流式细胞仪分析技术及应用

上海交通大学医学院丁磊副教授

流式细胞术流式细胞术 (FCM)(FCM) 定义定义 :: FCM 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。

FALS Sensor

Laser

特点特点 :: 单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞

一、 流式细胞仪的分析及分选原理二、 数据的显示与分析三、 流式细胞仪分析的技术要求四、 流式细胞术应用

一 工作原理： FCM 是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。

流式细胞仪的分析及分选原理

1 、液流系统 样品流和鞘流 2、光学系统 激光、透镜组、 光电倍增管等。 3 、数据处理系统

( 一） 基本组成结构

Injector Tip

荧光信号荧光信号

激光束激光束

Sheath fluid

样品流和鞘流1 、液流系统

流动室

Laser

Flow Cell

孔径 50-200m 检测区离喷口 200m有分选功能

液流驱动系统（示意图）

流速与压力的关系服从 Bernoulli 方程，即 P=(1/2)V2 ( 忽略高度的变化 )。改变气压 ,就可获得不同的流速。

PMT

PMT

PMT

PMT

DichroicFilters

BandpassFilters

Laser

1

2

3

4

Flow cell

激光、透镜组、光电倍增管等。2 、光学系统

E0 E0 E0

E1 E1 E1

吸收 自发辐射 受激辐射

hvhvhvhvhv

当物质受到强烈激励 , 使某一能级的粒子数大量积聚 ,发生粒子数反分布 . 如有光束入射 , 入射光子与粒子发生完全弹性碰撞 , 使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一个光子 . 光子的能量与入射光子能量相同 , 有一致的方向和恒定的位相关系 , 这种发射称受激发射 .

球透镜和柱面透镜 ：20×200m 椭圆形光，短轴和细胞流平行，长长轴与细胞流垂直。 光束成形与细胞受照方

式

激发光焦斑

这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照 FCMFCM的的单细胞照明技术单细胞照明技术 ..

光束成形与细胞受照方

式

（二） 基本工作原理

单细胞流：流动室

单细胞照明：激光

488 nm laser

488 nm laser

单细胞检测：信号处理

（一）前向散射光 (foword scatter) ： FSC 信号的强弱与细胞的大小相关（二）侧向散射光（ side scatter) ： SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关

二 散射光的测定

FALS Sensor

Laser

Forward Angle Light Scatter

细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关 .

90 Degree Light Scatter

FALS Sensor

90LS Sensor

Laser

细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关 .

前向散色光 FSC

侧向散色光 SSC

利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。

散射光的测定

荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长（一）光信号测量 线性放大器 对数放大器

三 荧光测量

EthidiumEthidium

PEPE

cis-Parinaric acidcis-Parinaric acid

Texas RedTexas Red

PE-TR Conj.PE-TR Conj.

PIPI

FITCFITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Common

Laser Lines

DNADNA

Excitation Emisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

（二）荧光补偿

利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”

荧光补偿

（一）分选的基本原理488 nm laser

+-Charged Plates

Single cells sortedinto test tubes

FALS Sensor

Fluorescence detector

四 细胞分选原理

阳性选择

MACS-Magnetic Cell Sorting

磁珠分

离阴性选

择

1 、分选速度：几千个细胞 /秒2 、分选纯度 :99.5% 左右3 、分选收获率 :90-95%4 、分选得率

（二）分选的技术要求

分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。 分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。

数据的显示和分析 一、参数前向散射光 FS: 反映颗粒的大小侧向散射光 SS: 细胞内部结构复杂程度荧光 FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少

二、数据的显示方式（一） 单参数直方图显示（二） 双参数显示（三） 三参数显示

以分布直方图 ( distribution histogram )来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。

( 一 ) 单参数直方图的显示Single-Parameter Histogram Displays

X 轴表示绿荧光信号 (CD3) 强弱 ,Y 轴则反应细胞的数量 .

( 二 )双参数数据的显示Two-Parameter Data Displays

细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图 ( Dot Plot ) 。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。

纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数 ,在图中每一个点代表一个细胞1 、点图

双参数点图

双参数点图

用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。2 、二维等高图

纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数 ,Z轴为细胞数。3 、假三维等高图

三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。( 三 ) 三参数直方图

一般利用所得参数的两两组合并利用设门（ Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。（四）流式细胞仪的多参数分析

1 、 Region设置

2 、 设置

Gate

样品制备：单细胞悬液 特定荧光染料的选择：光谱重叠 阴性对照的设置 : 检测标本的重复性 质量控制

流式细胞仪免疫分析的技术要求

细胞碎片 细胞团块 离心漂洗 固定剂

一、免疫检测样品制备

淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。Ficoll,40kd ，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为 1.0177±0.001 的分层液 ).

（一）外周血淋巴细胞样品的制备

利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图

单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。

（二 ) 培养细胞的样品制备

机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法： EDTA 、 EGTA 等。 表面活性剂处理法： Triton-x100 、皂素等。

机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。 FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。

防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。2、乙醇与甲醇保存法： 70% 冷乙醇、 75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。

( 四）单细胞悬液的保存

染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料

荧光染料 激发波长（ nm) 发射波长（ nm) 颜色FITC 488 525 深蓝色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色

二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm 波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。

Laser

CY5

PE

CY5

CY5488nm

能量传递染料：

荧光染料与细胞成分的结合方式： 结构亲和方式 嵌入结合方式 共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式1 、直接免疫荧光染色2 、间接免疫荧光染色

（二）免疫荧光标记

3 、双或多参数荧光抗体的组合标记FITC+PE 488 525 、 575 绿色、橙色FITC+T red 488 525 绿色 568 615 红色FITC+PeCy5 488 525 、 675 绿色、 红色FITC+ ECD 488 525 、 625 绿色、橙红色F+P +PeCy5 488 525 、 575 、 675 绿、橙、红色F+ ECD +PeCy5 488 525 、 575 、 675 绿、 橙红色、红色F+P+APC 488 525 、 575 绿色、橙色 633 670 红色

荧光染料 激发波长（ nm) 发射波长（ nm) 颜色

FITC 的激发波长处于自发荧光的光谱区内，因此 FITC荧光易受自发荧光的干扰。

( 三 ) 细胞的自发荧光

（一）单细胞悬液制备的质量控制（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 1 、温度对荧光染色的影响 2 、 pH 对荧光发射强度的影响 3 、荧光染料浓度的控制 4 、固定剂对荧光染色的影响（三）仪器操作技术的质量控制

三、流式细胞免疫学技术的质量控制

1 、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为同型对照（阴性对照） 2 、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控，使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。

（四）免疫检测的质量控制

一、淋巴细胞及其亚群的分析 流式细胞的应用二、淋巴细胞功能分析三、白血病免疫分型四、肿瘤耐药基因分析五、在 AIDS病检测中的分析六、自身免疫性疾病相关 HLA 抗原分析