维生素 B2 的分子荧光测定一、目的要求１、了解分子荧光分析法的原理。２、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。３、掌握荧光光度计的基本操作方法。二、方法原理 维生素 B2 又称核黄素 , 溶于水 , 在 W 为 0.05 的

乙酸溶液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳定，在碱性溶液中较易被破坏。通过实验确定它的最佳激发波长（ 370nm 和 440nm ）和发射波长（ 560nm ），在所确定的波长条件下，测定维生素 B2 标准系列溶液的荧光强度和浓度的工作曲线。用标准曲线法测定生物样品（蔬菜）中的维生素 B2 含量。

三、实验步骤1 ．标准系列溶液的配制 用吸管移取维生素 B2 标准贮备溶液 10.00mL 于 100mL

容量瓶中，用 W 为 0.05 的乙酸稀释至刻度，摇匀。吸取该稀释溶液 (10.0mg·L-1)

0,0.50,1.00,2.00,3.00 和 4.00mL ，分别放入六只 100mL 容量瓶中，用 W 为 0.05 的乙酸稀释至刻度，摇匀，此标准系列溶液的浓度分别为 0,0.050,0.10,0.20,0.30 和 0.40 mg·L-1 。

2. 样品溶液制备 称取 50g 新鲜蔬菜，加 40mL 水压汁，将菜汁

加入 20mL1mol.L-1HCl 和 10mL 水煮沸 1h ，冷却，不断搅拌滴加 2mol.L-1NaOH ，调节 pH 为 6 ，再用稀 HCl 调节 pH 至 4.5 ，过滤，用水洗涤样品，洗涤液和过滤液合并定量转移至 100mL 容量瓶中，加水稀释至刻度。

3. 工作曲线绘制 取标准系列溶液之一，试验实验条件，找出最佳荧光

发射波长。在所确定的波长条件下测定标准系列溶液的荧光强度，绘制荧光强度与浓度的工作曲线。

4. 测定 分别吸取 10.00mL 样品溶液三份，依次置于三只 25.

00mL 容量瓶中，加入 1.25mL 冰醋酸，再加入 KMnO4溶液 (3%)0.5mL ，放置 2min ，边摇边滴 H2O2(30%) ，使 KMnO4 刚好褪色，用纯水稀释至刻度，在荧光光度计上分别测定其荧光强

四、结果处理 1. 在坐标纸上绘制 If~C 的工作曲线

2. 根据测定的 If.x ，从工作曲线上查出溶液中维生素 VB2的 Cx（ mg/

L ） 3. 由下式计算出样品（新鲜蔬菜）中的维生素 VB2

的含量（ mg/100

g ） VB2

（ mg/100g ） = Cx ×25.00×10-3

× （ 100/10 ） × （ 1/WS） ×100

五、实验注意事项1 、配制标准系列溶液采用 5% HAc 溶液定容，配制样品溶液采用蒸馏

水定容。2 、用 5mL 移液管量取 2 、 3 、 4mL 溶液时必须先吸到满刻度；3 、用浓度最大的标准溶液找出最佳荧光发射波长，并确定测定时仪器

工作条件（选择合适的灵敏度值与纵坐标放大值）；4 、过滤时先将样品液分批倒入小布袋，用漏斗接液，漏斗下端直接用

100mL 容量瓶接液；5 、提取液中加 10%双氧水应逐滴加入使高锰酸钾刚好颜色褪去（边滴

边摇）；6 、样品液测定条件与标准曲线测定条件一致（测定时所用灵敏度值与

纵坐标放大值一致）；