人 工 种 子

思 考 题• 用于制备人工种子的繁殖体主要有那些 ?

• 人工种子利用有何优点 ?

• 人工种子的应用前景如何 ? 需要解决那些问题 ?

• 为什么说微型变态器官是最有可能作为人工种子的繁殖体 ?

• 植物脱毒时如何进行外植体的处理？• 如何检测再生植株的脱毒效果？

Contents

1. 人工种子

2. 植物脱毒

体细胞胚再生途径的应用：

人工种子（ Artificial seed ）

穆拉希吉 （ Murashige ） 1978 年在第四届国际植物组织培养大会上首次提出研制人工种子的设想。

从 20 世纪 80 年代开始，美、日、法竞相掀起人工种子研制的热潮。我国在 1987 年也将人工种子的研究列入高技术发展计划（ 863 计划）。

研 究 简 史

国外已研制成胡萝卜、苜蓿、芹菜、花椰菜、莴苣、花旗松、天竺葵等植物的人工种子。我国继 1988 年在国际上首次研制成功水稻人工种子后，研制成了旱芹、花椰莱、杂交水稻等许多种作物的人工种子。

看一个视频：http://v.youku.com/v_show/id_XODYyMTM0OTI=.html

研 究 简 史

单子叶植物种子结构

定 义

• 人工种子（ Artificial seed ）：又称合成种子 (Synthetic seed) 或

体细胞种子 (Somatic seed) ，是指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳 (Artificial

endosperm) 和人工种皮 (Artificial seed coat) 中形成的类似种子的颗粒。

•

• 别名：合成种子、人造种子、无性种子、种子类似物 将植物离体培养中产生的胚状体（体胚）或者能发育成完整植株的分生组织（不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织等），包裹在有养分和具有保护功能的物质中形成的类似于天然植物种子的结构，并在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。

单子叶植物：小麦颖果的结构 双子叶植物：蓖麻种子结构

• 结构上从外向里包括三部分：（ 1 ）人工种皮外层，保护胚状体

中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；（ 2 ）人工胚乳，含有必需的营养成分和某些植物激素；（ 3 ）胚状体或芽。

••••

（ 3 ）可以固定杂种优势，加速良种繁育。（ 4 ）可作为植物基因工程和遗传工程的载体。（ 5 ）可保存珍贵稀有植物品种。（ 6 ）大规模繁殖植物（尤其是没有种子和种子昂贵的植物）

人工种子的优点

• （ 1 ）便于运输和储藏（相对于试管苗）。• （ 2 ）人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分，使人工种子优越于天然种子。

• 人工种子不仅能像天然种子一样可以贮存、运输、播种、萌发和成长为正常植株

• 人工种子技术有着诱人的前景

• 第一，培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的影响，且具有省地、省工、可直接在田间播种等优点

• 第二，在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，使长成的植株具备优良特性

• 第三，用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率

• 第四，一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产

• 天然种子在农业生产上受季节限制– 一般 1年只能繁殖 1-2次

• 人工种子可在实验室内大量生产，不受限制– 一个体积为 12L的发酵罐在二十天内可生产 1000 万粒

人工种子

• 一个新的水稻品种用常规方法培育需要七到八年时间

• 而用人工种子与常规育种结合良种繁育技术减少了移栽驯化过程，只需三四年时间

• 在人工种子的制作过程中，可以加入某些农药、有益微生物或生长调节物质，人为地控制植物的生长发育，播种后生长出来的植物就有一定的抗逆性

• 通过转基因技术，使离体培养的“胚”具有优良特性

• 天然种子是有性繁殖获得的，在遗传上具有因减数分裂引起的遗传重组分离现象

• 杂种优势只能体现在 F1代，而 F2代便参差不齐了• 人工种子属于无性繁殖范畴，可以保持杂种优势• 对于一些自然繁殖困难的名贵品种，也可通过人工

种子进行快速大量繁殖

物 种 主 要 结 果胡萝卜 (Daucus carota) 有菌土壤中发芽成苗苜蓿 (Medicago sativas) 有菌条件下发芽成苗芹菜 (Apium graveolens) 有菌条件下发芽成苗柑橘 (C. sinensis×C. reticulata) 无菌条件下发芽成苗挪威云杉 (Picea abies) 无菌及有菌条件下发芽松树 (Pinus lambertiana, P. aeda) 无菌及有菌条件下发芽玉米 (Zea mays) 无菌条件下发芽成苗杂交水稻 (O. sativa×O. lalifolia) 无菌条件下发芽橡胶树 (Hevea brasiliensis) 无菌条件下发芽西洋参 (Panax quinquefolium) 无菌条件下发芽刺五加 (Acanthopanax senticosus) 无菌及有菌条件下成苗黄连 (Coptis chinensis) 无菌及有菌条件下成苗

表 1 以体细胞胚为繁殖体的人工种子

物 种 繁殖体 主 要 结 果印度桑 (Morus indica) 芽 无菌条件下发芽成苗檀香 (Santalum ablum) 芽 无菌条件下发芽成苗花叶芋 (Caladium bicolor) 芽 无菌条件下发芽成苗百合 (Lilium) 小鳞茎 无菌条件下发芽成苗直杆桉树 (Eucalyptus maideni) 侧芽 无菌条件下发芽成苗莴苣 (Lacyuca sativa) 芽 无菌及有菌条件下发芽成苗华腺萼木 (Mycetia sienensis) 微芽 有菌土壤中发芽成苗大花蕙兰 (Cytobium) 原球茎 无菌条件下发芽石槲兰 (Dendrobium) 原球茎 无菌条件下发芽唐菖蒲 (Gladiolus hortalans) 球茎 无菌条件下发芽香蕉 (Musa acuminata) 微芽 无菌条件下发芽杨树 (Populus beijingy) 芽 无菌条件下发芽

表 2 以器官为繁殖体的人工种子

植物种类

繁殖体类型

培养程序及培养天数

培养基及蔗糖浓度

激素浓度（ mg./L ） 其它成分(mg/L)2,4-D NAA Zeatin BA Kin

芥菜型油菜

体细胞胚

Step I, 21 MS, 3% 2.0 1.0 1.0   

LH(100)

Step II, 21 MS, 3% 0.1 

1.0 0.5  LH(100), 谷氨酰

胺 (500)

微芽 21 MS, 3% 

0.05-0.2 

5.0   

桉树

体细胞胚

Step I, 20 B5, 4-5% 2.0-4.0     

1.0 

Step II, 28-56 改良 H, 3% 

0.2-0.5 

0.5 

ADE(40)

微芽 25 改良 H, 3% 

0.2-0.5  0.5-

2.0 

ADE(40)

茶树体细胞胚

Step I, 28 MS, 4% 0.5-1.0 

1.0 0.5   

Step II, 30 MS, 2-3%   

1.0 0.5  GA(0.3),

IAA(0.3-0.5)

不定芽

25 MS, 2-3% 

1.0 1.0   

IAA(0.3)

华腺萼木

体细胞胚

Step I, 25 MS, 3% 1.0 0.2 

1.0   

Step II, 20 MS, 0.2-0.3% 

0.2 

1.0   

不定芽

25 MS, 2-3% 

0.01 

0.2  IAA(0.3),

GA(0.1)

兰花 原球茎

25 MS, 2% 

0.1      椰子汁 (10%)

表 3 部分植物繁殖体诱导培养条件

人工种子长出的芹菜味道非常鲜美

黄连黄连

西洋参

莴苣

甘薯

•

橡胶树

苜蓿

檀香

•

• 由孢子体或配子体的细胞通过无性繁殖产生的一种类似于合子胚的结构

• 主要指在组织和细胞培养过程中，起源于非合子细胞（体细胞）并经过多次分裂产生的一种与胚相似的结构

• 组织培养或细胞培养的产物

• 起源于体细胞（非合子细胞），区别于由卵和精子受精形成的合子胚

• 具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构

• 发育过程与合子胚相同– 原胚→心形胚→鱼雷形胚→具子叶的成熟胚

心形胚鱼雷形胚

成熟胚

原胚

• 1958年， Reinert在胡萝卜的组织培养中最早发现了体细胞胚

•至今已从 43 科， 92 属， 100种以上植物中获得了体细胞胚

上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 lbhuang@shou.edu.cn

• 离体培养的器官在一定条件下可以从外植体上直接产生胚状体– 器官外植体的表皮细胞– 外植体内部的薄壁细胞

• 子叶和下胚轴：最容易诱导体细胞胚发生

•最常见的方式• 离体器官——愈伤组织——胚状体

– 脱分化 分化

• 能产生胚状体的愈伤组织：胚性愈伤组织– 多数来自 callus的表面细胞：玉米、西洋参

– 少数来自 callus的内部：猕猴桃

① ②

• 体胚原始细胞的特点–原生质较浓– 细胞核显著增大、位于细胞质的中央

原始细胞

顶端细胞

基 细胞

原胚 体胚

胚柄

1. 体细胞2. 分离的原生质体3. 小孢子等• 在胡萝卜上研究较多

• 制作人工种子的核心• 保证人工种子具有发芽力及转换为正常植株

– 体胚的诱导– 获得高质量的体胚

• 要求体胚发育完整、生长健壮

• 在无菌试管培养条件下，有 90%以上的体胚能正常萌发并转换为完整小植株

• ① 要有健壮的具有高转换率的体胚

• ② 对包裹材料的要求– 对体胚无损伤、无毒性

– 经得起在储藏、运输和种植过程中的一般操作

• ③ 人工种子中应含有易释放的养分和发育调节剂

• ④ 价廉物美、适合农业机械化播种

• 用于生产人工种子的植物– ①具有坚实组培工艺基础的作物（已具备能生产高质量体胚

的实验体系）• 苜蓿、胡萝卜、香菜等

– ② 具有强大商业基础及工艺基础的作物• 芹菜、莴苣、番茄、玉米等

– 一般来讲，农业、林业及园艺上大面积推广的优良作物品系、优质蔬菜、名贵药材等都可作为对象

• 在自然种子中，作为合子胚发育而存在的营养仓库——胚乳

• 人工胚乳的目的也是要通过各种必需物质的组合为体胚创造出一个微小的含有胶质的营养成份环境，为体胚转换时提供物质营养

• 既可以作为繁殖体生长的碳源物质，叉可以改变包被体系中的渗透势，防止营养成分外泄，还能在人工种子低温储藏过程中起保护作用

• 目前用于人工胚乳中的糖类主要有蔗糖、麦芽糖、果糖和淀粉等

• 其中以蔗糖应用最为广泛，促进人工种子转化成苗的效果也相对较好

• 叶志毅等 (2001) 制作桑树 (Morus alaba)体细胞胚人工种子时发现，与果糖相比，蔗糖更利于人工种子的发芽和生长

• 不同蔗糖浓度对人工种子萌发的影响也不同– Adriani等 (2000)对猕猴桃 (Actinidia deliciosa)不定芽的包被过

程中，发现增加蔗糖的浓度可增加其转化率

• 但也有研究表明蔗糖的作用不及麦芽糖好

•淀粉在人工种子包被中应用也比较广泛

•淀粉可以在胶囊中分解，为植物繁殖体的发育提供碳源支持

• Redenbaugh等 (1987)在制作苜蓿体细胞胚人工种子时发现，马铃薯淀粉能代替麦芽糖，使体胚转化率达 35.4%

• 黄绍兴等 (1995) 对木薯淀粉研究还发现

• 淀粉分子多孔状的结构可以改变海藻酸钙胶囊的致密结构，从而增加胶囊的透气性、保水性和吸水性，提高了人工种子的萌发率

• 在实际操作中，几种碳源成份配合使用也可以达到很好的效果

• 在人工胚乳中加入 BA、 IAA、 GA3、 NAA、 ABA等植物生长调节物质

• 可以促进体细胞胚胚根、胚芽的分化与生长，还可以促进非体细胞胚繁殖体转化成苗

• Antonietta等 (1998) 包被茶枝柑 (Citrus reticulata)的体细胞胚人工种子，发现在人工胚乳中附加 GA3能够使其萌发率由 26.7%提高到 50%

• 在半夏 (Pinellia ternata)小块茎人工种子中添加 GA3和 NAA可使其较易生根，成活率提高

• Saiprasad等 (2003) 包被兰属 (Orchid)植物球茎体，附加 BA（ 0.44 μmol/L，人工合成的细胞分裂素）和 NAA（ 0.54 μmol/L），可使其转化成苗率达 100%

• Ca2+可以作为很好的海藻酸钠的离子交换剂，用于人工种子包被中，对繁殖体的萌发与转化不造成影响

• 在海藻酸钠溶液中加入MS或White等培养基的大量元素、微量元素、有机物质等基本成分，将它们混合制成胶囊丸

• 为了促进体胚的生长，在人工胚乳中也加入促进胚根、胚芽生长的植物激素或有益微生物、杀虫剂、除草剂等农用化学药品，人为影响植物的抗逆性

• 包裹后胶囊硬度较为合适，且对体胚发育无明显不利影响的凝胶

• 海藻酸钠：普遍采用，从海藻中提取的多糖高分子化合物– 优点：使用方便、无毒性、价格低廉和具有一定的强度– 缺点：“易漏”，水溶性养分容易渗漏，易干

– 1987年，发现疏水性物质 Elvax-4260（乙烯、乙烯基乙配和丙烯酸共聚物）能在一定程度上减少人工种子之间的粘连，并明显减轻蒸发失水，涂抹后的苜蓿人工种子仍可正常发芽

– 1990年，半疏水性膜操作简便，且能够减少蒸发，对促进胡萝卜种子在土壤的萌发有一定作用，而亲水性外膜无明显效果

解决 办法 -1

• 1993年，利用脱乙烯壳聚糖涂抹海藻酸钠包被的油菜体细胞胚，发芽率达 100%

• 1994年，以 1～ 5 %丙烯酸树脂溶液成膜 10 min制作的外膜涂抹水稻人工种子效果较佳

• 1996年，石蜡能够有效地被烘干并具有一定的对氧的渗透性，用 0.4 mm的石蜡涂抹包被的细胞团，在空气中（ 25 ℃）储存 60 d仍可达到 90%的转化率

• 在海藻酸钠胶囊外面再包被一层海藻酸钠的方法也能达到与其他涂膜相同的效果– 在包被苹果顶芽时，采用两层包被的方法，较一层包被

的转化率（ 40％）相比可提高到 70％

• 添加纤维素衍生物 、活性炭和高分子化合物等– 1990年，在胡萝卜人工种子的研究中加入在MS培养基中浸泡过的活性炭，可以有效地减少营养成分的泄漏

• 1995年，在安祖花人工种子中加入 0.1 %的活性炭，不仅有效控制了营养物质的散失，也使其黄褐化率降低，萌发率和转化率提高

解决 办法 -2

• 在水稻人工种子中添加聚乙烯吡咯啉酮和聚乙烯醇高分子聚合物，形成的颗粒粘连少、较分散，且不易失水变形

• 在海藻酸钠中加入多糖、树胶、高岭土可减慢凝胶脱水速度，并提高了干化胡萝卜体细胞胚的活力

•两种措施结合使用，

• 可以更好地解决海藻酸钙胶囊的缺陷

• 1995 年，在安祖花人工种子胚乳中加入活性炭并用酯类共聚物涂抹使安祖花人工种子在有菌条件下的转化率可达 71.4%，较只加活性炭（ 42.5%）的情况要高

解决 办法 -3

• 另外，海藻酸钠包被的人工种子经低温储藏后，易在表面形

成坚硬的外壳而妨碍了人工种子的萌发

• KNO3 可用作海藻酸钠包被人工种子的软化剂， K +置换海藻

酸钙中的 Ca2+以达到软化的效果

• 2001年， Guerra等用 100 μmol/L KNO3的处理菲约果的

人工种子，与用蒸馏水处理的相比提高 81.2 %

•

•

•

•

•

•

高质量和高数量的胚状体是大量制备人工种子的基础。控制胚状体发育的同步化是人工种子制备的核心之一，主要方法如下：

抑制剂法：在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如 5-氨基尿嘧啶），一旦去除抑制剂后细胞可以同步发育。

低温法：低温处理抑制细胞分裂，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步化。

关键技术问题

• （ 1 ）胚状体同步发育

•

•

•

•

•

•

渗透压法：不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。

通气法：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通过在培养基中通入乙烯或氮气控制细胞同步分裂。

分离筛选法：用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同发育期的胚状体。

关键技术问题

• 理想的人工种皮 (Artifical seed coat) 应该具有保护胚状体的功能，并且具有无毒、良好的通气性、抗污染、适合运输等特点。

• 最早采用的材料是聚氧乙烯，但是具有一定毒性、易溶解于水等不足。目前采用海藻酸盐较多，其具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性低、成本低廉等优点。但是也存在一些缺点，例如：水性营养成分易流失、表面易结团等。因此，开发理想的人工种皮材料仍是一个重要课题。

（ 2 ）人工种皮制作

• 人工胚乳 (Artifical endosperm)主要包括无机盐、碳水化合物、蛋白质等（培养基组分）。是胚胎发育的营养保证。

• 由于糖等物质的存在易导致微生物污染，所以还要加入防腐剂、抗菌素、农药等成分。

（ 3 ）人工胚乳配制

藻酸钠等水溶性凝胶与 Ca2+进行离子交换后凝固

• 包埋是人工种子制作的重要一环。方法主要有以下两种：

• 干燥法：这是比较早的一种包埋方法。将胚状体置于 23℃、 70%左右相对湿度、黑暗条件下逐渐干燥，然后用聚氧乙烯等种皮材料包裹。

• 水凝胶法：这是目前比较常用的一种方法。用海2

的特点包埋单个胚状体或芽。种子硬度由凝胶浓度与络合时间控制。

（ 4） 包 埋

包埋液（人工胚乳）制备：2%-3% 的海藻酸钠 + 营养物、生长因子等。将成熟的体细胞胚胎与包被液相混合，然后将其滴入（只允许一个通过）适当浓度的氯化钙溶液中，经过络合作用（生成海藻酸钙）的造形过程，在 20-30 分钟内形成内含细胞胚、有一定硬度的雏形人工种子。

海藻酸钠包埋示意图

一般将人工种子贮藏在 4—7℃低温、相对湿度小于 67% 的条件下。实际上随贮藏时间的延长 , 人工种子的萌发率会显著下降。

（ 5 ）贮藏与发芽

• 目前，科学工作者已制成模式性人工种子的植物十余种，但距离实际应用还有很大距离

••••

（ 3 ）胚状体储藏阶段的休眠控制；（ 4 ）如何保证长期储藏而又不影响萌发率；（ 5 ）制作流程较繁琐、成本高。（ 6 ）许多植物还不能成功地诱导出高质量体细胞胚。

存在的问题

• （ 1 ）人工种皮性能不尽人意。• （ 2 ）还没有一种符合多数植物胚状体需要的人

工胚乳。

• 主要有三大难题有待克服

– ①许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚

– ②现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀

– ③人工种子的贮藏有待进一步完善

人工种子应用举例

的一种著名盆栽花卉。 一品红常采用扦插繁殖，繁殖速度慢。如何制备人工种子：器官发生途径：目前多以叶片、茎段为外植体诱导愈伤组织，再分步诱导芽和根，生成苗。体细胞胚途径：以苞片为外植体，离体诱导体细胞胚，制作人工种子。下面介绍这种方法。注意不同生长素 / 分裂素比例对于体细胞胚诱导的影响。

一品红人工种子制作

为什么要制备人工种子：一品红又名圣诞花，属大朗科，常绿溜木。是在元旦和圣诞节前夕观赏

（ 1 ）愈伤组织诱导：将一品红苞片常规消毒，切成 0.6cm2 小块，接种到添加不同浓度 6-BA 和 2 ， 4-D 的 MS 培养基中（表 1 ），每瓶接种 5片称重，第 20 天继代培养时再称重。培养温度 25度左右，暗培养。

2 ， 4-D/6-BA比例较高时 (2.0/0.5) 有利于愈伤组织诱导

2， 4-D： 2， 4- 二氯苯氧乙酸（生长素）6-BA： 6-苄基腺嘌呤（分裂素）

降低生长素 2 ， 4-D浓度 (1.0/0.5) ：体细胞胚分化率升高活性炭吸附减轻酚氧化的褐变，也有促进萌发效果

（ 2）体细胞胚诱导

1球形胚 2心形胚 3犁形胚6 人工种4 子叶期胚 5 人工种子

子萌发

（ 3 ）包埋与萌发——海藻酸盐法

胚状体悬浮在 3% 的海藻酸钠 +1/2MS 培养基 +6-

BA0.5mg/L （分裂素） +GA3(赤霉素 )0.5mg/L+IBA0.5mg/L （生长素） +1.5% 麦芽糖的混合液中 (赤霉素是生长调节剂，能促进不定胚发育成小植株 )

滴入到 2%氯化钙溶液里，络合 15 分钟，捞起，无菌水洗涤，干燥成一定强度的人工种子胶丸。播种在无激素的 MS 培养基上， 25度，光照 2000lx ， 12 小时 / 天， 30 天后计算萌发率。

人工种子的制备（胡萝卜为例）

体细胞胚的诱导

人工胚乳的制备

人工种皮的制备

人工种子的制备

二、人工种子的制备

人工胚乳的成分？

二、人工种子的制备

二、人工种子的制备

人工种子的制备

人工种子的制备

人工种子的制备

用褐藻酸钙水溶性胶囊包埋胚状体，图褐藻酸钙水凝胶法示意图包囊体在水中洗用以生产人工单胚种子称水凝胶法

二、人工种子的制备

制作人工种子的示意图

愈伤组织的器官发生方式

愈伤组织培养物在某些条件下：

可以再分化产 生 不 定 芽 或 根 的 分 生 组 织甚至是胚状体，继之，由这些有结构的组织而发育成苗。

愈伤组织通过不定芽方式再分化形成再生植株的方式主要有三种：

（ 1 ） 先产生芽，后在茎的基部长根；

（ 2 ）先长根，再长芽；

（ 3 ）愈伤组织的不同部位分别形成根和芽。

愈伤组织的器官发生方式

多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。生长素与细胞分裂素：

比例小时则产生芽比例大时则生根

愈伤组织的器官发生方式器官分化的植物激素控制理论：

体细胞胚的发生

愈伤组织 体细胞胚 植株

愈伤组织的器官发生方式

愈伤组织的器官发生方式

愈伤组织开始分化时，由大小不等的细胞开始逐渐形成大小均匀的细胞，保持相对稳定状态。

分化时，愈伤组织的表层和内部都可形成分生中心。

芽发生在愈伤组织的表层，属外起源。

根发生在组织的深处，与整体植株发生类似，是内起

源。组织的外部形态也随分化而改变，一般由疏松转向紧凑。

愈伤组织的器官发生方式