Leica TCS SP2 Leica TCS SP2 Confocal Spectral MicroscopeConfocal Spectral Microscope ( UV-VIS ) ( UV-VIS )雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡

簡易使用流程簡易使用流程 ((modified by Dr. Chien)modified by Dr. Chien)

因為樣品的差異性頗高 , 所以 , 本操作流程僅是提供一套簡易流程 , 供使用人員參考 . 然而 , 最佳的使用控制調整 , 應該以您個人使用中的樣品為唯一準則 .

美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製 TEL : 02-2808-1452 / E-mail : confocal@major.com.tw 緊急聯絡 : 0933-267 613 ( 24 hours on-call )

系統簡介 :

共軛焦掃描器( 請參考光路圖 )

可見光雷射系統 及 電路控制系統UV 雷射 : 另有獨立的供電開關

雷射電源開關供電電源開關防震桌

螢光燈源 _ 汞燈

穿透光燈源鹵素燈

顯微鏡總電源開關反射 / 螢光 及 穿透光光源的切換開關

影像掃描擷取操控旋鈕 ( Control Panel )

Ar/Kr 雷射調整旋鈕螢光濾鏡轉盤

多光子螢光影像感測用的附加光電倍增管 PMT

穿透光影像感測 PMT ( Phase contrast, DIC )

螢光感測用 PMT( 依組配有 1 – 4 個 Channel )

K-Scanner

Z- 軸掃描

分光鏡

掃描器冷卻裝置

鏡頭瞳孔照明之光徑調控鏡

分光菱鏡

UV 光針孔鏡Pinhole lens

開機流程 : Step 1

開機注意事項 :

• 確定電源為 AC220 V.

• 確定冷氣空調開啟 .

UV 雷射電源可見光雷射系統電源

開機流程 : Step 2 打開顯微鏡燈源1. 螢光用汞燈2. 穿透光用鹵素燈

打開顯微鏡燈源1. 螢光用汞燈2. 穿透光用鹵素燈

1. 按下汞燈開關 置於桌下 / Hg 50 W – * 汞燈開關使用間距至少須達 30 分鐘以上 * 汞燈使用壽命一般為 100 小時 , 然而 , 必須視實際燈管效益而定 . 更換時 , 請由專人更換調整 . 未經許可 , 勿擅自動手 .

2. 按右邊的顯微鏡總電源開關 ( 左邊為 上下 鹵素燈源的切換開關 / Halogen 12V / 100W )

開機流程 :

7. 啟動 Ar 雷射 , 調整旋鈕 轉到 12 點鐘位置

Step 3 開啟共軛焦供電系統開啟共軛焦供電系統

首先按下 Scanner 鈕 ,開啟掃描器電源

1 23

4561. Scanner_ 掃描器電源

2. 電腦電源

3. Ar 雷射電源

4. He-Ne 雷射 ( Red ) 電源 ( 鑰匙往右扳下 )

5. He-Ne 雷射 ( Yellow ) 電源 ( 鑰匙往右扳下 )

6. 啟動 Ar 雷射 , 鑰匙 往右扳至 Start 位置 , 再往左扳回 至中點位置

7

請依序 1 – 7 按序開機

1. UV Laser 351 nm/ 364nm (* UV laser 請由專人開啟 ) 

2. Ar Laser 458 nm / 488 nm

3. He-Ne Laser 543 nm            

4. He-Ne Laser 633 nm

檢視樣品

Step 1 : 調焦使用電控升降載物檯 , 將樣品移至近焦距處 , 用微調旋轉鈕調焦 .

使用浸漬油時 , 不能有氣泡產生 .

Step 2 : 光路控制拉桿推入 VIS 位置 , 用眼晶觀察樣品

Step 3 :選用適當的螢光濾鏡“ 2 ” = I2 ( FITC )“ 3 “ = N2.( Rodamine )

Step 4 :將 Tube lens 轉到UV-Scan 的位置 Step 5 :

聚焦後 , 將汞燈柵門關掉 , 避免汞燈過度曝晒樣品 , 造成螢光漂白

啟動軟體

啟動軟體 ( 以滑鼠點選 , 按二下 )

電腦會自動起始化

掃描過程中 , 請勿觸碰顯微鏡 及 防震桌 !

電腦啟動後 , 螢幕會顯示告知 , 按下 [ Ctrl _ Alt _ Del ]然後 , 不用輸入 Password, 即進入 Windows NT 系統

如果有設密碼 : User : [administrator] / Password : [admin]

Start dialog

選取

由於系統啟動後 , 掃描器會自動校準 , 顯微鏡的 Z- 掃描台會自動歸零 ,而焦距有所位移 . 所以 , 有時 , 必須再看一下顯微鏡下的樣品 , 是否有在聚焦位置 ?

A. 顯微鏡觀察及調焦B. 選用螢光感測光譜設定 … [ Acquire ] … [ Beam ]

C. 設定基本掃描參數 .. [ Obj ] .. [ Mode ] .. [ Format ] .. [ Speed ]

D. 設定 Panel Box 的調控參數 與 配置位置E. 依序執行影像擷取功能 Continuous scan ( 連續掃描 _ 取得最佳調控 ) Single scan ( 單一 2D 影像擷取 ) Series scan ( 連續斷層 3D 影像擷取 )F. 儲存結果 與 進階影像處理 , 量測 , 編輯 , 輸出列印 .

啟動軟體之前的注意事項 :

4. 往外拉至 TCS

5. 轉至 “ 4 ” Scanner 的位置

6. 轉至 UV-Scanner 位置 ( 如有 UV-laser 裝置 )

3. 開啟雷射電源 , Ar 雷射調整旋鈕 轉到 12 點鐘位置* UV laser 請由專人開啟

如果已完成一般顯微鏡的鏡檢及聚焦 , 請依序執下列操作 :

1. 先開 Scanner2. 再開 PC

注意 :

請留意每一個小 [ 圖示區 ] 的位置 , 因為底下的控制版面是

可更改設定與移動的 . 所以 , 使用人員必須先行清楚每一

圖示區的放置位置 . ( 未經允許 , 請勿擅自更改圖示區的配置 )

圖示區 : Control Button ( 可編輯 , 可認意組配安置 … ..您現在使用中的圖示區安排可能與本圖示配置不同 )

Control Panel 的位置與參數設定

Control Panel 有 7 個對應位置 , 針對每一個對應位置 , 設定所要使用的控置參數

以滑鼠按一下 , 即可得到參數選單 .Z-focus

PMT Gain 1/2/3/4

PinholeZoom

檔案管理 ( 存取 )

選取 [ Acquire ].. [ Beam ]選取 [ Acquire ].. [ Beam ]

選取應用設定設定光路及螢光感測光譜範圍

L : 代表原廠設定無法變更設定

U :代表使用者設定可變更設定

如果要自行設定條件及一個專屬應用檔名則 , 僅按 SAVE 後 , 輸入檔明即可 .

參數設定

選取 Glow ( O )Active表示選用螢光感測 PMT

Active

光譜範圍調整可自行調整光譜範圍或 選用 PMT.

Glow, Glow (Over) 訊號感測超過閥值 , 會警示與變藍色Glow (Under), Glow (Over & Under)

如果應用為 綠色 及 紅色 兩種顯色

雷射激發波長

螢光釋放波長

穿透光影像感測用 PMT

可見光雷射調控 ( AOTF )選用雷射波長調整雷射強度

光路徑

分光鏡

2. 選取所使用中的物鏡 如 PL-APO 63x / 1.32 Oil

1. 選取 XYZ 掃描模式

7. 選取 8 bits

選取 單向掃描 ( Unidirection )如果按下滑鼠 , 則為雙向掃描

4. 選取 400 Medium

6. Zoom 選取 1

3. 選 512 x 512

基本掃描參數設定基本掃描參數設定

5. 選 Airy 1

完成上列基本設定後 , 即可開始執行連續掃描 ( Continuous scan )完成上列基本設定後 , 即可開始執行連續掃描 ( Continuous scan )

在完成 [ Acquire ] – [ Beam ] 設定後 :

連續掃描 ( Continuous scan )連續掃描 ( Continuous scan )

快速調整 PMT 感測的 gain, 以藍色顯示出現一點點為最佳狀態

調整聚焦 , 讓影像清析

此位置應設為 “ Z “ 軸調控 .此位置應設為 “ Z “ 軸調控 .

小小技巧 : 除了 PMT 及 Z-focus 調整外 , 也可調整雷射強度 , 光譜感測範圍 , 或 Pinhole 大小 , 或改變 PMT 的 Offset. 如果 , 在經過上列的基本調整後 , 已可取得不錯的影像 , 則可再按一下 [ Continuous ] scan , 即可取得影像 , 供儲存 .如果 , 影像仍然有雜訊或不夠銳比 , 則可考慮再使用平均 ( average ) 的擷取處理 . Averaging 1 – 64 範圍 , 可供選取使用 , 供影像擷取的平均化 , 以消除雜訊 ( 但 , 易光漂白的染劑不適用此法 )

移動掃描中的影像

存取個人 Panel-Box 設定

影像調控 顯示視窗影像調控 顯示視窗

調控參數即時顯示

如果是取得 series 影像 , 可利用此鈕 , 播放連續動態影像

按一下滑鼠右鍵 , 可更改顯示顏色

1ch

1ch

2ch

3ch

4

如果應用為 3-ch.( FITC / TRITC / Cy5)

則第 4 個 ch. 顯示區

為 3-ch Overlay 所用

Overlay

此為 Index color即是 , 依照所選定的顏色來作套色

Mode 功能解說

xyz An image stack is recorded from xy-sections in z-direction. ( 最為常用的掃描模式 )

xzy An image stack is recorded from xz-sections in y-direction.

xt A line is recorded several successive times.

xytAn xy-section is recorded several successive times.

xztAn xz-section is recorded several successive times.

xyzt An image stack is recorded from xy-sections in z-direction several successive times.

xyAn xy-section is recorded at different wavelengths. ( 波長掃描 )

xz An xz-section is recorded at different wavelengths.

Mode : 影像擷取掃描模式Mode : 影像擷取掃描模式

Single Scan / 單一影像擷取Single Scan / 單一影像擷取

選取 ( 可配合 Line average 或 Averaging _ Frame by Frame )

3D series / 連續斷層影像擷取3D series / 連續斷層影像擷取

1. 連續掃描時 , 調 Z- 焦距 , 找出最上點 , 在 Begin 按一下 ,

2. 再找出最下點 , 然後在 End 按一下 .

3. 最後又於 連續掃描框內 ( continuous ) 按一下 .

4. 再選切片數目 , 平均數目 , 按 Series 光切掃描 .

可配合 Averaging以消除雜訊

每一切片的影像要做平均處理嗎 ?

決定光切數目

The Image Tool Window

Tool selection

Operation Buttons

Dialog of the current Tool

Preview

Rotation

Preview

快速預覽

Animation

Rotation

Scaling the z-Axis

Projection & Animation 設定參考[ 3D ] .. [ ImageTool ][ 3D ] .. [ ImageTool ]

The Operation Buttons

Usage (IV)

Prev: Compute the result and show it in the Preview Window

Apply:Compute the result and transfer it into the Experiment

Close: Close the Image Tool Window

Projection & Animation

Projection & Animation Tool

Source

Parameter division

Current parameter

Maximum projection Average projection

Transparent projection Transparent projection (inverted z-Direction)

Projection & Animation

x-Axis

y-Axis

z-Axis

Original

z-Rot. = 25 y-Rot. = 120 x-Rot. = 120

Rotation

Projection & Animation

Projection & Animation

Stereo View

Projection & Animation

Stereo Effect

Near Object

Far Object Stereo Eye Angle

Projection & Animation

Stereo Effect

Images for the left and the right eye

Stereo Image

玻片 : 0.17 mm浸漬油 : r =1.5180

1. Beam : L : FITC 2. Laser : AOTF 調控約至 70% 處3. Objective : PL-APO 63x/1.32 Oil4. Mode : XYZ5. Format : 512 x 5126. Speed : 400 ( medium )7. Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 )

8. Zoom : 1 ( 原廠起始設定 )

9. Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 )

10. Average : 8 ( 原廠起始設定 )

11. PMT 1 gain : 約為 700 左右 12. 顯示 : Glow ( O )13. Overlay 顯示 : RGB14. Continuous scan : 取得所欲觀察的聚焦面15. 再按一次 Continuous : 停止掃描16. 如果影像品質及解析可被接受 , 請存此影像檔 .17. 如果訊號太弱 , 或有雜訊 , 請執行 Average ( 如取

12 張影像作為平均取像 )18. 執行 Single ( scan ) 即可取得單一影像 .

範例 : 單一螢光影像擷取 ( FITC ) 範例 : 單一螢光影像擷取 ( FITC )

玻片 : 0.17 mm浸漬油 : r =1.5180

1. Beam : L : FITC / TRITC2. Laser : AOTF 調控約至 70% 處3. Objective : PL-APO 63x/1.32 Oil4. Mode : XYZ5. Format : 512 x 5126. Speed : 400 ( medium )7. Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 )

8. Zoom : 1 ( 原廠起始設定 )

9. Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 )

10. Average : 8 ( 原廠起始設定 )

11. PMT 1 / 2 gain : 約為 700 左右 12. 顯示 : Glow ( O )13. Overlay 顯示 : RGB14. Continuous scan15. 再按一次 Continuous : 停止掃描16. 如果影像品質及解析可被接受 , 請存此影像檔 ( save

as ..)17. 如果訊號太弱 , 或有雜訊 , 請執行 Average ( 如取 12 張

影像作為平均取像 )18. 執行 Single ( scan ) 即可取得單一影像 .

範例 : 雙重螢光影像擷取 ( FITC / TRITC) 範例 : 雙重螢光影像擷取 ( FITC / TRITC)

FITC

TRITC

Timelapse ( T ) / 長時間掃描記錄

在 Mode 選用有 “ T “ 功能的掃描模式才可執行此功能

Time-Series 1/4

• Line-Mode „xt“

• Frame-Mode „xyt“

• Stack-Mode „xyzt“

7 56

121110

8 4

21

9 3

x

t

xy xy xy7 56

121110

8 4

21

9 3

7 56

121110

8 4

21

9 3

t

7 56

121110

8 4

21

9 3

7 56

121110

8 4

21

9 3

xyz xyz xyz

t

Time-Series 2/4

• Line-Mode „xt“ Configuration

Time-Series 3/4

• Stack-Mode „xyt“ Configuration

Time-Series 4/4• Stack-Mode „xyzt“ Configuration

關機流程 :

首先按下 Scanner 鈕 ,開啟掃描器電源

5 78

234

1

請依序 1 – 7 按序關機

1. 關掉 Ar 雷射 , 往左調整 旋鈕轉到原點最小處 .

6. 結束軟體

注意 :當雷射冷卻至少 15 分鐘後再關掉 [ 8 ] 位置的電源 ( 風扇 )

關掉顯微鏡燈源 ( 汞燈 , 鹵素燈 ), 擦鏡頭 , 關掉實驗室總開關