mRNA 差异显示技术（ DD）及其对动物育种的作用 曲亮 黄瑞华 * 邱新深 刘红林 王林云( 南京农业大学动物科技学院，南京， 210095) 基金项目：江苏省高技术研究项目（ BG200530

4 ）

DD 的发明及其基础由 Liang 于 1992 年创立

是分离差异表达基因强有力的工具 在随后几年里， Liang 等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便

基于 RT-PCR 理论，依赖于 3 种技术 1 ） RT-PCR 技术 2 ）以特定引物进行的 PCR 技术 3 ） DNA 电泳技术

DD 的原理

5’ M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ Poly(A) RNA5’ T12MN 3’锚定引物 逆转录

5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’3‘ M N TTTTTTTTTTTT 5’

变性5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ 3‘ M N TTTTTTTTTTTT 5’

退火5‘ T12MN 3’ 锚定引物寡核苷酸随机引物3‘ M N TTTTTTTTTTTT 5’延长dNTP 、 Taq 聚合酶

3‘ M N TTTTTTTTTTTT 5’5’ M’N’AAAAAAAAAAA 3’变性、退火、延伸电泳显示

T12MN(M 为 A 、 G 、C ， N 为 A 、 T 、 G 、

C) 启动 cDNA第一链合成

不同长度的PCR 产物

回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对

随机结合到 cDNA 链上

DD 目前的应用领域主要用于医学研究的癌症、神经、骨科、病理、生殖等领域动植物遗传、育种，动物营养及微生物等领域

DD 的优点以 RT-PCR 和 DNA 凝胶电泳为基础灵敏度高，仅需 0.2μg 的总 RNA可以同时比较多个样品间基因表达的差异 可以同时检测到“上调”及“下调”的基因 时间短，实验过程中可步步验证比较 可进行多基因家族的表达分析

DD 的缺点 假阳性高

样品 mRNA 可能有部分降解 有少量的 DNA 污染 单条带可能由一种以上 cDNA 片段所构成 有些特异 cDNA 片段太短 , 在 Northern 杂交时检测不到杂交信号 PCR 扩增了一些稀有 mRNA 片段 , 在杂交时显示不出差异表达的信号

绝大多数差异条带仅含有 3’-UTR 500bp 以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因 对低丰度 mRNA 检出率低

DD 技术改进针对以上不足 , 特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面做了大量改进：

引物设计 反应条件的优化 显示方法 假阳性鉴定

DD 在动物育种中的应用比较不同品种间的差异寻找数量性状QTL侯选基因研究杂种优势机制 比较世代间的差异

DD 在现代动物育种中的应用展望 目前主要致力于两个品种或组合间比较 我们在苏淮白猪选育中的应用思路：

提高各世代猪群生产性能的遗传稳定性，建立和完善繁殖性能和肉质性状的 DD 技术 分析新品系内不同优点的家系或类型间的遗传相关 检测新品系猪与其它品种猪的遗传距离

引物设计 mol 等将 12 种锚定引物变为 4 种，并发现 G 的扩增效果最好 王夏等在 T12MN之前加上了一段 T7 启动子序列，提高了 PCR 反应的严谨性 Liang发现 9~10 个 mer 长度的随机引物比较适宜 Liang还发现，当长度为 13bp ，在 5’端增加 HindⅢ酶切位点，能更有效的扩增，并能提高特异性

反应条件优化 RNA模板量在 2-3μg 时，能扩增出较多的条带 不同条件下 dNTP浓度不是固定不变的 1.5-2.0mmol/L 的 Mg2+浓度效果较好 40-42℃的退火温度通常能得到较好的扩增效果，周宁新等在 PCR 的头两个循环，用低严谨的退火温度 36℃，在随后的循环中退火温度提高到 45℃，获得了很清晰的电泳图谱

显示方法最初 DDRT-PCR通过放射性同位素在变性胶上进行放射自显影成像

Sanguinetti介绍了一个快速银染方法，只需 15 分钟，而且容易克隆回收 Rompf 等通过琼脂糖凝胶电泳分辨差异 c

DNA 片段 余桂华等建立了荧光mRNA 差异显示方法，最大限度地降低了假阳性

假阳性的鉴定 Northern blot仍是鉴定差异的一个主要手段；分析较多条带，反向 Northern blot 是较为切合实际的选择 Heinz通过 SSCP 分析排除了非差异表达的 cDNA污染 Callard把纯化后的 PCR 产物分成两部分 : 一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆 Sompayra 设计了向 5’ 步移的方法

比较不同品种间的差异Pan 等应用 DD寻找杜洛克和二花脸猪背最长肌中差异表达的 mRNA ，对 10 条差异表达 cDNA 克隆、测序，有 6 条 cDNA 显示与 GenBank 上已鉴定的基因类似，另外 4 条是未知基因

寻找数量性状 QTL 侯选基因 Janzen 等用 DD 分离的差异表达 cDNA 片段与猪 ARPP-16转录物的 3‘末端一致，试验组猪 ARPP-16 的表达量比对照组高 4倍 ,提示猪 ARPP-16 基因可能在猪肌肉生长中起重要作用 S.Ponsuksili 应用 DD 方法寻找猪眼肌面积的可能侯选 EST

s ，构建 4 个 RNA池，显示了 27 条非共有条带，有 2 个克隆显示与已知基因有高同源性， 2 个克隆与 EST 序列相似 M.D.Li 等应用 DD 方法发现梅山猪的 TSH-β 基因过量表达，大约为成年 WC 猪的 3倍，推测 β亚基的过量表达很可能是梅山猪比白猪合成系性成熟早的原因

研究杂种优势机制 Y G Liu 应用 DD 技术研究两个杂交组合背最长肌中基因表达的差异，观测到 8 个不同的典型表达模式，相关性分析表明，大白、梅山正反杂交组合与母体效应有关，而在大白、长白杂交组合中，父本效应在杂种的基因表达中起作用，或基因表达偏向于某一亲本 Liu(2005) 等在研究大白和长白杂交组合背最长肌中基因表达的差异时，发现了一个猪的新基因，命名为猪的 CA-Ⅲ基因，他催化可逆的二氧化碳水合作用，但还不确定与杂种优势是否相关

比较世代间的差异 Ren 等研究了梅山猪和大白猪及其正反 F1代杂种猪背部皮下脂肪组织间的基因表达情况， 4 条 EST 分别与 GenBank 序列同源性较高，其余 36 条 EST 在亲子代之间的差异表达方式不尽相同