第十章 微生物的进化、系统发育和分类鉴定第一节 绪论第二节 进化的测量指征第三节 细 菌 分 类 第三节 微生物分类鉴定的特征和技术

第一节 绪论 地球大约是在 45 亿年前形成的。地质学、古生物学和地球化学直接或间接证据都表明：大约在地球形成 10 亿年之后，我们这个星球开始出现生命，主要是些类似简单杆状细菌的原始生物。但在同期的、另外一些被认为是由光合微生物与沉积物形成的片层状化石——叠层石（ stromatolites ），它们类似于绿硫细菌和多细胞丝状细菌，这些原始生命大概都是厌氧型的。含有产氧型光合细菌——蓝细菌的层叠石则发现于25-30 亿年前的地质年代中，蓝细菌的出现，给地球带来了氧气。而后，各种真核生物才随之出现。

第一节 绪论根据现代生物进化论观点 ：所谓进化（ evolution ）是生物与其生存环境相互作用过程中，其遗传系统随时间发生一系列不可逆的改变，在大多数情况下，导致生物表型改变和对生存环境的相对适应。系统发育（ phylogeny ）就指的是研究各类微生物进化的历史。

第一节 绪论 科学家估计有分类纪录的各类物种大约有 150 万，其中微生物超过 10 万种，而且其数目还在不断增加。微生物学工作者要认识、研究和利用微生物或控制有害微生物，必须对它们进行分类（ classification ）。

第一节 绪论 对生物进行分类存在两种基本的、截然不同的分类原则： 一是根据表型 (phenetic) 特征的相似成都分群归类，这种表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生物亲缘关系为目标；第二种分类原则是要按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系统发育的分类系统。

第一节 绪论 因此，以进化论为指导思想的分类学(taxonomy) ，其目的已经不仅仅是物种的识别和归类，其主要目标是通过追溯系统发育，推断进化谱系，这样的分类学也称之为生物系统学 (syatematics) 。

第一节 绪论 分子生物学的发展，使我们不仅可以根据表型特征，而且可以从分子水平上，通过研究和比较微生物乃至整个生物界的基因型特征来探讨生物的进化、系统发育和进行分类鉴定。

第二节 进化的测量指征 20世纪 70 年代以前，生物类群间的亲缘关系主要是根据形态结构、生理生化、行为习性等表型特征以及少量的化石资料来判断它们之间的亲缘关系。直到 60—70 年代，有识之士才清醒地认识到：仅依靠表型特征无法解决微生物的系统发育问题，必须寻找新的特征作为生物进化的指征。

一、进化指征的选择根据形态学特征推断生物之间的亲缘关系存在两个突出问题：一是由于微生物可利用的形态特征少，很难把所有生物放在同一水平上进行比较； 二是形态特征在不同类群众中进化速度差异很大，仅根据形态推断进化关系往往不准确。

一、进化指征的选择 20世纪 70 年代以后研究为生物的系统发育，主要是分析和比较生物大分子的结构特征，特别是蛋白质、 RNA和 DNA这些反映生物基因组特征的分子序列，作为判断各类微生物乃至所有生物进化关系的主要特征。

一、进化指征的选择为了准确确定各种生物之间的进化关系，还必须挑选恰当的大分子来进行序列研究。在挑选大分子时应注意以下几点： ①它必须普遍存在于所研究的各个生物类群中。如果我们所研究的是整个生命界的进化，那么所选择的分子必须在所有生物中存在，这样才便于分析和比较。

一、进化指征的选择 ②选择在各种生物中功能同源的大分子。催化不同反应的酶的氨基酸序列或者具有不同功能核酸的核苷酸序列不能进行比较，因为功能不相关的分子也意味着进化过程中来源不同，对这一类不相关分子进行比较也不期望它们会表现出序列的相似性。所以，大分子进化的研究必须从鉴定大分子的功能开始。

一、进化指征的选择 ③为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所选择的分子序列必须能严格线性排列，以便进行进一步的分析比较。 ④还应注意根据所比较的各类生物之间的进化距离来选择适当的分子序列。

二、 rRNA 作为进化的指征 大量的实验研究表明：在众多的生物大分子中，最适合于揭示各类生物亲缘关系的是 rRNA, 尤其是 16SrRNA。 16SrRNA所以被普遍公认是一把好的谱系分析的“分子尺”，这是因为：

二、 rRNA 作为进化的指征 ①rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中，其功能保持不变； ②在 16SrRNA分子中，即含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；

二、 rRNA 作为进化的指征 ③16SrRNA相对分子质量大小适中，便于序列分析； ④16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中（真核生物中其同源分子是 18SrRNA）。

三、 rRNA 的顺序和进化 rRNA 序列测定和分析方法分两类：寡核苷酸编目法和全序列分析法。 1. 寡核苷酸编目分析法 20世纪 80 年代以前的研究 ,主要是采用寡核苷酸编目分析法。

三、 rRNA 的顺序和进化2. 全序列分析法寡核苷酸编目分析法，只获得了 16SrRNA分子的大约 30%的序列资料，加上采用的是一种简单相似性的计算方法，所以其结果有可能出现误差，应用上受到一定限制。随着核算序列分析技术的发展， 20世纪 80 年代末又陆续发展了一些 rRNA全序列分析方法，其中最常用的是直接序列分析法。这种方法用反转录酶和双脱氧序列分析，可以对未经纯化的 rRNA抽提物进行直接的序列测定。

四、系统发育树 在研究生物进化和系统分类中，常用一种树状分枝的图型来概括各种（类）生物之间的亲缘关系，这种树状分枝的图型被称为系统发育树（ phylogenetic tree ），简称系统树。通过比较生物大分子序列差异的数值构件的系统树称为分子系统树。图型中，分枝的末端和分枝的连接点称为结（ node ），代表生物类群，分枝末端的结代表仍生存的种类。系统树可能有时间比例，或者用两个结之间的分枝长度变化来表示分子序列的差异数值。

五、三界生物的主要特征 根据形态和生理特征把地球上的生物分为动物界和植物界的理论，统治了生物学 100 多年， 20世纪 60 年代主要根据细胞核的结构把生物分为原核生物和真核生物两大类。

五、三界生物的主要特征1.生命中的第三种形式 将生物分成三界（ Kingdom ）（后来改称三个域）： 古细菌、真细菌（ Eubacteria ）真核生物（ Eukaryotes ）。 1990 年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类，又把三界（域）改称为 Bacteria （细菌）、 Archaea( 古生菌 ) 和 Eukarya（真核生物），并构建了三界（域）生物的系统树（图 12-3 ）。

五、三界生物的主要特征 2. 三（界）域生物的主要特征 三界理论虽然是根据 16Sr RNA序列的比较提出的，但其他特征的比较研究结果也在一定程度上支持了三界生物的划分。

第三节 细 菌 分 类 分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、研究和利用各种微生物资源也必须对他们进行分类。分类学内容涉及三个相互依存又有区别的组成部分：分类、命名和鉴定。

第三节 细 菌 分 类分类（ classification ）是根据一定的原则（表型特征相似性或系统发育相关性）对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便考察和对未被分类的微生物进行鉴定；命名（ nomenclature ）是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称；

第三节 细 菌 分 类鉴定（ identification 或 determination ）则是指借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、新发现的或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。

第三节 细 菌 分 类一 . 分类单元及其等级 界 Kingdom 门 Phylum—— 亚门 纲 Class—— 亚纲 目 Order—— 亚目 科 Family—— 亚科 属 Genus 种 Species

一 . 分类单元及其等级常用的细菌分类术语培养物（ culture),是指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。菌株（ strain) ，从自然界分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法（如通过诱变）所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。

一 . 分类单元及其等级 型（ form 或 type), 常指亚种以下的细分，当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。种（ species),是生物分类中基本的分类单元和分类等级。

第三节 细 菌 分 类二 . 微生物的命名1.分类单元的命名 ⑴ 属名 属名用一个单数主格名词或当作名词用的形容词来表示，可以是阳性、阴性或中性，首字母要大写。⑵ 种名 和其他生物一样，细菌的种名也用双名法（ binomial nomenclature ）命名，即种的学名由属名和种名加词两部分组合而成。 ⑶ 亚种名 亚种名为三元式组合，即由属名、种名加词和亚种名加词构成。

二 . 微生物的命名2. 命名模式及其指定 如前所述，由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱， 细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念”。即根据命名法规要求，正式命名的分类单元应指定一个命名模式（简称模式）作为该分类单元命名的依据。

二 . 微生物的命名3. 新名称的发表 根据细菌命名法规的规定，有效发表新的细菌名称应在公开发行的刊物上进行，在菌种目录、会议记录、会议论文摘要的均不能视为有效发表。此外，若新名称是在国际系统细菌学杂志（ IJSB）以外的其他杂志上发表的，还必须经过新名称的合格化发表，被认为合格后，在该杂志上定期公布，命名日期即从公布之日算起，否则不算合格发表，也不能取得国际上的承认。发表新名称时，应在新名称之后加上所属新分类等级的缩写词，如新目“ ord.nov.”、新属“ gen.nov.”、新种“ sp.nov.”等。

第三节 细 菌 分 类三、细菌分类和伯杰氏手册 20 世纪 60 年代以前，国际上不少细菌分类学家都曾对细菌进行过全面的分类，提出过一些在当代有影响的细菌分类系统。但 70 年代以后，对细菌进行全面 分 类 的 、 影 响 最 大 的 是 《 伯 杰 氏 手册》。所以该书目前已成为对细菌进行分类鉴定的主要参考书。

第四节 微生物分类鉴定的特征和技术 鉴于微生物体形微小、结构较简单等特点，微生物分类和鉴定除了像高等生物那样，采用传统的形态学、生理学和生态学特征之外，还必须寻找新的特征作为分类鉴定的依据。在这方面微生物分类学家比动植物分类学家表现了更高的热情，他们从不同层次（细胞的、分子的）、用不同学科（化学、物理学、遗传学、免疫学、分子生物学等）的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现反映微生物类群特征的资料作为微生物分类鉴定的依据。

第四节 微生物分类鉴定的特征和技术一、形态学和生理生化特征1．形态学特征 形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其中有两个重要原因：一是它易于观察和比较，尤其是在真核微生物和具有特殊形态结构的细菌中； 二是许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对的稳定性。因此，形态学特征不仅是微生物鉴定的重要依据，而且也往往是系统发育相关性的一个标志。常用于原核生物分类鉴定的形态学特征

一、形态学和生理生化特征2．生理生化特征 生理生化特征和微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因的产物。所以，对微生物生理生化特征和比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多。因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。

第四节 微生物分类鉴定的特征和技术二、血清学试验与噬菌体分型1．血清学试验细菌细胞与病毒等都含有蛋白质、脂白蛋、脂多糖等有抗原性的物质，由于不同微生物抗原物质结构不同，赋予它们不同的抗原特征。一种细菌的抗原除了可与它自身的抗体起特异性免疫反应外，若它与其它种类的细菌有共同的抗原组分，它们的抗原抗体之间就会发生交叉反应。

二、血清学试验与噬菌体分型2.噬菌体分型在原核生物中已普遍发现有响应种类的噬菌体 .噬菌体对宿主的感染和列解作用具有高度的特异性 , 即一种噬菌体往往只能感染或裂解某种细菌 ,甚至只裂解种内的某些菌株 .所以 ,根据噬菌体的宿主范围可将细菌分为不同的噬菌型和利用噬菌体裂解这样的特异性进行细菌鉴定 .这对于追溯传染病来源、流行病调查以及病原菌的检测鉴定有重要意义 .

第四节 微生物分类鉴定的特征和技术三、氨基酸的顺序和蛋白质的分析 蛋白质是基因的产物 , 蛋白质的氨基酸顺序直接反映 mRNA顺序而与编码基因密切相关。因此 ,可以通过对某些同源蛋白质氨基酸顺序的比较来分析不同生物系统发育关系 , 序列相似性越高 ,其亲缘关系愈近。因此可以根据蛋白质的氨基酸序列资料构建系统发育树和进行分类。

第四节 微生物分类鉴定的特征和技术四、核酸的碱基组成和分子杂交 比较 DNA和碱基组成和进行核酸分子杂交 ,是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。1.DNA的碱基组成 [(G+C)%]

四、核酸的碱基组成和分子杂交DNA分子含有四种碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶。 DNA的碱基组成和排列顺序决定生物的遗传性状 ,所以 DNA碱基组成是各种生物的一个稳定特征 .它不受年龄和突变因素以外的外界条件的影响 , 即使个别基因突变 , 碱基组成也不会发生明显变化。分类学上 ,用 G+C 占全部碱基的物质的量百分数 (G+C)% 来表示各种生物的 DNA 碱基组成特征。

四、核酸的碱基组成和分子杂交 每一种生物都有一定的碱基组成亲缘关系近的生物 ,它们应该具有相似的 G+C含量 ,若不同的生物之间 G+C含量差别大表明它们关系远。现有数据表明 :高等植物的 G+C含量范围大约 35%～ 50%之间 ;原核生物中 G+C含量变化幅度宽达 22%～ 80%;脊椎动物 G+C含量约 35%～ 45%之间 ;原核生物中 G+C含量变化幅可达 22%～ 80%这也足以表明原核生物是一个极其多样性的类群 .

四、核酸的碱基组成和分子杂交目前 , 虽然还没有一个统一的界定各级分类单元的 G+C含量标准 ,但大量资料表明 :同一个种内的不同菌株 G+C含量差别应在 4%～ 5%以下 ;同种不同属的差别在 10%～ 15%,通常底于 10%.所以 G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基特征 ,它对于种、属甚至科的鉴定有重要意义。

四、核酸的碱基组成和分子杂交例如 ,80 年代以前螺菌属 (Spirillum) 不同的 G+C含量高达 38%～ 66%,后来伯杰氏手册 (1984)结合其他特征已将其分为三个属 : 螺藻属、海洋螺菌属 (Oceanospirillum) 和水螺菌属 (Aquaspirillum),它们的 G+C含量分别为 38%、 42% ～ 51%和 49%～ 66%;过去根据形学特征曾认为球菌 (Micrococcus) 与葡萄球菌属 (Staphylococcus) 是关系很近的两个属 ,因而长期放在一个科里 ,由于 G+C含量的差异表明它们的亲缘关系相当远 ,现在根据 16SrDNA序列资料已进行新的调整。

四、核酸的碱基组成和分子杂交然而 , 值得强调的是 : G+C含量的分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些 G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元。 测定 DNA碱基组成的方法很多 , 常用的是热变性温度法、浮力密度法和高效液相色普法。

四、核酸的碱基组成和分子杂交2．核酸的分子杂交 生物的遗传信息以（遗传密码）形式线性的排列在 DNA分子中，不同 DNA碱基排列顺序的异同直接反映这些生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系越近，反之亦然。

四、核酸的碱基组成和分子杂交 核酸分子杂交在微生物分类鉴定中的应用包括： DNA—DNA杂交、 DNA—rDNA 杂交以及根据核酸杂交特异性原理制备核酸探针。(1) DNA—DNA杂交 亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘比较

四、核酸的碱基组成和分子杂交(2) DNA—DNA杂交 亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘比较(3) 核酸探针 利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定

四、核酸的碱基组成和分子杂交3．电子杂交 随着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间的亲缘关系。