molecular Biology Reports 》、《 Acta Biochimica et Biophysica Sinica 》、《蚕业科学》等发表 24 篇相关论文，包括 13篇 SCI 论文（ 2008 年 1 篇； 2009 年 2 篇； 2010 年 9 篇； 2011 年已发 1 篇，已投稿 2 篇）。

一、研究组简介

1 、柞蚕 EST 测定与转录组测序2 、柞蚕功能基因克隆

二、研究进展

EST 测定：（ 1 ）构建了一个柞蚕全长 cDNA 文库，为基因的克隆奠定了基础；（ 2 ）获得了 1500 条柞蚕 EST ，拼接后得到 779 个一致性序列，被注释的一致性序列达 533 个，未被注释的一致性序列达 246 个；（ 3 ）识别了 200 个新的 EST ；（ 4 ）获得了 313 条柞蚕基因全长 cDNA 序列。

1 、柞蚕 EST 测定与转录组测序

转录组测序：（ 1 ）合作者合肥工业大学魏兆军博士研究组已经利用 Solexa 技术完成了滞育解除期柞蚕蛹的转录组分析。总共获得 84322 个 contig ，注释为 38438 个 unigene 。（ 2 ）我们正在利用同样的技术进行滞育中期蛹的转录组分析。仍将进行注定滞育蛹和注定不滞育蛹的转录组分析。（ 3 ）旨在分离与柞蚕滞育相关的基因。

1 、柞蚕 EST 测定与转录组测序

（ 1 ）鉴定了柞蚕 KK-42结合蛋白基因，查明其与蛹滞育密切相关。（ 2 ）鉴定了烯醇化酶 I 、 II 基因。烯醇化酶I 基因在温度刺激时是可调的。烯醇化酶II基因与生殖有关。（ 3 ）鉴定了柞蚕溶血磷酯酶基因、长寿基因、肌球蛋白轻链 2 基因、异常翅节蛋白基因、腺苷酸转移酶基因、延伸引子 -1α基因、肌动蛋白基因。

2 、柞蚕功能基因克隆

最近，又鉴定了柞蚕血小板活化因子乙酰水解酶基因、亚精胺合成酶基因、磷酸丝氨酸转氨酶基因、硒磷酸化物合成酶基因、赖氨酰 -tRNA 合成酶基因、牻牛儿基牻牛儿醇转移酶、 NIMA相关激酶基因等，完成了表达模式分析。还分离了 4个小分子量热激蛋白基因、 1 个微卵黄原蛋白基因。相关论文正在整理中。

2 、柞蚕功能基因克隆

1 、柞蚕蛹滞育相关的 KK-42 结合蛋白基因的功能分析2 、利用转录组技术分离柞蚕蛹滞育相关基因

三、当前重点研究工作

1 、 KK-42 结合蛋白基因的功能分析：（ 1 ）咪唑类化合物（ KK-42 ）是一种昆虫生长调节因子，能加快昆虫（如柞蚕、天蚕、家蚕等）甚至节肢动物（如对虾）幼虫的早熟变态；（ 2 ）并且能解除天蚕的卵滞育和棉铃虫的蛹滞育。我们的试验表明，也能解除柞蚕的蛹滞育（需要进一步重复验证）

三、当前重点研究工作

1 、 KK-42 结合蛋白基因的功能分析：（ 3 ） KK-42 结合蛋白与天蚕的卵滞育解除有直接关系 (Shimizu et al., 2002; Yang et al., 2008) 。（ 4 ）表达谱分析表明，柞蚕 KK-42 结合蛋白基因在 4 个发育阶段和所有组织器官中均表达，并且与柞蚕的蛹滞育密切相关（滞育期不表达），而且在滞育解除后期高丰度表达。（ 5 ）序列比对和进化分析表明， KK-42 结合蛋白具有两个脂肪酶活性功能域，是脂肪酶的新成员。

三、当前重点研究工作

1 、 KK-42 结合蛋白基因的功能分析：（ 6 ）将系统研究 KK-42处理对柞蚕生长发育的影响；（ 7 ）将利用免疫细胞化学技术进行该蛋白的亚细胞定位；（ 8 ）在真核细胞中表达后，利用酶学方法对该蛋白可能具有的脂肪酶活性进行鉴定；（ 9 ）利用 RNAi 技术进行 KK-42 结合蛋白基因的功能分析。

三、当前重点研究工作

1 、 KK-42 结合蛋白基因的功能分析：（ 10 ）该研究工作可以为深入理解昆虫滞育解除的分子机理提供新的线索，也为探明 KK-42 的分子作用机制提供直接的证据。

三、当前重点研究工作

2 、柞蚕蛹滞育相关基因的分离：（ 1 ）滞育是昆虫生活史中非常重要的一个生理学过程。柞蚕以蛹滞育，长期以来是国内外研究滞育调节、神经内分泌调控等方面的模式昆虫之一 。

三、当前重点研究工作

2 、柞蚕蛹滞育相关基因的分离：（ 2 ）已经用于分离昆虫滞育相关基因的技术有 mRNA差异显示（家蚕 ， Suzuki et al. 1999 ；棉铃虫，朱佳等 2010 ）、消减杂交（马铃薯甲虫， Yocum 2003 ；尖音库蚊，Robich et al. 2007 ；天蚕， Yang et al. 2008 ；红尾肉蝇 ， Rinehart et al. 2010 ）、EST （旧金山卤虫， Chen et al. 2009 ）、cDNA芯片（家蚕， Hwang et al. 2005 ）、差异蛋白质组学（红尾肉蝇， Li et al. 2007 ；棉铃虫， Lu and Xu, 2010 ）。

三、当前重点研究工作

2 、柞蚕蛹滞育相关基因的分离：（ 3 ）转录组是基于高通量测序技术从整体水平上研究细胞中基因表达及转录调控规律的技术。由于测序成本的急速降低，该新技术已经被应用于昆虫滞育相关基因的分离（ Ragland et al., 2010, PNAS 14909-14914 ）。 该方法采用直接测序的方式，无需了解物种基因信息，可以对任何物种在全基因组范围内进行精确的数字化基因表达定量分析，通过样本间基因表达差异比较，可以准确鉴定与特殊性状相关的候选基因。具有前述几种技术不可比拟的优势。

三、当前重点研究工作

2 、柞蚕蛹滞育相关基因的分离： （ 4 ）将进行柞蚕蛹 4 个重要滞育时期（注定非滞育蛹、注定滞育蛹、滞育中期蛹、滞育解除期）的转录组测序；（ 5 ）利用生物信息学方法，通过样本间差异比较，鉴定与柞蚕滞育相关的候选基因；（ 6 ）利用定量 PCR 和 Northern blot 等技术对候选基因进行验证。

三、当前重点研究工作

（ 7 ）该研究工作可以为进一步开展柞蚕蛹滞育的分子机理研究提供新的线索。（ 8 ）柞蚕是我国的特色经济昆虫，但我们对柞蚕的基因表达和功能的了解还非常缺乏。由于缺乏基因组数据，以往柞蚕功能基因的克隆只能采用费时费力的同源克隆方法。该研究工作将获得大量基因表达数据，可以为柞蚕功能基因的快速克隆奠定基础。

三、当前重点研究工作

沈阳农业大学柞蚕研究所全体同事！西南大学蚕学与系统生物学研究所全体老师！辽宁省蚕业科学研究所各位老师！合肥工业大学魏兆军博士研究组！……

祝各位老师与同仁身体健康！工作愉快！

致谢

图 1 基于氨基酸序列构建的 ApKK-42BP 及其相关蛋白的进化树

Lipases

Yolk proteins

KK-42BPs

图 2 ApKK-42BP 基因的表达谱

(A) 组织分布。 1-10 分别代表 5龄第 10天幼虫的血液、脂肪体、中肠、丝腺、体壁、马氏管、精巢、卵巢、脑和肌肉。

(B) 发育阶段。 11-15 分别代表卵、幼虫、蛹和雌蛾、雄蛾。

图 3 ApKK-42BP 基因在注定不滞育和注定滞育的幼虫中表达变化

1 和 2 分别代表注定不滞育和注定滞育幼虫的脑。

3 和 4 分别代表注定不滞育和注定滞育幼虫的血液。

图 4 ApKK-42BP 基因在不同滞育期的变化

1 表示注定不滞育的蛹（春蛹）； 2-6 分别表示注定滞育蛹（秋蛹）的前滞育期、滞育前期、滞育期、后滞育期 I （颅顶板乳白色）、后滞育期 II （颅顶板发红；卵已形成）。

Antheraea pernyi I

Antheraea polyphemus ABW39163

Bombyx mori I ABL73887

Spodoptera frugiperda SFC01447_2

Tribolium castaneum EFA09609

Tribolium castaneum EFA10506

Tribolium castaneum EFA09610

Drosophila mojavensis EDW11671

Drosophila yakuba ABH06824

Drosophila melanogaster ABH06829

Lutzomyia longipalpis ABV60328

Oncometopia nigricans AAU95200

Anopheles gambiae EAA12254

Aedesae gypti EAT47221

Culex quinquefasciatus EDS26585

Blattella germanica ABC96322

Pediculus humanus corporis EEB17453

Homarus gammarus P56252

Penaeus monodon AAC78141

Aphidius ervi CBE65825

Arabidopsis thaliana P25696

Oryza sativa Q42971

Homo sapiens NP_001419 Mus musculus NP_001020559

Rattus norvegicus NP_036686

Schizosaccharomyces pombe NP_595903

Saccharomyces cerevisiaegi NP_011770

Magnaporthe grisea XP_366389

Antheraea pernyi II

Bombyx mori II

Archaeoglobus fulgidus AAB90112

Haloarcula marismortui P29201

Pyrococcus abyssi CAB49458

98

100

92

100

100

100

100

100

100

9789

99

96

90

89

59

54

82

80

79

75

100

95

0.1

Invertebrates

plants

vertebrates

fungi

Enolase I

enolase II

图 5 基于氨基酸序列构建的烯醇化酶的进化树

图 6 柞蚕两个烯醇化酶基因的表达模式

(A) 发育阶段。 1-4 分别代表卵、幼虫、蛹和蛾。

(B) 组织分布。 5-14 分别代表 5龄第 10天幼虫的血液、脂肪体、中肠、丝腺、体壁、马氏管、精巢、卵巢、脑和肌肉。

图 7 柞蚕 NIMA 相关激酶基因的发育阶段表达模式

1-4 分别代表卵、幼虫、蛹和蛾

mVg

Actin

Hsp25.4

图 8 柞蚕 4 个小分子量热激蛋白基因的在温度胁迫下的表达变化

图 9 柞蚕微卵黄原蛋白基因的表达模式

1-4 分别代表卵、幼虫、蛹和蛾；5-6 分别代表雌蛹和雄蛹；7-11 分别代表滞育蛹（颅顶板无色透明）、激活蛹、发育蛹（颅顶板乳白色）、发育蛹（颅顶板发红；卵已形成）和第 1天卵。