已知基因序列的获取策略——兼谈引物设计与序列分析

黄 钢第三军医大学遗传教研室

2006.11.1.

获取序列信息，设计合适的引物

选取相应的组织或细胞，提取 RNA 并 RT

PCR 扩增获得全长 cDNA

装入合适的克隆或表达载体，菌落 PCR 、酶切与测序证实

根据需要进一步进行亚克隆

RNase H 消化（可选）

一、如何获取已知目的基因的序列信息 先查找其蛋白相关信息 , 了解该基因编码

产物的基本情况与功能（www.expasy.org）

进一步查找其核酸相关序列信息，常用数据库： Genebank、 EBI、 DDBJ

二、目的基因 cDNA 序列的获取方法

cDNA 文库扫描 RT-PCR 人工合成

组织 RNA 的提取 在匀浆器中加工冷冻的组织 通过注射器加工冷冻的组织 在液氮中将组织研磨成粉末 在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解

更完全，产量比前二者多一倍。 合适的 RNA 提取方法加上合适的组织处

理方法，才能够获得最佳的提取效果

RNA 提取两要素 忌讳贪多：不能指望 1ml Trizol 提取 100mg 以

上组织，一般 50mg 用 1mlTrizol 较合适 速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬 Pr

otocol, 比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话，可以立即加入氯仿，立即离心， 14000rpm 离心10min, 取完上清加入 0.6~1 体积的异丙醇，立即高速离心（ 14,000rpm,5min ）， ..... 总之尽量快速！

尽量减少 RNAase 污染 RNase 的危害主要集中在将 RNA pellet

溶解在水中之后，防止 RNA 降解的重点应当放在组织样本的保存和 RNA 水溶液的保存上。

注意实验前的准备工作：各种器材的去RNAase 处理与无 RNAase 的准备。

长期保存 RNA 时建议用去离子甲酰胺溶解总 RNA沉淀

如何确认 RNA 的质量 RNA 的电泳图谱 检测 RNA 溶液的吸光度 保温试验 荧光染色、毛细管电泳和 Agilent2100生物分析仪分析

28S

18S

5S

RT 引物的选用

GSP ：适合序列肯定的模板，常用于一步法 RT－ PCR 。但是引物设计质量影响 RT 的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。

Oligo dT 引物 : 真核生物的 mRNA 适用，建议用于高质量 RNA及全长转录本的逆转录；

随机引物：适合各种 RNA 的 RT ，可用于mRNA 片段的逆转录。

RT 中提高合成全长 cDNA 的效率 消除mRNA 二级结构：逆转录之前将 RT 引物与 RNA 模板进行短暂的热变性 , 可破坏mRNA 二级结构 , 促进锚定引物与模板的正确配对。

选用 RNase H灭活改造的新型耐高温逆转录酶： Thermoscript 、 Superscript Ⅲ等， RT 后建议进行 RNase H消化处理。

锚定 RT 引物的选用： 5'–(T)25V N–3‘ 热启动 RT 有条件者选用 Tricine-EDTA Buffer 溶解 cDNA 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA

小于 5微克

可自己找公司合成

建议用热盖 PCR 仪或空气浴孵箱保温

建议选用 RNase H 消化

高保真 DNA 多聚酶的选用 常用高保真 DNA 多聚酶：如 Pfu、 Deep Vent 、 Vent 、

Pwo 、 KOD 、 Pyrobest 、 PrimerStar等 PCR 过程中 HotStart 与 Touchdown 的使用 高保真 DNA 多聚酶与普通 rTaq的混合使用 PCR 产物加 A尾进行 T-A 克隆：循环即将结束时加入

rTaq 5U 72 ℃保温 20～ 30 min 两步变温法 PCR

载体构建中的常见问题 利用单酶切位点将片段插入载体 双酶切中的问题对过长 cDNA 片段 : 可分段扩增，再利用

RE位点或重叠延伸融合成全长 cDNA 酶切位点甲基化的问题 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC

真核表达载体的选择

Promoter Conventional/Tissue-Specific/Inducible Poly (A) tail Kozak 序列：－ 9GCCGCCA/GCCAUGG＋

4

一个载体内的多基因表达 IRES系统 加 linker直接融合表达 多个独立的表达 cassettes ：优于共转

染表达

SOE 技术与基因人工合成及多基因融合

基因设计与人工合成中的密码子优化 DNAWorks 2.4 (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2002)

http://mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/

SOE ： Spliced by overlapping extension

搭桥技术融合基因

三、引物设计引物设计的 3 条基本原则： 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体

或发夹结构， 引物不能在模板的非目的位点引发 DNA

聚合反应 ( 即错配 ) 。

引物设计注意事项 引物的长度一般为 15-30 bp ，常用的是

18-27 bp ，但不应大于 38bp 。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。

引物 3’端的末位碱基对 Taq酶的 DNA合成效率有较大的影响。

5’ 端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等 . 通常应在5‘端限制酶位点外再加 1-3 个保护碱基。

简并引物：应选用简并程度低的密码子 , 例如选用只有一种密码子的Met, 3’ 端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

同源性或互补性：两引物间最好不存在 4个连续碱基的同源性或互补性。

GC 含量：一般为 40-60%。另外，上下游引物的 GC含量不能相差太大。

Tm 值：引物所对应模板位置序列的 Tm值在 72℃左右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式 Tm＝ 4(G+C) ＋ 2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近法 (the nearest neighbor method) 。

△G 值：指 DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△ G值较低（绝对值不超过 9），而 5’端和中间△ G值相对较高的引物。引物的 3’端的△ G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol ）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR反应不能正常进行。

Primer Premier 5.0

引物设计 限制性内切酶位点分析 DNA 基元 (motif)查找 同源性分析

Genetool V 2.0

Oligo6.69

四、测序图比对、拼接与虚拟克隆 (in silico cloning)

常用本地软件： Clone manager 、 Vector NTI 、 DNAstar 和 ds-Gene等

在线工具： BLAST等

常用序列拼接软件 DNAstar 的 SeqMan模块 VectorNTI程序的 Contig Express模块

Sequencher

开始→所有程序→ DNAstar →SeqMan

新的拼接任务

添加序列

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用鼠标点击更改序列方向和形式

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程序窗口，可以设定参数，一般用默认值即可。

导入测序结果（文件扩展名 ab1 改成abi ）相关软件 EditView for Macs ；Chroma for Windows] 也可以用鼠标右键

导入后可以双击查看和编辑各个测序结果

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