Τεχνικές μελέτης καρκίνου

• Μορφολογία (πρότυπο ανάπτυξης, μορφολογία κυττάρων, υποστρώματος κτλ.)

• Ιστοχημεία (ειδικές κυτταροχημικές χρώσεις)

• Ανοσοϊστοχημεία (ταυτοποίηση προέλευσης κυττάρων, δείκτες διαφοροποίησης, πολλαπλασιασμού κ.α.)

• Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

• Κυτταρομετρία ροής• Κυτταρογενετική• Μοριακή διαγνωστική

Mycobacterium tuberculosis in lung, Ziehl-Neelsen acid fast stain

Ειδικές Ιστοχημικές Χρώσεις

Glycogen in Ewing's sarcoma, PAS stain

The t(14;19)(q32;q13)-positive small B-cell leukaemia

The t(14;19)(q32;q13)-positive small B-cell leukaemia

The t(14;19)(q32;q13)-positive small B-cell leukaemia

Fluorescence in situ hybridizationt(11;14)

Real-Time PCR

Real-Time PCR

Real-Time PCR

Advantages of Real-Time PCR

• No post-PCR manipulation is required. Thus, the results are available as soon as PCR is completed (i.e., within two hours) decreasing the turnaround time and additionally reducing the risk of PCR contamination.

• This methodology allows co-amplification and detection of a normalizer gene (housekeeping gene and/or positive internal control) in the same tube to obtain accurate quantitative measurements and to confirm the presence of amplifiable DNA in a test sample.

• Decreased variability, because the collection of the data is performed during the exponential phase of the PCR, thus the results are not influenced by limited reagents.

• As the TaqMan probe is complementary to the target, the assay is target specific.

• High sensitivity, 1 tumor cell in 100,000 normal cells can be detected.

t(2;5)(p23;q35)

RT-PCRLong-range PCRClassical cytogeneticsFISHALK immunostaining

Methods of detection

Τραχηλικός λεμφαδένας

Η&Ε

CD3

CD5

CD20

Ki67 (MIB-1)

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

250 300 350 400 450

PO LYA .A 0 1 _ 0 6 1 2 2 2 1 0D O

Size (nt)

Dye

Sig

nal

243.41

246.04

247.77

248.84

250.15

252.84

252.89

255.57

255.83

258.23

258.75

261.23

261.26

264.04

264.49

267.07

267.20

270.37

273.33

273.50

275.16

276.30

277.36

284.95

286.44

362.15

364.22

365.17

395.60

403.46

404.61

454.59

457.43

460.40

2

Πολυκλωνικά T λεμφοκύτταρα (control)Συνδυασμός εκκινητών: Vβ+Jβ1+Jβ2 (αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων 240-285bp)

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

0 9 A .B 0 1 _ 0 6 1 2 2 2 1 0 D S

Size (nt)

Dye

Sig

nal

59.11

62.70

64.20131.00

199.10

266.01

267.17

268.20

273.41

Μονοκλωνικά Τ λεμφοκύτταρα (control)Συνδυασμός εκκινητών: Vβ+Jβ1+Jβ2

3

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

220 230 240 250 260 270 280 290 300 310

F 1 .D 0 1 _ 0 7 1 1 0 8 1 5 4 D

Size (nt)

Dye

Sig

nal

258.45

259.35

265.46

266.37

ΑΣΘΕΝΗΣΣυνδυασμός εκκινητών: Vβ+Jβ1+Jβ2 (αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων 240-285bp)

Μονοκλωνικός πληθυσμός Τ λεμφοκυττάρων (βέλη)

4

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

150 175 200 225 250 275 300 325

F 3 .F 0 1 _ 0 7 1 1 0 8 1 5 4 I

Size (nt)

Dye

Sig

nal

160.15 180.00

185.86

195.28

200.05 220.48 240.37 260.57 280.72291.24

292.25

306.37

307.36

308.19 321.10

ΑσθενηςΣυνδυασμός εκκινητών: Dβ+Jβ (αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων 170-210 και 285-325bp)

Ύπαρξη μονοκλωνικού πληθυσμού Τ λεμφοκυττάρων (βέλος)

10

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

50 100 150 200 250 300

PO LY C .A 0 2 _ 0 7 0 1 0 9 1 1 S G

Size (nt)

Dye

Sig

nal

105.58

107.49

108.64

111.26

113.33

114.43

117.37

119.31

120.40

123.37

126.43

129.44

132.44

135.44

138.50

141.50

144.39

145.69

147.59

150.55

153.29

154.40

156.41

159.67

162.09

Πολυκλωνικά Β λεμφοκύτταρα (control)Συνδυασμός εκκινητών FR3: VH1-7+JH consensus

(αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων 100-170bp)

8

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

75 100 125 150 175 200 225 250 275

1 9 C .B 0 2 _ 0 7 0 1 0 9 1 1 SH

Size (nt)

Dye

Sig

nal

73.86

148.40

149.47

Μονοκλωνικά Β λεμφοκύτταρα (control)Συνδυασμός εκκινητών FR3: VH1-7+JH consensus

9

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

75 100 125 150 175 200 225 250

C .G 0 1 _ 0 7 1 0 2 6 1 0 C O

Size (nt)

Dye

Sig

nal

80.74 100.36

152.31

159.83

187.31

188.36

189.82

212.05

ΑΣΘΕΝΗΣ (μυελός)Συνδυασμός εκκινητών FR3: VH1-7+JH consensus (αναμενόμενο μέγεθος PCR προϊόντων 100-170bp )

Ύπαρξη μονοκλωνικού πληθυσμoύ

Β λεμφοκυττάρων (βέλος)

10

• Μεθοδολογία ελέγχου ύπαρξης μεταλλάξεων στην κινάση Abl• Απομόνωση RNA από 10cc ηπαρινισμένου περιφερικού αίματος (Qiagen RNA blood)• Εκτίμηση ποιότητας/ποσότητας RNA (Agilent 2100 Bioanalyzer)• Ανάστροφη μεταγραφή 1 μg RNA προς cDNA• Εκτέλεση PCR αντίδρασης, με κατάλληλους εκκινητές, για τον πολλαπλασιασμό του υβριδικού γονιδίου

BCR/ABL.• 2μl από την πρώτη PCR χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση 2ης PCR για τον πολλαπλασιασμό του ABL του

υβριδικού γονιδίου BCR/ABL, με κατάλληλους εκκινητές. (S. Branford et al, Blood, 2002;99 3472-3475)• BCR ABL

1η PCR• • 2η PCR (820bp)• Κλωνοποίηση PCR προιόντος σε ΤΑ vector• Διαμόλυνση E. Coli (TOP10F) και απομόνωση πλασμιδιακού DNA από 7 αποικίες• Ανάλυση αλληλουχίας βάσεων πλασμιδίων (Beckman-Coulter CEQ8000), με ανάγνωση και από τις δύο

κατευθύνσεις• Σύγκριση των αλληλουχιών βάσεων των πλασμιδίων με τη γενωμική αλληλουχία του γονιδίου ABL.• Με την τεχνική αυτή έχουμε ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο ΑBL που εμπεριέχεται στο παθολογικό υβριδικό

γονίδιο BCR/ABL με ευαισθησία 14%.• ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ • Aνιχνεύθηκε η μετάλλαξη Ε255Κ σε 4 από τις 7 αλληλουχίες που αναλύθηκαν.

p-loop Catalytic domain

Activation loop

M244V E355G L364I S417Y E450G

L370P

E459KL248Q

M351T

Υ253Η

F359VE255K

V379I

T315I

Ασθενης

Bcr/abl

abl

Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

Λειομυοσάρκωμα Σάρκωμα Ewing

Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

Μελάνωμα Μεσοθηλίωμα