Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М.

Химический факультет МГУ имени М.В. ЛомоносоваЗАО «НПП ИММУНОТЕХ»

Проблема:

Устойчивостьмикроорганизмов к действию бета-лактамных антибиотиков

Причина : Продукция бактериальных ферментов – бета-лактамаз

Бета-лактамазы представляют собой группу бактериальных ферментов, способных гидролизовать бета-лактамные антибиотики

1940 – E. Abraham E. Chain описали инактивацию пенициллина в бесклеточном экстракте культуры E. coli

1965 – описана бета-лактамаза ТЕМ-1Наст. время – описано более 700 бета-лактамаз

NO

COOH

S

HN

COOH

S

OH

H2O

Классификация семейства бета-лактамаз

KPCKPC OXAOXA VIM SPMIMP GIM SIMVIM SPMIMP GIM SIM

TEMTEM SHVSHV CTX-MCTX-M

• Бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС)

• Ингибитор-устойчивые бета-лактамазы

• Карбапенемазы

5

Задача:

одновременная идентифицикация нескольких типов бета-лактамаз, определение мутаций в них

Возможное решение:• использование молекулярно-генетических

методов• использование мультипараметрических

методов исследований

6

Биологические микрочипы

Биологические микрочипы – это организованное размещение биологически активных молекулв виде миниатюризированных матриц на специальном носителе

Метод ДНК-зондов

Микрочип

7

Особенности технологии микрочипов

Одновременное определение множества параметров

Миниатюризация

Автоматизация

Высокая производительность

Одновременное определение множества параметров

Миниатюризация

Автоматизация

Высокая производительность

Выделение ДНК

• Амплификация гена (ПЦР)• Введение метки

Гибридизация Детекция результатовгибридизациипо активностиметки

Детекция результатов Детекция результатов гибридизационного анализагибридизационного анализа

9

Микрочипы с флуоресцентной детекцией

Cy3

СубстратОкрашенныйпродукт

Бт

Фермент

Микрочипы с колориметрической детекцией

10

Идентификация типа гена

C GA C

G U

T

G CA

A

U

CGA

G

T

CA U

T

A

G

C

Прямая цепь

Обратная цепь

11

Выявление точечных мутаций в генах

CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCAACAACATGGGGGCAACATGGGGG

CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCGGCAACATGGGGGCAACATGGGGG

CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCCCCAACATGGGGGCAACATGGGGG

CCGCTTTTTTGCCCGCTTTTTTGCTTCAACATGGGGGCAACATGGGGG

TEM-1TEM-1

TEM-21TEM-21

TEM-1TEM-1

TEM-21TEM-21

151

...GSG...GSGHHYGT...YGT...

...GSG...GSGRRYGT...YGT...

AGCT

Анализ нуклеотидных последовательностей генов

ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ингибитор-устойчивых бета-лактамазингибитор-устойчивых бета-лактамаз

Контроль иммобилизацииОтр. контроль гибр.Полож. контроль гибр.Идентификация типа гена

Мутации в blaTEM

Мутации в blaSHV

Мутации в blaСТХ-М

Носитель: найлон

Размер чипа: 8 мм х 14 мм

Диаметр точки: ~ 350 µm

Количество точек: 246

Количество зондов: 78

Идентификация:• 3 типа генов β-лактамаз: TEM, SHV и СТХ-М

• 25 мутаций в них для определения БЛРС и ингибитор-уст. БЛ

13

TEM-1 + SHV-1 + TEM-1 + SHV-1 + SHV-12 + CTX-M-15SHV-12 + CTX-M-15 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV I-IV пок-пок-нийний))

Ин

тен

си

вн

ост

ь,

отн

. е

д.

Ин

тен

си

вн

ост

ь,

отн

. е

д.

TEM-1 + SHV-1TEM-1 + SHV-1 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I I поколения)поколения)

Результаты тестирования штамма Результаты тестирования штамма K. pneumoniaK. pneumonia, , продуцирующего три продуцирующего три ββ-лактамазы:-лактамазы:TEM-1, SHV-1 TEM-1, SHV-1 и Си СTX-M-9TX-M-9

14

Ин

тен

си

вн

ост

ь,

отн

. е

д.

TEM-1 SHV-1 CTX-M-9

Апробация ДНК-микрочипа на клинических штаммах Enterobacteriaceae (n=100)

БЛРC – (n = 10): БЛРС+ (n = 90):

24,6% штаммов продуцировали 2 БЛРС

SHV-5-likeCTX-M-1-likeCTX-M-2-likeCTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-2-likeTEM-1-like + SHV-5-likeTEM-1-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + CTX-M-9-likeSHV-1-like + SHV-5-likeSHV-1-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-likeTEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-9-likeSHV-2-like + CTX-M-1-likeSHV-5-like + CTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-2-likeTEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-likeSHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-likeSHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-likeSHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-9-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-likeTEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-2-like

Не обн.ТЕМ-1SHV-1(TEM-1+SHV-1)

20%

20%

10%

50%

ДНК-микрочип для определения генов карбапенемаз Id_IMP Id_VIM Id_OXA

IMP-1 VIM-1 OXA-23

IMP-2 VIM-2 OXA-40

IMP-5 VIM-7 OXA-51

IMP-11 Id_SPM OXA-58

IMP-14 Id_SIM Id_KPC

Id_GIM

Контроль иммобилизацииПоложительный контроль гибридизацииОтрицательный контроль гибридизацииИдентификация для металло-β-лактамазИдентификация OXA-β-лактамазИдентификация KPC-β-лактамаз

Носитель: найлонРазмер микрочипа: 11мм×15ммДиаметр одной точки: 350 мкмКоличество точек: 132

Идентификация карбапенемаз:VIM, IMP, SPM, GIM, SIM (класс B)OXA ( класс D)KPC (класс A)

Апробация ДНК-микрочипа для определения генов карбапенемаз на клинических штаммах

МикроорганизмЧисло

штаммов

Типы обнаруженных карбапенемаз

OXA-23-like

OXA-40-like

OXA-51-like

OXA-58-like

VIM-2-like

Acinetobacter baumanii

n=15 1 5 15 4 -

Pseudomonas aeruginosa

n=15 - - - - 11

Скрининг клинических образцов на наличие БЛРС, ингибитор-устойчивых бета-лактамаз класса А и карбапенемаз классов A, B, D

Интегрированный ДНК-микрочипдля идентификации β-лактамаз

Благодарности:Благодарности:

• Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова Уляшова М.М. Халилова Ю.И. Григоренко В.Г. Игнатенко О.В.

• НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленская гос. мед. академия Эдельштейн М.В.

• Институт нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко Александрова И.А.

Финансовая поддержка:ФЦП "Национальная технологическая база" на 2007-2011 годы (Контракт ГП/07/442/НТБ/К)

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !