茶叶中 668 种农药和化学污染物多组分多类别残留 gc-ms,gc-ms/ms 和 lc-ms/ms...
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茶叶中 668 种农药和化学污染物多组分多类别残留 GC-MS,GC-MS/MS 和 LC-MS/MS 高通量分析方法 — 国际 AOAC 协同研究实施方案（初稿）. 国际 AOAC 优先研究项目 (2010). AOAC Study Director 庞国芳 中国检验检疫科学研究院 Email:[email protected]. 1. 目的和意义. 世界经济一体化步伐的加快，世界各国食品安全战略地位的确立和国际贸易农药残留限量门槛的高筑，都呼唤高通量残留分析技术。. ① 世界各国食用农产品中农药残留限量标准越设越多，越设越严。. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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茶叶中茶叶中 668668 种农药和化学污染物多组分多类别残留种农药和化学污染物多组分多类别残留GC-MS,GC-MS/MSGC-MS,GC-MS/MS 和和 LC-MS/MSLC-MS/MS 高通量分析方法高通量分析方法
—国际—国际 AOACAOAC 协同研究实施方案（初稿）协同研究实施方案（初稿）
国际国际 AOACAOAC 优先研究项目优先研究项目 (2010)(2010)
AOAC Study Director 庞国芳中国检验检疫科学研究院
Email:[email protected]
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1. 1. 目的和意义目的和意义
①① 世界各国食用农产品中农药残留限量标准越设越多，越设越严。世界各国食用农产品中农药残留限量标准越设越多，越设越严。
世界经济一体化步伐的加快，世界各国食品安全战略地位的确立和国际贸易农药残留限量门槛的高筑，都呼唤高通量残留分析技术。
各国农药最高残留限量标准数量对比 (2010 年数据 )
文献来源： http://www.tbtsps.com/foodsafe/xlbz/Pages/pesticide.aspx
② ② 茶叶中农药残留限量国际贸易门槛高筑。茶叶中农药残留限量国际贸易门槛高筑。目前世界 17 个国家和国际组织制订了茶叶中 800 余项农药残留限量标准 MRL ：欧盟、德国、荷兰、瑞士、匈牙利、以色列、意大利、 CAC 、中国、日本、中国台湾、韩国、美国、澳大利亚、印度、肯尼亚、南非（截至 2006 年）。
欧盟： http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm日本： http://www.m5.ws001.squarestart.ne.jp/foundation/search.htmlCAC ： http://www.tbtsps.com/foodsafe/xlbz/Pages/pesticide.aspx中国： GB 2763-2005美国、德国 ：安徽农业大学博士论文 吴雪原 茶叶中农药的最大残留限量及风险评估
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本方法适用于绿茶、红茶、普洱茶、乌龙茶中 668 种农药和化学污染物残留的 GC-MS, GC-MS-MS 和 LC-MS-MS 定性定量测定。 GC-MS 测定的 490 种农药和化学污染物的方法检出限 (LOD) 范围为 1.0-500 μg/kg ， LC-MS/MS 测定的 448 种农药和化学污染物的方法检出限 (LOD) 范围为 0.03-4820μg/kg 。对于 LOD≤100µg/kg 的农药品种， GC-MS 法有 482 种，占所测农药的 98 ％， LC-MS/MS 法有417 种，占所测农药的 93 ％；对于 LOD≤10µg/kg 的农药品种， GC-MS 法有 264 种，占所测农药的 54 ％， LC-MS/MS 法有 325 种，占所测农药的 73 ％。对于 GC-MS 和 LC-MS/MS 均可测定的 270 种农药，对于 LOD≤100µg/kg 的农药品种， GC-MS 法有 264 种，占所测农药的 98 ％， LC-MS/MS 法有 247 种，占所测农药的 91 ％；而对于 LOD≤10µg/kg 的农药品种， GC-MS 法有 133 种，占所测农药的 49 ％， LC-MS/MS 法有 200 种，占所测农药的 74 ％。
2. 2. 方法应用范围方法应用范围
GC-MS & LC-MS-MS 测定的农药品种分布
LC-MS-MS &GC-MS270
LC-MS-MS178
GC-MS220
LC-MS-MS448
GC-MS490
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3.3. 分析方法流程分析方法流程
LC-MS-MS
GC-MS-MS
GC-MS-SIM
②Centrifugalize
③Concentration①Homogenize
⑦Sampler vial④Clean-up
⑤Concentration Concentration
⑥Evaporate with nitrogen
⑧Determine
①13500r/min for 1min;②4200r/min for 5min;③Concentration to ca 1mL at 40 ;℃④Natural gravity elution for Cleanert TPT;⑤Concentration to ca 0.5mL at 40 ; ℃⑥Evaporate to dryness with nitrogen gas at 35 ℃⑦Filter through 0.2μm membrane.
The key control points
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3. GC-MS(GC-MS/MS)&LC-MS/MS 3. GC-MS(GC-MS/MS)&LC-MS/MS 操作程序操作程序
Study Director 郑重提醒：国际协同研究是不同国家有关实验室参加的统一标准化行动，实验的每一步骤包括任一种试剂材料，未经 Study Director同意，都不允许改变或更换。这是志愿参加者必须遵守的规则。
Study Director 郑重提醒：国际协同研究是不同国家有关实验室参加的统一标准化行动，实验的每一步骤包括任一种试剂材料，未经 Study Director同意，都不允许改变或更换。这是志愿参加者必须遵守的规则。
5g tea sample
Added 15 mL acetonitrile
Add IS Heptachlor epoxide for GC/MS-SIM, GC/MS/MS or Chlorpyrifos-methyl for LC-MS/MS. Evaporate to dryness with nitrogen at 35℃
Cleanert TPT Cartridge(2g,12mL) or Envi-Carb/PSA(0.5g/0.5g,6mL) for clean up. Elute with 25 mL acetonitrile+toluene(3+1), concentrate about 0.5 mL
Make up to 1.5 mL with hexaneMake up to 1.5 mL with acetonitri
le+water(3+2)
GC/MSDetermination(490 Varieties)
GB/T 23204-2008
LC-MS/MSDetermination(448 Varieties)
GB/T 23205-2008
Homogenize at 13500r/min for 1min, and centrifuged at 4200r/min for 5 min before the supernatants are taken, while the dregs are re-extracted and the extracts are combined and then concentrate about 1 mL
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4. “4. “ 缩身的”国际协同研究方案缩身的”国际协同研究方案
如果组织数百种农药的国际如果组织数百种农药的国际 AOACAOAC 协协同研究会给参加者带来资源、时间和人员不可同研究会给参加者带来资源、时间和人员不可想象的困难，因此，国际想象的困难，因此，国际 AOACAOAC 提出了一个“提出了一个“缩身”的国际协同研究方案，选择两种茶叶，缩身”的国际协同研究方案，选择两种茶叶，GC-MS(GC-MS/MSGC-MS(GC-MS/MS ） ） and LC-MS/MS and LC-MS/MS 两种方法，两种方法，各检测各检测 3030 种农药，共计种农药，共计 6060 种农药参加协同研种农药参加协同研究。究。
classified per functionsclassified per chemical
compositions
insect growth regulator 1 organosulfur 1
plant growth regulator 1 carbamate 2
acaricide 2 pyrethroid 2
herbicide 5 organophosphorus 5
insecticide 9 organonitrogen 18
bactericide 12 other 2
classified per chemical compositions
classified perfunctions
carbamate 1 acaricide 1
organophosphorus 5 herbicide 6
organohalogen 21 insecticide 11
pyrethroid 2 bactericide 12
other 1
* Indicates the pesticides to be determined by both GC-MS (GC-MS/MS) and LC-MS/MS
4.1 GC-MS(GC-MS/MS)4.1 GC-MS(GC-MS/MS) 和和 LC-MS/MSLC-MS/MS 检测的检测的 3030 种农药种农药序号
GC-MS(GC-MS/MS) LC-MS/MS
名称 MRL/ (μg/kg) 名称 MRL/ (μg/k
g)1 benalaxyl 100 acetochlor 10.0 2 bifenthrin 5000 ametryn 3 bromophos-ethyl 100 Azoxystrobin 100.0 4 bromopropylate 100 Benalyxyl 100.0 5 chlorfenapyr 50000 Bensulide 30.0 6 chlorthal-dimethyl 10 Butralin 20.0 7 2,4'-DDE 200 Clomazone 20.0 8 diflufenican 50 Diazinon 20.0 9 dimethachlor 20 dibutyl succinate 10 dimethenamid 20 Ethoprophos 20.0 11 ethalfluralin 20 etofenprox 10.0 12 ethoprophos 20 Fenazaquin 10.0 13 fenchlorphos 100 Flutolanil 50.0 14 kresoxim-methyl 100 furalaxyl 15 picoxystrobin 100 Indoxacarb 1100.0 16 pirimicarb 50 iprobenfos 17 pirimiphos-methyl 50 isoprocarb 18 procymidone 100 isoprothiolane 19 propiconazole 100 Kresoxim-methyl 100.0 20 propyzamide 50 mefenoxam 21 pyrimethanil 100 phenothrin 50.0 22 Quinoxyfen 50 Picoxystrobin 100.0 23 tebufenpyrad 100 Pirimiphos methyl 50.0 24 tefluthrin 50 Procymidone 100.0 25 thiobencarb 100 prometon 26 tolclofos-methyl 100 Propoxur 100.0 27 triadimefon 200 pyriproxyfen 50.0 28 trifluralin 100 Tebufenpyrad 100.0 29 vinclozolin 100 Triadimefon 200.0 30 zoxamide 50 trifloxystrobin 50.0
GC-MS(GC-MS/MS) 检测的 30 种农药类别 LC-MS/MS 检测的 30 种农药类别
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4. “4. “ 缩身的”国际协同研究方案缩身的”国际协同研究方案
Study Director 提供的每个样品仅够一次实验，也就是说参加的实验室对每个样品仅有一次实验机会，必须做到万无一失才能成功！因此，再重复强调务必仔细认真做好这项协同研究的每一步实验。这 16 个正式协同研究样品的组配如下：
* 这里的样品编号，只代表协同研究方案的设计思路，不代表以后寄给参加者的实际样品代号。
每个参加的实验室共检测 16 个 Collaborative Study 样品
30 种目标农药浓度范围 10ug/kg-2.0mg/kg(1MRL-5MRL). 添加样品和陈化样品都是按 Youden Pair 原则设计的，一对两个样品，目标农药浓度相差约为 5 ％。
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5. 5. 国际国际 AOACAOAC 协同研究流程协同研究流程
Step-IStep-I Step-IIStep-II Step-IIIStep-III Step-IVStep-IV
Study Director寄送实验材料
①标准储备溶液
②添加溶液
③空白样品
④陈化样品
收到后放冰箱 4℃ 保存
Collaborators提交研究结果
①仪器分析参数
②添加样品结果
③陈化样品结果
从收到样品算起 80 天内完成
Step II-III 最好连贯进行
（考核合格实验室参加）
原始记录和质谱图与 Excel 表一起提交
Excel WorksheetI 实习阶段 II 考核阶段 III 正式协同研究阶段
添加样品 10 个陈化样品 6 个
绿茶样品 3 个
乌龙茶样品 3 个
绿茶样品 5 个
乌龙茶样品 5 个
添加样品 3 个
陈化样品 3 个
考核样品 6 个
回收率 70-120 ％，RSD ＜ 15 ％，做考核样品
Study Director 提供一瓶已知浓度的添加溶液
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Step-I Study DirectorStep-I Study Director 给参加实验室寄送的实验材料给参加实验室寄送的实验材料
1)30 种农药混合标准储备溶液： 2支安瓿瓶（ 1.0 mL×2支，含备用 1支），供建立至少 5点基质匹配内标校准曲线。
2)内标储备溶液： 2支安瓿瓶（ 1.0 mL×2支，含备用 1支）。
3)添加溶液： 10支安瓿瓶（ 0.5 mL×10支），供制备添加样品。
4) 茶叶空白样品： 10袋（ 5.0g × 10 ）， No.01-No.05 为绿茶， No.06-No.10 为乌龙茶，用于制备添加样品。
5) 茶叶陈化样品： 6袋（ 5.0g × 6 ）， No.11-No.13 为绿茶， No.14-No.16 为乌龙茶。
6) 绿茶和乌龙茶空白样品：各 1瓶（ 200g × 2 ），供制备基质匹配空白样品溶液。
(1)For Pre-collaborative study
1) 30 种农药混合标准储备溶液： 2支安瓿瓶（ 1.0 mL× 2支，含备用 1支）。
2)内标储备溶液： 2支安瓿瓶（ 1.0 mL× 2支，含备用1支）。
3) 绿茶和乌龙茶空白样品：各 1瓶（ 200g × 2 ）。4)考核样品：①添加溶液： 3支安瓿瓶 (0.5 mL×3), 供制备考核样品；
② 绿茶空白样品： 3 袋 (5.0g × 3 ) , 供制备考核样品 ；③乌龙茶陈化样品： 3袋（ 5.0g × 3 ）。
(2)For Collaborative study
(3)质量控制 质量控制标准储备溶液： 2支安瓿瓶（ 1.0mL ×2支，含备用 1支）。用于检查仪器的灵敏度和稳定性。
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Step-II ① 预协同研究的重要意义
这个课题研究的基质复杂，技术含量高，难度比较大，预研究的目的 AOAC Sr. Director, Stakeholder Communications Krystyna McIver博士做了精辟解释：“ pre-collaborative study by the participating laboratories to ensure the laboratories are qualified to run the method” 。
Step-II Pre-collaborative studyStep-II Pre-collaborative study
Study Director 再次提醒每位参加者， 16 个协同研究样品，每个样品，每个参加者只有一次实验机会，成败一锤定音。但 Study Director 提供给每位参加者的实习样品，却足够你通过充分实习，达到熟练掌握这项技术关键控制点的目的，希望你十分珍惜这个实习机会。
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Step-II ②Step-II ② 实习阶段实习阶段
Study Director 提醒：实习要达到的技术水平，应该是稳定的，反复实验都能重现的，而不是偶然一两次能达到。偶然 1-2 次符合要求，说明还没掌握这项技术的核心和关键，建议多实验几次。这几项指标关系到你检测考核样品是否能过关，更关系到协同研究的 16 个样品的测定结果是否准确。所以通过实习达到考核指标至关重要。
Study Director 提醒：实习要达到的技术水平，应该是稳定的，反复实验都能重现的，而不是偶然一两次能达到。偶然 1-2 次符合要求，说明还没掌握这项技术的核心和关键，建议多实验几次。这几项指标关系到你检测考核样品是否能过关，更关系到协同研究的 16 个样品的测定结果是否准确。所以通过实习达到考核指标至关重要。
Step-II Pre-collaborative studyStep-II Pre-collaborative study
①这项协同研究用基质匹配内标校准曲线定量制备绿茶和乌龙茶空白样品溶液各 5份，分别加入 20,50,100,200 和 300 uL混合标准溶液，并加入 40uL 环氧七氯内标工作溶液 (GC-MS 和 GC-MS/MS)或 40uL甲基毒死蜱内标工作溶液 (LC-MS/MS) 混匀。
用氮气吹干，用正己烷 (GC-MS-SIM or GC-MS-MS)或乙腈 :甲苯 (3:2) (LC-MS/MS) 定容 1.5 mL，配成 5点基质匹配内标校准混合溶液，并建立 5点基质匹配内标校准曲线。
②添加回收率练习用 Study Director 提供的茶叶空白样品和农药混合标准工作溶液进行 1MRL 、 5MRL水平的添加回收率实验。
自己实习要达到的技术水平： 30 种农药 5点基质匹配内标校准曲线线性相关系数 R2≥0.995，添加回收率 70-120 ％， RSD＜ 15 ％（ n=5 ）。
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Step-II ③Step-II ③ 考核阶段考核阶段把 Study Director寄去的三袋绿茶空白样品 No.1 ， No.2 和 No.3 加到相同编号的三个离心管中，将
No.1 ， No.2 和 No.3三支添加溶液安瓿瓶，矗立放在对应编号的离心试管之前，待溶液沿内壁流下后，打开安瓿瓶，将添加溶液全部加到对应编号的三个离心试管中，每个安瓿瓶用 0.5mL甲苯分 3 次洗涤，并将洗液加到相应离心管中，放置 20min ，待试液被样品吸咐，按协同研究方法进行提取、净化、检测。
乌龙茶陈化样品 No.4-No.6 ，直接按协同研究方法（ 6.1 和 6.2 ）进行提取、净化、检测。 对分析结果进行以下三个方法的审核：①保留时间是否在时间窗口之内；②积分线选择是否正确
；③质谱解析要核对离子丰度是否符合 AOAC 、 EU 标准要求，然后将考核结果填入如下 Excel表。
Step-II Pre-collaborative studyStep-II Pre-collaborative study编号 No.01 No.02 No.03
离心试管 No.01 No.02 No.03
空白样品 No.01 No.02 No.03
添加溶液 No.01 No.02 No.03
Study Director 提醒：把考核结果 Excel表、质谱图和原始数据等尽快传送给 Pang’s Director, Pang将在 48小时内答复考核结果，供你考虑决定是否继续做 Collaborative samples 。
Study Director 提醒：把考核结果 Excel表、质谱图和原始数据等尽快传送给 Pang’s Director, Pang将在 48小时内答复考核结果，供你考虑决定是否继续做 Collaborative samples 。
仪器分析参数 考核样品 GC-MS 、 GC-MS/MS 分析结果 考核样品 LC-MS/MS 分析结果
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Step-II ④Step-II ④ 预协同研究的验收标准预协同研究的验收标准
Relative intensityRelative intensity(( ％ ％ of base peakof base peak
))
GC-MS-SIMGC-MS-SIM(relative)(relative)
GC-MS-MS,GC-MS-MS,LC-MS/MSLC-MS/MS(relative)(relative)
＞＞ 5050％％ ±10±10％％ ±20%±20%
＞＞ 2020％％ -50-50％％ ±15%±15% ±25%±25%
＞＞ 1010％％ -20-20％％ ±20%±20% ±30%±30%
≤≤1010％％ ±50%±50% ±50%±50%
Recommended maximum permitted tolerances for Recommended maximum permitted tolerances for relative ion intensities using a range of spectrometric relative ion intensities using a range of spectrometric
techniquestechniques
特别提醒：1. 协同研究能否成功，参加的实验室通过预研究达到熟练掌握这个方法的技术要点，并且通过实习达到技术要求是至关重要的。
2. 为使参加实验室熟练掌握这个方法的技术，我们提供了足够量的空白茶叶样品和混合标准溶液，建议 你多实习几次，确保真正熟练掌握了这个方法的关键控制点。
3. 对考核样品，不论哪项指标，回收率或 RSD或离子丰度比，一旦合计有 30 ％的超标，原则上就不能再继续做正式协同研究样品。
Step-II Pre-collaborative studyStep-II Pre-collaborative study
1. GC-MS （ GC-MS/MS ） or LC-MS/MS 至少 5点基质匹配内标校准曲线 R2R2＞ 0.995 。
2. 回收率落在 70-120 ％范围内， RSD＜ 15％ .
3.3. 目标农药离子丰度应符合目标农药离子丰度应符合 EUEU 标准“标准“ EU DEU Document No. SANCO/10684/ 2009 Method Valiocument No. SANCO/10684/ 2009 Method Validation and Quality Central Procedures for Pedation and Quality Central Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed”.sticide Residues Analysis in Food and Feed”.
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Step-III ①Step-III ① 绘制至少绘制至少 55点基质匹配内标校准曲线点基质匹配内标校准曲线
按照协同研究方法中 6.1 、 6.2.1 和 6.2.2 操作步骤，制备绿茶和乌龙茶空白样品溶液各 5份，分别加入 20,50,100,200 和 300 uL 农药混合标准工作溶液，并加入 40uL 环氧七氯内标工作溶液 (GC-MS 和 GC-MS/MS)或 40uL甲基毒死蜱内标工作溶液 (LC-MS/MS) 混匀。
在 35℃水浴中用氮气吹干，用正己烷 (GC-MS-SIM or GC-MS-MS)或乙腈 :水 (3:2) (LC-MS/MS) 定容 1mL ，经 0.2μm 滤膜后即配成 5点基质匹配内标校准混合溶液，并建立 5点基质匹配内标校准曲线。
Study Director 提醒： 30 种农药在上述浓度范围内 R2＞ 0.995. 基质匹配内标校准混合溶液应现用现配 , 绿茶和乌龙茶基质匹配内标校准曲线不能混用。
Step-III Collaborative studyStep-III Collaborative study
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Step-III ② 制备协同研究添加样品（以绿茶 5 个添加样品为例说明）
将 Study Director 提供的 5份绿茶空白样品 No.01, No.02, No.03, No.04, No.05 加到相同编号的离心试管里，见下表。将相同编号的添加溶液安瓿瓶依次矗立在对应离心试管之前，待溶液沿内壁流下后，打开安瓿瓶，将添加溶液加到对应编号的 5 个离心试管中，用 0.5mL甲苯分 3次洗涤每个安瓿瓶，并将洗液加到对应离心管中，放置 20min ，试液被样品吸收后，即为协同研究添加样品，按协同研究方法 6.1 和 6.2进行样品制备。
Study Director特别提醒：①一份添加溶液对应一份添加空白样品，仅供一次分析，实验要特别仔细。②为了防止样品的交叉污染（特别是高浓度对低浓度或对空白样品的污染），实验要按编号顺序依次制样，所用制样器材要用完一次彻底清洗一次，以免污染下次的样品制备。
Study Director特别提醒：①一份添加溶液对应一份添加空白样品，仅供一次分析，实验要特别仔细。②为了防止样品的交叉污染（特别是高浓度对低浓度或对空白样品的污染），实验要按编号顺序依次制样，所用制样器材要用完一次彻底清洗一次，以免污染下次的样品制备。
编号 No.01 No.02 No.03 No.04 No.05
离心试管 No.01 No.02 No.03 No.04 No.05
空白样品 No.01 No.02 No.03 No.04 No.05
添加溶液 No.01 No.02 No.03 No.04 No.05
Step-III Collaborative studyStep-III Collaborative study
Step-III ③ 协同研究陈化样品直接按协同研究方法 6.1 和 6.2 制备。
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1. 正式进样测定前，要用质量控制标准工作溶液，检查仪器的灵敏度和稳定性是否达到要求。
2. 待确认仪器的灵敏度和稳定性符合要求时，按分析方法注入样品溶液进行检测。
3. 待一批样品检测完毕，再用质量控制标准工作溶液检查仪器灵敏度和稳定性，看前后是否一致。
4. 对分析结果按以下三原则进行复核： ①保留时间是否在积分窗口内； ②目标农药积分线选择是否正确； ③目标农药离子丰度是否符合 EU或 AOAC 标准要求。5. 把核准后的分析参数和检测结果填列在相应的 Excel结果表中。
Step-III Collaborative studyStep-III Collaborative study
Step-III④ GC-MS （ GC-MS/MS ） or LC-MS/MS 检测
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Step-IV Step-IV 参加实验室提交给参加实验室提交给 Study DirectorStudy Director 的协同研究结果表的协同研究结果表
1.1. AOAC AOAC 协同研究所用仪器分析参数，包括 协同研究所用仪器分析参数，包括 qualitative and quantitative ionsqualitative and quantitative ions ，见协，见协同研究方法附录同研究方法附录 BB 表表 11 。。
2.2. 国际国际 AOACAOAC 协同研究样品协同研究样品 GC-MSGC-MS 或或 GC-MS/MSGC-MS/MS 分析结果，见协同研究方法附录分析结果，见协同研究方法附录 BB表表 4. 4.
3.3. 国际国际 AOACAOAC 协同研究样品协同研究样品 LC-MS/MSLC-MS/MS 分析结果，见协同研究方法附录分析结果，见协同研究方法附录 BB 表表 55 。。4.4. 相关的色谱图和原始数据。相关的色谱图和原始数据。
仪器分析参数 协同研究样品 GC-MS(GC-MS/MS) 分析结果 协同研究样品 LC-MS/MS 分析结果
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Relative intensityRelative intensity(( ％ ％ of base peak)of base peak)
GC-MS-SIMGC-MS-SIM(relative)(relative)
GC-MS-MS,LC-MS/MSGC-MS-MS,LC-MS/MS(relative)(relative)
＞＞ 5050％％ ±10±10％％ ±20%±20%
＞＞ 2020％％ -50-50％％ ±15%±15% ±25%±25%
＞＞ 1010％％ -20-20％％ ±20%±20% ±30%±30%
≤≤1010％％ ±50%±50% ±50%±50%
Recommended maximum permitted tolerances for relative ion intensities using a Recommended maximum permitted tolerances for relative ion intensities using a range of spectrometric techniquesrange of spectrometric techniques
6. 6. 国际国际 AOACAOAC 协同研究的统计分析和判断标准协同研究的统计分析和判断标准
ConcentrationConcentration Recovery limitsRecovery limits Repeatability (RSDRepeatability (RSDrr))
Reproducibility Reproducibility (RSD(RSDRR))
10 μg/g(ppm)10 μg/g(ppm) 80-11580-115％％ 6%6% 11%11%
1μg/g1μg/g 75-12075-120％％ 8%8% 16%16%
10 μg/kg(ppb)10 μg/kg(ppb) 70-12570-125％％ 15%15% 32%32%
①① 由由 Study Director Study Director 汇总各参加实验室的分汇总各参加实验室的分析结果，统计分析根据析结果，统计分析根据 Statistical Manual Statistical Manual of AOACof AOAC 的统计方法进行的统计方法进行 [4][4] ，用，用 Dixon tDixon testing esting 剔除异常值。剔除异常值。
基质匹配内标校准曲线基质匹配内标校准曲线 R2R2 ＞＞ 0.995.0.995. 目标农药离子丰度比要符合目标农药离子丰度比要符合 EUEU 标准标准 [2][2] 回收率、回收率、 RSDrRSDr 和和 RSDRRSDR ，依据“，依据“ AOAC GuideAOAC Guide
lines for single laboratory validation of chemical lines for single laboratory validation of chemical methods for dietary supplements and botanicals” methods for dietary supplements and botanicals” [3][3] 。。
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7.7.仪器质量保障条件仪器质量保障条件
Study Director提醒：每次样品分析测试前和测试结束，务必要检查仪器的稳定性是否一致，以防因仪器的污染等原因，使灵敏度下降，稳定性波动，而导致较大的实验误差。
Study Director提醒：每次样品分析测试前和测试结束，务必要检查仪器的稳定性是否一致，以防因仪器的污染等原因，使灵敏度下降，稳定性波动，而导致较大的实验误差。
① 仪器灵敏度，按内标物信噪比 (S/N) 计算： GC-MS-SIM ＞ 1000
GC-MS/MS ＞ 2000
LC-MS/MS＞ 500
② 仪器稳定性 (按内标峰计 ) ： 保留时间偏差＜ 3 ％（连续 2 次进样） 峰面积偏差＜ 6 ％（连续 2 次进样）③ GC-MS ， GC-MS/MS 和 LC-MS/MS 均需配有数据处理软件系统。
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根据今年 124 次 AOAC 年会有关茶叶多残留专题会上专家建议，在原推荐 Cleanert-TPT 和 Envi-Carb+PSA 两种 Cartriage基础上，把 UCT 、 SUPELCO 、 Agilent 、 Waters 、 Varian 、 CNW 、 Bestown七家公司，具有与 Envi-Carb+PSA （ 500mg/500mg ， 6mL ）同类组成的 Cartridge ，又与 Cleanert-TPT 对绿茶和乌龙茶中 340 种（ LC-MS/MS ）和 227 种（ GC-MS ， GC-MS/MS ）农药在 2MRL水平的净化效果进行了对比实验，结果如下：
8种 SPE柱对绿茶、乌龙茶中 340种（ LC-MS/MS）和 227种（ GC-MS， GC-MS/MS）农药净化效率的评价（ n=16）
SPE柱品牌 UCT SUPELCO Agilent Waters Agela Varian CNW Bestown
填料 GCB/ PSA ENVI-CARB-II/PSA Carbon/PSA Carbon/PSA Cleanert TPT Carbon/PSA CNWBOND
GCB/PSA PSA/Carb
洗脱时间（ min ） 14-29 14-26 14-28 19-33 13-22 19-29 16-31 13-26
洗脱流速（滴 /min ）
加贮液器前 40-55 62-90 40-110 43-77 70-115 60-95 55-106 50-110
加贮液器后 83-115 80-120 87-147 68-120 108-156 80-123 95-145 100-162
回收率在 70-120% 的农药占比 96.5 97.1 96.6 96.1 96.8 96.7 95.6 96.2
RSD<15% 的农药占比 98.1 98.2 98.7 98 98.4 97.2 97.8 98.2
除色素效果分级 Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
备注： ①除 Cleanert-TPT柱填料量为 2000mg ，柱管体积 12mL外，其余 SPE柱的填料量均为 500mg/500mg ，柱管体积为 6mL 。 ②除 UCT柱为 1.0 Kpa负压下洗脱外，其余 SPE柱均是自然重力洗脱。 ③回收率和 RSD 所占百分比数均为 GC-MS,GC-MS/MS 和 LC-MS/MS三台仪器测定的平均值。 ④除色素效果：Ⅰ级是对两种茶叶去除色素效果均好 ; Ⅱ级为乌龙茶去除色素效果较好，而对绿茶效果稍差；Ⅲ级是对绿茶和乌龙茶去除色素效果均较差；Ⅳ级是对两种茶叶中去除色素效果均差。
8. 8. 固相萃取质量保障条件固相萃取质量保障条件8.1 所用 SPE Cartridges回收率和 RSD要达到的水平
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2. 就平均回收率在 70-120 ％和 RSD＜ 15 ％（ n=16 ）的农药数量所占百分比而论，绝大多数农药均符合 AOAC 方法的验收标准。
8. 8. 固相萃取质量保障条件固相萃取质量保障条件8.2 去除色素的水平
图 1. 八种 SPE柱对绿茶（ a）和乌龙茶（ b）去除色素净化效果的对比（从左至右依次为 UCT， SUPELCO， Agilent， Waters， Agela， Varian， CNW， Bestown）
(a) (b)
1.从去除茶叶色素的效果看， Agela 公司 Cleanrt-TPT除色素效果最好，属Ⅰ级； UCT 公司 GCB/ PSA ， Supelco公司 ENVI-CARB-II /PSA ， Agilent公司 Carbon/PSA ， Varian公司 Carbon/PSA属Ⅱ组； Waters公司 Carbon/PSA ， CNW公司 GCB/PSA属Ⅲ级； Bestown公司 PSA/Carb 属Ⅳ级。
结论如下：第一，我们前期根据 912 次实验的 183312 个数据推荐的 Cleanert-TPT 和 Envi-Carb+PSA 分别作为这项 AOAC
研究净化柱的第一和第二选择又经历了一次考证，实验结果再次证明这两种 Cartridge 的效能是 Ruggedness ；
第二，这次 8 种 SPE 茶叶净化效果的对比实验发现，其余 6 种 SPE Carbon/PSA cartridges （ 500mg/500mg,6mL ）就回收率和 RSD （ n=16 ）而论，也初步达到了 AOAC 方法的验收标准。如果这次协同研究参加者在国际 AOAC预研究中使用这些新柱子，也能达到 AOAC预研究的验收标准，在正式协同研究中也可使用这些新推荐的 Cartridges.
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8.3 不论选择上述推荐的哪种 Cartridges ，都要配置Visiprep 5-port flask vacuum manifold (RS-SUPELCO 57101-U, Sigma Aldrich Trading Co., Ltd) 这是 Supelco新开发的一个 Solid phase Extraction Equipment (http:www.sigmaaldrtch.com) 。
① 这里推荐的 Supelco 的 Visiprep 5-Port flask vacuum manfold 是因为它对接收大体积 (32mL)淋洗液比较方便，如果参加实验室能在 Cartridge净化过程中能解决大体积接收，也可用其它 SPE装置。
②对于不能买到新研制的 Cleanert TPT 的实验室， Study Director 可提供所需要的 Cleanert TPT 。
固相萃取装置
8. 8. 固相萃取质量保障条件固相萃取质量保障条件
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9.9. 检查来自试剂的干扰和影响检查来自试剂的干扰和影响 为了防止来自试剂的干扰，要对所用试剂进行方法全过程的空白实验，确认无干扰峰存在，并请每个实验室向 Study Director 提供空白实验总离子流图。
10. 10. 避免样品之间的交互干扰避免样品之间的交互干扰 为了防止样品之间的交互干扰，前一个样品提取完毕，下一个样品提取之前，均质器的刀头要用 2×50 mL乙腈，以提取样品同样的方式，均质 30秒进行彻底清洗，以避免农药含量高的样品，对低含量或不含农药样品的干扰，这一点在这次国际协同研究中是特别重要的。
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11. 11. 样品测试顺序要求样品测试顺序要求 对于协同研究样品的测试， Study Director建议按以下顺序连贯进行：样品测定之前，用质量控制标准工作溶液进行 2-3 次重复进样（检查仪器灵敏度和稳定性）、基质匹配内标校准混合溶液浓度由低到高 1 、 2 、 3 、 4 、 5点连续进样（建立基质匹配内标校准曲线）、样品试液测定 NO.01 、 NO.02 、……（按照编号顺序由小到大），最后再重复检测质量控制标准工作溶液 2-3 次（再检查仪器灵敏度和稳定性）。
12. 12. 对参加实验室或人员的要求对参加实验室或人员的要求
参加实验室和技术专家必备的经验：(1) 熟练的农药残留分析样品制备技术；(2)熟练的 GC-MS, GC-MS/MS and LC-MS/MS 检测技术和经验（操作经验，故障判断经验，维修保养经验）；
(3) 精确的残留农药质谱解析技术。
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13.13. 协同研究完成的期限和要求协同研究完成的期限和要求
当 AOAC 农药化学污染物委员会批准我们的这个 protocol之后，我们用两个月的时间，在世界范围内征招协同研究参加者，力争有 15 个国家和地区 20-30 个实验室参加。
参加实验室确定之后，我们马上准备预协同研究和正式协同研究所用的标准溶液、添加溶液及相关实验耗材等，并一次用特别快递寄给参加者。从这些实验材料由中国寄出之日算起，要求参加者在 3 个月内结束这项国际 AOAC协同研究。
同时，还要求参加实验室对 16 个协同研究样品测试完毕后，除把实验结果 Excel表等及时传给 Study Director 之外，也别忘了，对使用本方法发现问题和建议也写在你的意见栏内。
协同研究参加者收到协同研究材料后，须立即检查收到的实验材料与供货清单是否相符，材料是否完好，并填写好材料接收表（见附件 1 ）， E-mail或传真给 Study Director 。自实验材料收到之日起，最迟要在 2 个月内完成全部样品的分析任务。
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14. 14. 安全注意事项安全注意事项 本实验中所用乙腈、甲苯等有机试剂对人体有一定潜在危害。因此特别提醒，实验时应戴乳胶手套，在通风橱中小心操作。
15. Study Director‘s 15. Study Director‘s 希望、要求和承诺希望、要求和承诺
①① 希望希望能有能有 1515 个国家和地区、每个方法个国家和地区、每个方法 (GC-MS,GC-MS/MS or LC-MS/MS)20-3(GC-MS,GC-MS/MS or LC-MS/MS)20-300 个实验室参加这项协同研究。个实验室参加这项协同研究。
②② 要求要求参加实验室实验材料收到后参加实验室实验材料收到后 8080 天内完成这项协同研究，并将分析天内完成这项协同研究，并将分析结果数据表、谱图和原始记录等寄给结果数据表、谱图和原始记录等寄给 Study DirectorStudy Director 。。
③③ 承诺承诺在协同研究期间，对参加者提出的技术问题，保证在在协同研究期间，对参加者提出的技术问题，保证在 4848 小时之内小时之内给予答复；对其它问题，若有可能也会全力帮助解决。给予答复；对其它问题，若有可能也会全力帮助解决。
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16. 16. 参考文献参考文献(1) http://www.flworkshop.com/Community/pesticides.html
(2)Document No. SANCO/10684/ 2009“Method Validation and Quality Central Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed
(3)AOAC Guidelines for single laboratory validation of chemical methods for dietary supplements and botanicals
(4)Youden W.J.& Steiner E.H.(1975) Statistical Manual of the AOAC, Arlington, VA.USA
(5)Standardization Administration of P.R.China (2008) GBT 23204-2008 , Determination of 519 pesticides and related chemicals residues in tea—GC-MS method
(6)Standardization Administration of P.R.China (2008) GB/T 23205-2008, Determination of 448 pesticides and related chemicals residues in tea—LC-MS-MS method
(7)High-Throughput Analytical Techniques for determination of 653 multi-Classes and multi-Kinds of Residue Pesticides and Chemical Pollutants in Tea. Part I: The Tentative Probe into the Analytical Techniques of Multiresidues in Tea (J.AOAC Int. Manuscript ID-10-0008R.1)
(8)High-Throughput Analytical Techniques for determination of 653 multi-Classes and multi-Kinds of Residue Pesticides and Chemical Pollutants in Tea. Part II: Comparative Study of Extraction Efficiencies of the Three Sample Preparation Techniques (J.AOAC Int. Manuscript ID-10-0215R.1)
(9)High-Throughput Analytical Techniques for Determination of 653 multi-Classes and multi-Kinds Residue Pesticides and Chemical Pollutants in Tea. Part III: The Evaluation of the Cleanup Efficiency of SPE Cartridge Newly Developed for Multiresidues in Tea (J.AOAC Int. Manuscript ID-10-0251R.1)
(10)High-Throughput Analytical Techniques for Determination of 653 multi-Classes and multi-Kinds Residue Pesticides and Chemical Pollutants in Tea. Part IV: Key Control Points and Error Analysis of AOAC collaborative Study Method (已形成初稿 )
(11)High-Throughput Analytical Techniques for Determination of 653 multi-Classes and multi-Kinds Residue Pesticides and Chemical Pollutants in Tea. Part V: Establishment of AOAC Collaborative Study Pesticide Degradation Kinetic Equations and Prediction for Detected Values of Multiresidues of Collaborative Study Samples (正在撰写中 )
