БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И...
DESCRIPTION
БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И ПРОТЕИНА. др Марко Н Живановић *# * Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i . Department of Molecular and Cell Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Czech Republic - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
др Марко Н Живановић *#
*Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i. Department of Molecular and Cell Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Czech Republic
#Институт за биологију и екологију, Природно-математички факултет, Универзитет у Крагујевцу Центар за преклиничка испитивања биоактивних супстанци, Крагујевац, Р. Србија
БИОЕЛЕКТРОХЕМИЈСКА АНАЛИЗА ПОЛИАМИНО КИСЕЛИНА И ПРОТЕИНА
Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула
Одређивање протеина и угљених хидрата
Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула
Одређивање протеина и угљених хидрата
Полилизин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди
Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула
Одређивање протеина и угљених хидрата
Полилизин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди
Полилизин, полиаргинин и полихистидин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди
Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула
Одређивање протеина и угљених хидрата
Полилизин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди
Полилизин, полиаргинин и полихистидин – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди
Хистон H2A – Катализована реакција издвајања водоника на живиној електроди
Биоелектрохемија: Модеран приступ у изучавању биомакромолекула
Полиамино киселине (poly(aa)s) доприносе катализованој реакцији издвајања водоника на живиним електродама (CHER) дајући хронопотенциометријски (CPS) пик (peak H) или волтаметријски одговор
По први пут показана је специфична биоелектрохемијска улога сваке појединачне амино киселине у протеинима/пептидима
Базне poly(aa)s дају peak H, док киселе poly(aa)s (као polyGlu) не дају биоелектрохемијски сигнал
PolyLys се може посматрати као модел систем протеина хистона PolyLys је коришћен за изучавање основних принципа важних у анализи интеракција
ДНК са базним хистонима Овај рад први је покушај изучавања хистона методама биоелектрохемије peak H се може успешно користити у изучавању интеракције хистона и ДНК
Увод
18. век – Luigi Galvani 20. век century – prof. J. Heyrovský, „De Viribus Electricitatis in Motu Musculari Commentarius“ Чешки добитник Нобелове награде, 1959
„Father of electroanalytics“ – Polarography
Увод
Систем три електроде:
- Радна електрода – HMDE(Hanging Mercury Drop Electrode)
- Референтна електрода – Silver Chloride Electrode
- Помоћна електрода – платина
Увод
Методе:
- Циклична волтаметрија (CV)
Увод
Методе:
- Циклична волтаметрија (CV)- Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV)
Увод
Методе:
- Циклична волтаметрија (CV)- Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV)- „Square wave“ волтаметрија (SWV)
Увод
Методе:
- Циклична волтаметрија (CV)- Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV)- „Square wave“ волтаметрија (SWV)- „AC“ волтаметрија (ACV)
Увод
Методе:
- Циклична волтаметрија (CV)- Диференцијална пулсна волтаметрија (DPV)- „Square wave“ волтаметрија (SWV)- „AC“ волтаметрија (ACV)- Хронопотенциометријска стрипинг анализа при константној
струји (CPSA)
Увод
Адсорпциони стрипинг, AdS
- Анодни адсорпциони стрипинг
Увод
Адсорпциони стрипинг, AdS
- Анодни адсорпциони стрипинг
- Катодни адсорпциони стрипинг
Увод
Адсорпциони стрипинг (AdS) и Адсорпциони трансфер стрипинг (AdTS)
Увод
Адсорпциони стрипинг (AdS) и Адсорпциони трансфер стрипинг (AdTS)
- E. Paleček – DNA studies
Увод
Адсорпциони стрипинг (AdS) и Адсорпциони трансфер стрипинг (AdTS)
- E. Paleček – DNA studies- ex situ мерења
Увод
Адсорпциони стрипинг (AdS) и Адсорпциони трансфер стрипинг (AdTS)
- E. Paleček – DNA studies- ex situ мерења- Потребно 3-10 µl раствора узорка
Увод
Heyrovský, Brdička, Frumkin – Catalytic effect of organic bases on CHER at mercury
Cat–H+ + e– [Cat–H]2[Cat–H] H2 + Cat
CATALYTIC HYDROGEN EVOLUTION REACTION (CHER)
CATALYTIC HYDROGEN EVOLUTION REACTION (CHER)
Ad(T)S CPSA on HMDE
peak H Редукциони
процес
CHER – peak H
123
4
Heyrovský1930Brdička 1933
Tomschik1998
Поларографски сигнал HSA1. Електролит2. 400x разређен HSA presоdium wave3. Co(III) редукција4. Brdička каталитичка реакција
Ad(T)S CPSA on HMDE
peak H Редукциони
процес
CHER – peak H
123
4
Heyrovský1930Brdička 1933
Tomschik1998
Поларографски сигнал HSA1. Електролит2. 400x разређен HSA presоdium wave3. Co(III) редукција4. Brdička каталитичка реакција
Presodim wave
Ad(T)S CPSA on HMDE
peak H Редукциони
процес
CHER – peak H
123
4
Heyrovský1930Brdička 1933
Tomschik1998
Поларографски сигнал HSA1. Електролит2. 400x разређен HSA presоdium wave3. Co(III) редукција4. Brdička каталитичка реакција
Brdička double wave
Порекло имена сигнала PEAK H
CHER – peak H
Порекло имена сигнала PEAK H
High sensitivity
CHER – peak H
Порекло имена сигнала PEAK H
High sensitivity Hydrogen evolution
CHER – peak H
Порекло имена сигнала PEAK H
High sensitivity Hydrogen evolution Heyrovský
CHER – peak H
Предности Аналогија са поларографским “presodium wave”, који је преблизу
позадинског сигнала peak H је одлично одвојен од позадинског сигнала Одређивање биомакромолекула у суб-наномоларним
концентрацијама Анализа структура биомакромолекула
Нативна форма vs. денатурисана агрегована Wt vs. Mut Оксидована/Редукована …
CHER – peak H
Предности
CHER – peak H
α-synuclein
Предности CHER – peak H
Предности CHER – peak H
Анализа полиамино киселина
Poly(AA)s – Интермедијерни модел систем између једноставнијих пептида и комплексних протеинаБазне poly(AA)s могу се сматрати модел системима базних хистонских протеина
Амино киселине укључене у катализу
Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1
1. Прво испитивање poly(AA)s као модел система
Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1
1. Прво испитивање poly(AA)s као модел система2. Улога појединачних AA остатака у сигналу
Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1
1. Прво испитивање poly(AA)s као модел система2. Улога појединачних AA остатака у сигналу3. Прво испитивање интеракције polyLys са ДНК
Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1
1. 0.1 M McIlvaine пуфер, pH 6
2. PolyGlu, 22.2 µM3. PolyArg,Trp, 22.2 µM4. PolyLys, 22.2 µM
Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1
AdS CPSA/ HMDE 5.7 µM polyLys peak HIstr= −50 µA, tA=120 s; Ei=EA= − 0.1 V
Background electrolyte:McIlvaine buffer, pH 6
Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1
AdS CPSA/ HMDE polyLys peak H
A) Istr= −40 µA, tA=120 s; Ei=EA= − 0.1 V 50 mM McIlvaine buffer, pH 6
B) 11.5 nM (1.5 ng/ml) polyLys Istr= −10 µA, tA=60 s; Ei=EA= − 0.1 V 100 mM McIlvaine buffer, pH 6Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1
AdTS CPSA/ HMDE polyLys/DNA interaction
1) 100 mM McIlvaine, pH 62) 5.7 µM polyLys3) polyLys/DNA complex 5.7 µM polyLys/5 µM dsDNAIstr= −40 µA, tA=120 s; Ei=EA= −0.5 V
Zivanovic, M., M. Aleksic, V. Ostatna, T. Doneux, and E. Palecek, Polylysine catalyzed hydrogen evolution at mercury electrodes. Electroanalysis 2010. 22 p. 2064. M21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 1
Vargová, V., M. Zivanović, V. Dorčák, E. Paleček, and V. Ostatná, Catalysis of hydrogen evolution by polylysine, polyarginine and polyhistidine at mercury electrodes. ELECTROANALYSIS 2013. 25(9) p.2130 М21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2
1. CPS peak H је осетљив на амино киселински састав
Vargová, V., M. Zivanović, V. Dorčák, E. Paleček, and V. Ostatná, Catalysis of hydrogen evolution by polylysine, polyarginine and polyhistidine at mercury electrodes. ELECTROANALYSIS 2013. 25(9) p.2130 М21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2
1. CPS peak H је осетљив на амино киселински састав2. CV такође показује значајан потенцијал у испитивању
polyAA
Vargová, V., M. Zivanović, V. Dorčák, E. Paleček, and V. Ostatná, Catalysis of hydrogen evolution by polylysine, polyarginine and polyhistidine at mercury electrodes. ELECTROANALYSIS 2013. 25(9) p.2130 М21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2
1. CPS peak H је осетљив на амино киселински састав2. CV такође показује значајан потенцијал у испитивању
polyAA3. Базне poly(AA)s доприносе биоелектрохемијском
сигналу CHER
Vargová, V., M. Zivanović, V. Dorčák, E. Paleček, and V. Ostatná, Catalysis of hydrogen evolution by polylysine, polyarginine and polyhistidine at mercury electrodes. ELECTROANALYSIS 2013. 25(9) p.2130 М21
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2
Биоелектрохемијско одређивање полиамино киселина – 2
polyLys
polyArg
polyHis
AdTS CPSA/HMDEAdTS CV/HMDE
Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A
Људски геном садржи ~ 3x109 парова база, чија укупна дужина износи преко 1 m
Међутим, људски геном спакован је у нуклеусу пречника 10−5 m Боље разумевање структуре и функције хромозома и даље су у
жижи научног интересовања Фокус даљег рада био је усмерен ка испитивању хистона и
нуклеозома
Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A
Entire mitoticchromosome
Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A
Већина других испитиваних протеина је киселог карактера:Riboflavin-binding protein (pI 5.1), Thioredoxin (pI 4.7), MutS protein (pI 5.5), α-Synuclein (pI 4.7), Serum albumin (pI 5.9), Concanavalin (pI 5.5), tumor suppressor p53 (pI 6.3)
Brdička catalytic reaction – DP voltammograms; B) Cyclic voltammograms and C) Chronopotentiograms of 1.5 µM histone H2A (Cys non-containing) and 1.5 µM H3 (Cys containing). Background electrolyte 0.05 M sodium phosphate, pH 7.3
Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A
H3H3
H3
H2AH2AH2A
Са изузетком H3, ниједан други хистон не продукује BCR, због недостатка Cys
peak H хистона H2A снажно зависи од услова мерења
A) AdTS CV scan rate зависност иB) AdTS CPSA stripping current зависност 1.5 μM хистона H2A
Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A
Лимит детекцијеAdTS CPSA/HMDE peak H35.7 nM H2A (500 ng/ml); tA 5 min, Istr = –15 μA, EA =Ei = –0.1 V, Ef = –1.825 V. Sample adsorbed from 5 μl sample solution and transferred to 5 mlof background electrolyte of 0.05 M acetate buffer, pH 5.6. No baseline correction was applied.
Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A
ДНК-H2A интеракција
AdTS CPSA of H2A (black line), and H2A-DNA complex (red line) 2 μM H2A and 50 μM DNA were mixed in A. 50 mM or B. 1 M NaCl. After 15 min incubation at room temperature, analyte was adsorbed at HMDE (EA = Ei −0.5 V; tA =120 s) and modified HMDE was washed and transferred into the blank background electrolyte 50 mM Na-phosphate, pH 7. Istr = –18 μA.
Биоелектрохемијско одређивање хистона H2A
H2AH2A/DNA
50 mM NaCl 1 M NaCl
Е. Paleček – 1960 „Nucleic acids are electroactive“Palecek, E., (1960). Oscillographic polarography of highly polymerized deoxyribonucleic acid. Nature 188, 656.
Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата
Око 30 година од открића електроактивности нуклеинских киселина, ова научна област давала је скромних (у просеку) 10 радова годишње
У последње две деценије ова област доживела је снажну експанзију са око 750 радова годишње
Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата
Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата
Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата
Одређивање нуклеинских киселина
ДенатурацијаПолиморфизам – dsDNAПротеински трагови у ДНК и РНКДНК биосензориДетекција bp mismatches
Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата
Одређивање нуклеинских киселина
ДенатурацијаПолиморфизам – dsDNAПротеински трагови у ДНК и РНКДНК биосензориДетекција bp mismatches
Протеин – ДНК интеракција
Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата
До скоро угљени хидрати сматрани су електронеактивнима
Модификација УХ комплексима осмијума са азотним лигандима (L), Os(VI)L омогућила је биоелектрохемијско одређивање УХ помоћу AdTS волтаметријом
M. Trefulka and E. Palecek, "Voltammetry of Os(VI)-modified polysaccharides at carbon electrodes," Electroanalysis, pp. 1763-1766, 2009.
Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата
Хемијска модификација поли- и олигосахарида Os(VI)L комплексима. Пример: Део молекула декстрана, који формира адукт са Os(VI)L комплексом. L - азотни лиганди: pyridine или 2,2’-bipyridine (bipy).
Palecek E., Ostatna V., Trefulka M., Bartosik M., Cernocka H., Kurzatkowska K., Zivanovic M., Electrochemical Sensing of Proteins and Carbohydrates. IEEE SENS J. 833-836, 2010.
Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата
Циклични волтамограми манана модификованог A, са Os(VI)temed (плаво) или B, са Os(VI)bipy (црвено). A, 5 μM mannan-(VI)temed, accumulation time, tA 120 s, scan rate, v 2V/s; B, 500 nM mannan-Os(VI)bipy, tA
60 s, v 0.1 V/s. AUTOLAB, HMDE, 80 mM Britton-Robinson buffer, pH 6.0.
Palecek E., Ostatna V., Trefulka M., Bartosik M., Cernocka H., Kurzatkowska K., Zivanovic M., Electrochemical Sensing of Proteins and Carbohydrates. IEEE SENS J. 833-836, 2010.
Биоелектрохемијско одређивање нуклеинских киселина и угљених хидрата
End-labeling РНК молекула помоћу Os(VI)L
комплекса DP voltammograms of 10 nM Os(VI)L-modified dA21rA (green), 250 nM free Os(VI)L (magenta) and 10 nM unmodified dA21rA (red) in 0.2 M phosphate buffer, pH 6.7 (black). Inset: Comparison of 10 nM modified dA21rA (green) and 10 nM modified 24-mer ODN with sequence (CCA)8 (blue). DPV: EA 0 V, tA 60 s, purging time 180 s, interval time 0.5 s, step potential 5 mV, amplitude 50 mV, Ei 0 V, Ef -1.6 V. Modification: 200 uM dA21rA (or ODN) + 5 mM Os(VI)L, overnight, 37 °C.
Palecek E., Ostatna V., Trefulka M., Bartosik M., Cernocka H., Kurzatkowska K., Zivanovic M., Electrochemical Sensing of Proteins and Carbohydrates. IEEE SENS J. 833-836, 2010.
Будући изазови
Интеракције ДНК-протеин
Будући изазови
Интеракције ДНК-протеин Интеракције протеин-протеин
Будући изазови
Интеракције ДНК-протеин Интеракције протеин-протеин Посттранслационе модификације протеина, посебно
хистона
Будући изазови
Интеракције ДНК-протеин Интеракције протеин-протеин Посттранслационе модификације протеина, посебно
хистона miRNA истраживање (miRNA као потенцијални тумор
маркери)
Будући изазови
Special thanks to:
Masaryk UniversityFaculty of Science
Institute of Biophysics, Academy of SciencesMinistry of Education, Youth and Sports
of the Czech Republic
IBP, BrnoCPCTAS, PMF Kragujevac
Special thanks to:
prof. Emil Palečekprof. Michael Heyrovskýprof. Snežana Marković
prof. Mara AleksićDr. Veronika Ostatná
Хвала!