青枯雷尔氏菌致病力分化的研究

青枯雷尔氏菌致病力青枯雷尔氏菌致病力分化的研究分化的研究

导师导师 : : 刘波刘波答辩人答辩人 : : 程本亮程本亮专业专业 : : 微生物学微生物学

内容提要内容提要

青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理4

前言前言1

不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化2

生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化3

5 青枯雷尔氏菌无致病力突变株的生物学异质性青枯雷尔氏菌无致病力突变株的生物学异质性

11 、、前言前言

病原病原 Ralstonia solanacearumRalstonia solanacearum

寄主寄主烟草、番茄、茄子等烟草、番茄、茄子等 5050 多科的多科的400400 多种植物多种植物。

分布分布热带、亚热带地区；在我国，热带、亚热带地区；在我国，主要发生在长江以南地区主要发生在长江以南地区

防治防治轮作轮作、、培育抗性品种培育抗性品种、、化学农药化学农药和生物防治和生物防治 Ralstonia solanacearumRalstonia solanacearum

11 、、前言前言

生化型生化型 II ～～ VV

血清型血清型溶源型溶源型

致病型和菌系致病型和菌系

生理小种生理小种 11 ～～ 44

青枯雷尔氏菌青枯雷尔氏菌

无致病力青枯雷无致病力青枯雷尔氏菌尔氏菌

青枯病生物防治青枯病生物防治

根据对不同寄主致根据对不同寄主致病性的表现进行划分，病性的表现进行划分，分为生理小种分为生理小种 11～～ 44 。。根据对根据对 33 种糖和种糖和 33种醇的氧化能力分为种醇的氧化能力分为生化型生化型 II～～ VV 。。除此之外，还有血除此之外，还有血清型、溶原型以及致清型、溶原型以及致病型和菌系等种下分病型和菌系等种下分化的分类方法。化的分类方法。

发病初期的植株只有根部分离发病初期的植株只有根部分离到青枯菌。在发病后期的植株的到青枯菌。在发病后期的植株的根、茎基、茎中部均有分离到青根、茎基、茎中部均有分离到青枯菌，其中茎基的青枯菌浓度最枯菌，其中茎基的青枯菌浓度最高。高。在初期的根部和发病后期的茎在初期的根部和发病后期的茎中部位分离到少量无致病力青枯中部位分离到少量无致病力青枯雷尔氏菌。雷尔氏菌。

22 、不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化、不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化

2.1 2.1 番茄植株中青枯雷尔氏菌的分布及致病力分番茄植株中青枯雷尔氏菌的分布及致病力分化化

健康植株健康植株发病后期植株发病后期植株发病初期植株发病初期植株

强致病力菌株强致病力菌株无致病力菌株无致病力菌株

0

0. 5

1

1. 5

2

2. 5

3

青枯雷尔氏菌浓× 10度（ 6cfu/ g）

根茎基茎中茎顶叶柄叶

分离部位

健康植株发病初期发病后期


2.2 2.2 花生植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化花生植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化

02468

101214

青枯雷尔氏菌浓度

×10

（6 cf

u/g）

根茎基

分离部位

健康植株发病初期发病中期发病后期

只在青枯病发病初只在青枯病发病初期、中期和后期的植期、中期和后期的植株的根、茎基部分离株的根、茎基部分离到青枯菌，而且全部到青枯菌，而且全部为强致病力菌株。为强致病力菌株。青枯菌的浓度随病青枯菌的浓度随病情指数增加而增大。情指数增加而增大。

2.32.3 生姜植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化生姜植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化

菌脓菌脓

水渍状水渍状


强致病力菌株强致病力菌株

无致病力菌株无致病力菌株



2.42.4 小结小结

从番茄青枯病发病初期的病株根部和青枯病发病后期的病从番茄青枯病发病初期的病株根部和青枯病发病后期的病

株茎中部分离到的青枯菌中除了强致病力的菌株外，还分株茎中部分离到的青枯菌中除了强致病力的菌株外，还分

离到少量无致病力的菌株，分别占离到少量无致病力的菌株，分别占 2.52.5 ％和％和 2.22.2 ％，％，

从生姜病株的茎部分离到的青枯菌均为无致病力的菌株，从生姜病株的茎部分离到的青枯菌均为无致病力的菌株，

而花生植株中未分离到无致病力青枯雷尔氏菌。而花生植株中未分离到无致病力青枯雷尔氏菌。

结果表明青枯雷尔氏菌在自然条件下在不同作物的不同部结果表明青枯雷尔氏菌在自然条件下在不同作物的不同部

位存在不同致病力的分化。位存在不同致病力的分化。

33 、、生防菌作用下青枯菌致病力分化的研究生防菌作用下青枯菌致病力分化的研究

实验方法：实验方法：

3.1 3.1 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化

青枯菌青枯菌

BC-0711BC-0711

5ml5ml

5ml5ml

24h24h 后后


3.1 3.1 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化

GMI1000GMI1000 无菌水对照无菌水对照

Rs80Rs80 生防菌处理生防菌处理GMI1000GMI1000 生防菌处理生防菌处理

Rs1100Rs1100 无菌水对照无菌水对照Rs80Rs80 无菌水对照无菌水对照

无致病力菌株（ 14.3 ％）

Rs1100Rs1100 生防菌处理生防菌处理Rs91Rs91 生防菌处理生防菌处理

Rs91Rs91 无菌水对照无菌水对照


3.2 3.2 生防菌持续作用下青枯菌生防菌持续作用下青枯菌 Rs91Rs91 的致病力分化的致病力分化

生防菌处理前的生防菌处理前的 Rs91Rs91

生防菌处理的第生防菌处理的第 33代代Rs91Rs91



生防菌与青枯雷尔氏菌生防菌与青枯雷尔氏菌Rs91Rs91 通过通过 33 代连续处理代连续处理后的菌株的致病力均未发后的菌株的致病力均未发生变化。生变化。

结果表明生防菌结果表明生防菌 BC-BC-07110711 对青枯雷尔氏菌对青枯雷尔氏菌Rs91Rs91 没有致弱作用。没有致弱作用。

生防菌生防菌 BC-0711BC-0711对对Rs1100Rs1100 的致弱现象是怎的致弱现象是怎么产生的呢？么产生的呢？


3.3 3.3 青枯菌青枯菌 Rs91Rs91和和 Rs1100Rs1100 继代培养过程中的致病力分化继代培养过程中的致病力分化

第第 22代代 Rs91Rs91 第第 55代代 Rs91Rs91

第第 22代代 Rs1100Rs1100

无致病力菌株（无致病力菌株（ 5.65.6％）％）

第第 55代代 Rs1100Rs1100

为研究生防菌为研究生防菌 BC-BC-07110711 对青枯菌致病对青枯菌致病力分化的关系对青枯力分化的关系对青枯雷尔氏菌雷尔氏菌 Rs91Rs91和和Rs1100Rs1100 进行连续进行连续 55代的继代培养。代的继代培养。

青枯雷尔氏菌青枯雷尔氏菌 Rs91Rs91在连续在连续 55 代继代培养代继代培养条件下未出现致病力条件下未出现致病力的分化。的分化。

Rs1100Rs1100 在继代至第在继代至第55 代时，出现无致病代时，出现无致病力青枯雷尔氏菌菌落。力青枯雷尔氏菌菌落。

当生防菌当生防菌 BC-0711BC-0711 处理致病力不稳定的青枯雷尔氏菌处理致病力不稳定的青枯雷尔氏菌时，由于生防菌对青枯雷尔氏菌不同致病力的菌株的抑制时，由于生防菌对青枯雷尔氏菌不同致病力的菌株的抑制作用存在差异，因此生防菌的抑制作用为青枯雷尔氏菌的作用存在差异，因此生防菌的抑制作用为青枯雷尔氏菌的分化提供了一个选择压力，因此青枯雷尔氏菌致病力分化分化提供了一个选择压力，因此青枯雷尔氏菌致病力分化现象较继代培养更早的出现，且比例更高，表现为致弱现现象较继代培养更早的出现，且比例更高，表现为致弱现象。象。

而当生防菌而当生防菌 BC-0711BC-0711 处理致病力稳定的青枯雷尔氏菌处理致病力稳定的青枯雷尔氏菌时，由于其自身不存在致病力分化，因此生防菌对其只有时，由于其自身不存在致病力分化，因此生防菌对其只有抑制作用，而没有致弱作用。抑制作用，而没有致弱作用。


3.4 3.4 小结小结

44 、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理、青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理

4.1 4.1 青枯雷尔氏菌的青枯雷尔氏菌的 Tn5Tn5 转化转化

试验方法：试验方法：

青枯菌青枯菌Rs91Rs91

感受态细胞感受态细胞电击转化，筛选电击转化，筛选

4.24.2 Rs91Rs91 与突变株菌落形态比较与突变株菌落形态比较

Rs91Rs91


4.34.3 突变株突变株 KanKanrr 基因检测基因检测

选取 40 株突变株 PCR 扩增 681bp 的卡那霉素抗性（ Kanr ）基因。引物为 P1: 5′-GGTGCGACAATCTATCGA-3′

P2: 5′-CTCATCGAGCATCAAATG-3′

700bp700bp


4.44.4 突变株遗传稳定性测定突变株遗传稳定性测定

700bp700bp

试验方法：利用引物检测继代前和继代后菌株的试验方法：利用引物检测继代前和继代后菌株的 KanKanRR 基因以及对继代后菌株基因以及对继代后菌株在抗性平板和非抗性平板上的菌落数来判断突变株的遗传稳定性。在抗性平板和非抗性平板上的菌落数来判断突变株的遗传稳定性。

泳道泳道 22 －－ 1111 为继代前菌株；泳道为继代前菌株；泳道 1212－－ 2121 为对应的继代后菌株为对应的继代后菌株


继代后的最后一代菌株稀释后，涂布于继代后的最后一代菌株稀释后，涂布于 TTCTTC平板和含卡那霉平板和含卡那霉素的素的 TTCTTC平板上的菌落数无显著差异。表明平板上的菌落数无显著差异。表明 Tn5Tn5 突变株具有突变株具有很高的遗传稳定性。很高的遗传稳定性。

0

50

100

150

200

250

300

350

400

T3 T5 T8 T21菌株

cfu

菌落数（

）TTC平板 TTC Km＋平板


4.44.4 突变株遗传稳定性测定突变株遗传稳定性测定

4.54.5 无致病力突变株致病力测定无致病力突变株致病力测定

原始菌株原始菌株 Rs91Rs91 在接种后第在接种后第 88 天即全部发病，至第天即全部发病，至第 1515天时已经萎蔫死亡，而天时已经萎蔫死亡，而待测突变株接种后待测突变株接种后 1515天的番茄苗与培养基空白接种的番茄苗没有差异，仍正常天的番茄苗与培养基空白接种的番茄苗没有差异，仍正常生长。生长。


表表 2 2 无致病力突变株无致病力突变株 T2T2 、、 T4T4、、 T5 T5 、、 T7T7和和 T8T8 的转座子插入位点的转座子插入位点

菌株编号Strains

基因Genes

转录产物Products description

碱基数Sizes/bp

插入位点Inserted location/bp

T2 phcALysR-type transcriptional

regulator1656 1382

T4 phcSTransmambrane sensor histidine kinase protein

1329 323

T5 pchALysR-type transcriptional

regulator1656 1048


regulator1656 1097


regulator1656 1489

4.6 4.6 青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点


无致病力突变株无致病力突变株 T2T2插入位点侧翼序列测序结果：插入位点侧翼序列测序结果：

1 CGAGCACTGA AGCGCCACTC CACCATGACT GTGCATGCAT GGCGGACCCA 51 GGCCGAGGTG GCGGCGCAGA CGGACATGAT CTTCACGGTC AACTCGCTGA 101 TGAAGGATCT GGTGTGCGAG GCCTACAACC TCAACGCCTT CCCGCTGCCG

151 TCCGAACTGG AAACCGTGCT GGGCCTGAAC ATGCTGTGGC ACCGCAGCCG 201 CAACACGCAC CCGATGCTGG TGTGGGCGCG CAACCCTGTC TCTTATACAC 251 ATCTCAACCA TCATCGATGA ATTGTGTCTC AAAATCTCTG ATGTTACATT

301 GCA

红色标记部分为 Tn5 转座子携带的 ME 序列， ME = Mosaic End 5'AGATGTGTATAAGAGACAG 3'

4.6 4.6 青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点测定青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点测定


4.6 4.6 青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点


通过通过 Tn5Tn5 转座子随机插入青枯雷尔氏菌转座子随机插入青枯雷尔氏菌 (Rs91)(Rs91)获得获得 10041004 株株

转座子随机插入突变株，经过在转座子随机插入突变株，经过在 TTCTTC 平板上的形态特征筛选平板上的形态特征筛选 ,, 其中其中

有有 1313 株突变株具有无致病力青枯雷尔氏菌的形态特征。株突变株具有无致病力青枯雷尔氏菌的形态特征。

对其中对其中 55 株无致病力突变株进行反向株无致病力突变株进行反向 PCRPCR 测序和序列比对，分析测序和序列比对，分析

鉴定出这鉴定出这 55 株青枯雷尔氏菌突变株的插入位点在株青枯雷尔氏菌突变株的插入位点在 phcAphcA 基因基因和和

phcSphcS 基因基因上，经番茄盆栽苗致病力检测上，经番茄盆栽苗致病力检测 ,, 确定为无致病力菌株。确定为无致病力菌株。

4.7 4.7 小结小结


55 、青枯菌无致病力突变株的生物学异质性、青枯菌无致病力突变株的生物学异质性

5.1 5.1 初始初始 pHpH 值对无致病力突变株生长的影值对无致病力突变株生长的影响响

0

0. 5

1

1. 5

2

2. 5

4 5 6 7 8 9 10pH值

OD60

0

T2 T4 T5 T7 T8 Rs91(CK)

pHpH值对值对 Rs91Rs91 和无致病力突变株和无致病力突变株 T2T2、、 T4T4 、、 T5T5、、 T7T7和和 T8T8 的影响的比较的影响的比较


5.2 5.2 培养温度对无致病力突变株生长的影响培养温度对无致病力突变株生长的影响

青枯菌生长判别：“－”不生长；“青枯菌生长判别：“－”不生长；“ +”+” 生长较差；“生长较差；“ ++”++” 生长较好；“生长较好；“ +++”+++” 生生长旺盛长旺盛

表表 3 3 温度对无致病力突变株生长的影响温度对无致病力突变株生长的影响

温度温度 T2T2 T4T4 T5T5 T7T7 T8T8 Rs91Rs91

15℃15℃ -- -- -- -- ++ --

25℃25℃ ++++ ++++ ++++++ ++++++ ++++++ ++

30℃30℃ ++++++ ++++++ ++++++ ++++++ ++++++ ++++++

35℃35℃ ++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++

45℃45℃ -- ++ ++ ++ -- --

5.35.3 无致病力突变株生长曲线异质性无致病力突变株生长曲线异质性

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 10 20 30 40

时间

OD 6

00

T2 T4 T5 T7 T8 91


55 株突变株进入对数生长期后的增长速率均显著小于原始菌株，进入稳定期株突变株进入对数生长期后的增长速率均显著小于原始菌株，进入稳定期后的菌量与原始株也存在显著差异。后的菌量与原始株也存在显著差异。

5.45.4 无致病力突变株胞外多糖含量异质性无致病力突变株胞外多糖含量异质性

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Rs91 T2 T4 T5 T7 T8

菌株

相对胞外多糖含量（ μg/OD 6

00）


原始菌株原始菌株 Rs91Rs91 的相对胞外多糖含量为的相对胞外多糖含量为 28.4528.45μμg/ODg/OD600600 ，无致病力突变株，无致病力突变株的相对胞外多糖含量则显著降低，为的相对胞外多糖含量则显著降低，为 11.81μg/OD11.81μg/OD600600 －－ 17.5917.59μμg/ODg/OD600 600

5.55.5 无致病力突变株无致病力突变株 TTCTTC 液体培养基分光光度计吸收峰分析液体培养基分光光度计吸收峰分析

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

390 400 410 420 430 440 450 460

波长（nm）

A值

T2 T4 T5 T7 T8 Rs91


无致病力突变株的吸收光谱曲线与原始菌株无致病力突变株的吸收光谱曲线与原始菌株 Rs91Rs91 的趋势一致，但是无致病的趋势一致，但是无致病力突变株的吸收光谱曲线均位于野生株上方力突变株的吸收光谱曲线均位于野生株上方。

TTCTTC 培养基发酵液聚类分析结果培养基发酵液聚类分析结果


5.55.5 无致病力突变株无致病力突变株 TTCTTC 液体培养基分光光度计吸收峰分析液体培养基分光光度计吸收峰分析

通过聚类分析发现，当通过聚类分析发现，当 λλ＝＝ 3.063.06 时将时将 Rs91Rs91、、 phcAphcA 基因突变株和基因突变株和 phcSphcS 基基因突变株聚为三类，分别是野生株因突变株聚为三类，分别是野生株 Rs91Rs91 为第为第 II类类 ,,phcAphcA 基因突变株聚为第基因突变株聚为第IIII 类，类， phcSphcS 基因突变株为第基因突变株为第 IIIIII 类类

比较了这比较了这 55 株突变株与原始菌株的生理生化特性，这株突变株与原始菌株的生理生化特性，这 55 株突变株株突变株

的生长速率和相对胞外多糖含量显著低于的生长速率和相对胞外多糖含量显著低于 Rs91Rs91 ，但最适，但最适 pHpH 值和最值和最

适温度未发生变化。适温度未发生变化。

55 株突变株株突变株 TTCTTC 液体培养基上清液在紫外液体培养基上清液在紫外 -- 可见分光光度计上于可见分光光度计上于

400-450nm400-450nm 波长上吸收峰的扫描结果通过聚类分析发现这波长上吸收峰的扫描结果通过聚类分析发现这 55 株突株突

变株与原始菌株变株与原始菌株 Rs91Rs91 分别聚为不同的三类，即分别聚为不同的三类，即 Rs91Rs91 为第为第 II

类，类， phcAphcA 基因突变株为第基因突变株为第 IIII 类，类， phcSphcS 基因突变株为第基因突变株为第 IIIIII 类。类。


5.65.6 小结小结

致谢致谢

• 感谢我的导师刘波研究员对我的精心指导，不仅感谢我的导师刘波研究员对我的精心指导，不仅培养了我的专业能力，还教会我很多为人处世之培养了我的专业能力，还教会我很多为人处世之道；道；

• 感谢实验室的车建美在试验和论文撰写过程中给感谢实验室的车建美在试验和论文撰写过程中给予的指导和帮助；予的指导和帮助；

• 感谢实验室的工作人员和同学们对我试验和生活感谢实验室的工作人员和同学们对我试验和生活上的帮助。上的帮助。

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