酵母菌内烃类合成途径的构建报告人：张文倩

背景

目标：实现以 C11 ，C12 为主要成分的中链烃类（ C8-C14 ）的生物合成

丙酮酸

葡萄糖

乙酰辅酶 A

丙二酰辅酶 A

脂酰 CoA

自由脂肪酸

脂酰 CoA 水解酶（硫酯酶） C8-16

（蓝细菌）

脂肪醛

烷烃

ACC

α- 双加氧酶C10-16

脂肪醛脱羰酶C14-18

（大米）

（人，小鼠）

脂酰 CoA 硫酯酶

选取小鼠和人各一个基因命名为 H1 ，H2 ，已经合成回来，连接在 pUC18上。现 H2 已经连接到 pYES2.0 上。正在进行酵母转化

α- 双加氧酶

-

十五醛

十三醛 十一醛

壬醛C9-C 15 脂肪醛

Assumption:α-dioxygenase only accepts long- and middle-chain fatty acids with a carbon chain of at least ten carbon atoms as substrates

C10-C16 脂肪酸

脂肪醛脱羰酶蓝细菌中产烃体系PCC7942 中的 ORF 1594 和 ORF 1593

ORF 1593

ORF1594

Require O2

Require a reducing system ： NADPH and ferredoxin and ferredoxin reductase

C14-C18 醛

C13-C17 烃

基础工作 : 基因的连接导入1. HI,H2, 导入 pYES2.0 （含诱导性启动子 GAL1 ），在酵母中进行单表达2. 合成 α-DOX （设计酶切位点）3. 将 α-DOX 和 R2 分别导入

pYES2.0 ，分别采用不同强度的组合型启动子进行组合优化，进行单表达 启动子强度：TEF1>TDH3>PGK1>TDH1

4. 将三个基因一起连接到同一 pYES2.0上，实现共表达（均选取表达效果较好的启动子）

H1, H2

脂酰 CoA

自由脂肪酸脂酰 CoA 水解酶

α- 双加氧酶脂肪醛

脂肪醛脱羰酶R2

中链烃（ Jet Fuel ）C7-15 ； C11

α-DOX

工作方向1 体内外检测酶活的方法 体内：将单个基因 HI,H2 ,α-DOX ,R2 分别导入

pYES2.0 ，在酿酒酵母中进行单表达，酶利用细胞自身的底物生成对应产物，通过检测产物含量验证酶活。（色谱） 体外：需根据具体反应所需的条件（如是否需氧，是否需要还原体系等）构建酶活反应体系，进而提供相应底物，通过产物含量检测酶活。

2 内源 ACC 启动子替换具体方案 已经要到 PWJ1042 质粒，可以进行 URA3 的同源臂替换，最终将 ACC 的原有启动子替换为其他强度较大的启动子如 TEF1 。

3 耶氏解脂酵母相关资料的查阅（索要整合型与游离型质粒，可用启动子）4 着丝粒质粒（比普通游离型质粒稳定，拷贝数低） 目前有三种营养标记型。 将基因导入着丝粒质粒中，试验其表达效果

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