1

核黄素（维生素 B2）

黄色至橙黄色结晶性粉末

饱和水溶液呈中性，呈淡黄绿色，有荧光。

怎样检测样品中的核黄素（维生素 B2 ） ？

2

molecular fluorescence analysis

郭建丽

卫生化学教研室

3

荧光的发现

植物愈创木切片黄色水溶液—— 天兰色荧光；

第一节概述

4

荧光的发现

5

6

光致发光

荧光

磷光

物质分子吸收光能后，其电子由基态跃迁到激发态，激发态的分子以电磁辐射的形式释放能量回到基态，称为光致发光

受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。

受光激发的分子从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。

7

分类

(1) Ｘ射线荧光、紫外可见荧光和红外荧光(激发光的波长不同 )

(2) 分子荧光和原子荧光 (发射荧光的粒子不同 )

8

(1) 灵敏度高 , 通常比分光光度法高 2～ 4个数量级 (2) 选择性好(3) 样品用量少和操作简便

特点

9

第二节基本原理

一、分子荧光产生过程

二、激发光谱与荧光光谱

三、荧光物质的分子结构

四、荧光强度与溶液浓度的关系

五、影响荧光强度的外部因素

10

一、荧光的产生过程

1. 分子能级与跃迁

S1

S0

11

处于分立的电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级低。

2. 单重态与三重态

12

3. 激发态→基态的能量传递途径

传递途径

辐射跃迁

荧光 延迟荧光 磷光 内转移 外转移系间跨越 振动弛豫

无辐射跃迁

13

S2

S1

S0

T1

absorption

fluorescence

phsophorescence

intersystem

crossing

internal conversion vibrational relaxation

energy

21

3

external conversion

2

T2

internal conversion

vibrational relaxation

14

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 9000

400

800

1200

1600

2000

2400

2800

3200

3600

4000

4400

4800

IF

激发光谱激发光谱

荧光光谱荧光光谱

二、激发光谱和荧光光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum

激发波长荧光波长

15

16

200 260 320 380 440 500 560 620

荧光激发光谱

荧光发射光谱 磷光光谱

室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱

17

2. 三维荧光光谱

18

3. 荧光光谱的特征

（1）荧光光谱的形状与激发波长无关

(2）荧光光谱比激发光谱波长长

（3）镜像对称

19

S2

S1

S0

T1

absorption

fluorescence

phsophorescence

intersystem

crossing

internal conversion vibrational relaxation

energy

21

3

external conversion

2

T2

internal conversion

vibrational relaxation

20

SS1144332211

SS0044332211

21

三、荧光与物质分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure 1. 荧光发射的量子产率 分子产生荧光必须具备的条件：（ 1）具有合适的结构；（ 2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）：

吸收的光量子数发射的光量子数

22

激发 *n*,

n*,* 发射

2. 化合物的结构与荧光

（ 1）跃迁类型： * →

23

(2) 共轭效应化合物 λ/nm苯 0.07 283萘 0.29 321蒽 0.46 400一般而言， π 电子共轭体系越大，荧光效率越高，且

荧光光谱红移。

CH

CH

CH

CH

强荧光 无荧光

24

（ 3）刚性平面结构

刚性平面结构可减少分子的振动，使分子与溶剂和其它溶质分子的相互作用减小，因而有利于提高荧光效率。

25

26

(4) 取代基效应

化合物 荧光相对强度苯

10苯酚 18苯胺 20苯甲酸 3硝基苯 0

OH

NH2

COOH

NO2

给电子基团：如– OH, –OR, –NH2, –CN ， – NR2 等，增强荧光。 吸电子基团：如– COOH, , –NO2, –NO 等， 减弱甚至熄灭荧光。

C O

27

根据 Lambert-Beer 定律：

所以，

四、 荧光强度与溶液浓度的关系

28

由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程

度及荧光效率成正比，即：

aΦIF )101( k 0

abcIΦF

)1( 3.20

abceIkΦ

)101(00abc

a IIII

当 abc≤0.05（即溶液很稀）时，abcIkΦF 0 3.2

对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，

ckF '

29

NH3

OH

H

NH2 NH

OH

H

pH<2 无荧光 7~12 蓝色荧光 >13 无荧光

五、影响荧光强度的外部因素 relation between fluorescence and molecular structure

1. 溶剂的影响 2.温度的影响 3. 溶液 pH的影响 4. 溶液荧光的猝灭

30

（ 1）碰撞熄灭 （ 2）静态熄灭 （ 3）转入三重态的熄灭： （ 4）荧光物质的自熄灭： （ 5）内滤光作用和自吸现象

造成荧光熄灭的原因：

31

5.散射光（ scattering light ）

（ 1）瑞利（ Reyleigh）散射光

（ 2）拉曼（ Raman ）散射光

瑞利峰 拉曼峰

32

第三节荧光分析仪器instrument of fluorescence analysis

一、仪器的主要部件 二、仪器类型

33

I0 It

F

34

激发光源(light source)

样品池(吸收池)(absorption cell)

单色器(monochromator )

检测器(detecor)

记录及数据处理器 (display)

一、仪器的主要部件

35

激发光 源 : 能够在紫外 -可见光区连续发光，

常用卤钨灯、氙灯、高压汞灯或激光光源 .

激发光 源

卤钨灯

36

高压汞灯

37

高压氙灯

38

样品池

39

紫外紫外 -- 可见分光光度计可见分光光度计测量池测量池 (( 吸收池吸收池 ))

荧光分光光度计荧光分光光度计样品池样品池

I0

It

I0

It

IF,p

40

滤光片、棱镜、光栅

单色器

混合光

单色光

狭缝

狭缝

色散原件准直镜

41

棱镜 光栅

原理 光的折射 光的衍射与干涉的总效果

特点a.非线性色散，长波密，短波疏； b.色散效果好

线性色散。 b．光栅可以复制，造价低于棱镜，但不如棱镜坚固。 c．单位长度内刻线越多，光栅色散效果越好。 d．产生多级光谱，干扰分析。

光栅适用的波长范围比棱镜宽

42

光电池或光电倍增管 , 光电二极管阵列式检测器

检测器

43

44

光源光源

氙氙灯灯

激发单色器激发单色器

样品池样品池光电倍增管光电倍增管

数据处理数据处理仪器控制仪器控制

发射单色器发射单色器

问 题 ：问 题 ：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？

45

紫外紫外 -- 可见分光光度计可见分光光度计 ::

光源光源 样品池样品池单色器单色器 检测器检测器 数据处理数据处理仪器控制仪器控制

荧光荧光 (( 磷光磷光 )) 分光光度分光光度计计 ::

光源光源 样品池样品池激发激发单色器单色器

检测器检测器 数据处理数据处理仪器控制仪器控制

发射发射单色器单色器

46

1. 荧光光度计 (fluorometer)

二、仪器类型

2. 荧光分光光度计 (spectrofluorometer)

47

荧光光度计 荧光分光光度计

光源 溴钨灯、汞灯 氙灯

单色器 滤光片、棱镜 光栅

光谱 荧光光谱 激发光谱、荧光光谱

应用 定量分析 定量、定性分析

48

光源 样品池

信号输出

第一滤光片

狭缝第二滤光片

检测器

荧光计示意图

光源程序

狭缝

激发单色器

样品 表面吸收物质

发射单色器

检测器

放大器

指示器

记录器

荧光分光光度计示意图

49

可获得三维光谱图的仪器 如：日立 4500型荧光分光光度计。 可获得激发光谱与发射光谱同 时变化时的荧 ( 磷 ) 光光谱图

50

特点：（ 1）灵敏度高 比紫外 -可见分光光度法高 2 ～ 4 个数量级； 检测下限： 0.1 ～ 0.1g/cm-3

相对灵敏度： 0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（ 2）选择性强 既可依据特征发射光谱， 又可根据特征吸收光谱；（ 3）试样量少 缺点：应用范围小。

第三节荧光分析方法与应用 fluorescence analysis and application

51

一、定性分析

荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱，

因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。

定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标准品对照，看是否一致。

52

F － F

0

c

Fx － F0

cx

二、定量分析 1.标准曲线法：

53

2. 直接比较法

如果荧光物质的标准曲线过零点，且线性良好，

可用直接比较法测定。在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，进行比较：

ss KcFF 0

xx KcFF 0

x

s

x

s

c

c

FF

FF

0

0s

x

sx c

FF

FFc

0

0

54

（一）药物（西药类）

1. 采用荧光分光光度法测定奥沙普嗪肠溶胶囊的含量，测定波长为 λex=287.0nm ， λem=368.0nm 。

2. 替硝唑 λex=360nm ,λem=420nm

3. 氟康矬 λex=261nm , λem=284nm

三、荧光分析法的应用

55

（二）药物（中药）

1. 测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚

2. 香内酯荧光分光法定量分析，其发射光谱λem=(385±1)nm ， λex=301nm或激发光谱λex ： (328±1)nm ， λem ： 425nm

56

（三）无机元素

1. 测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨梅黄素在磷酸 介质中形成配合物，此配合物在乙醇溶

液中具有较强的荧光强度， λex=446nmλem=506nm 。

2. 海藻产品中的硒，采用荧光分光光度法测定海藻产品中的硒含量。

57

58

（四）医学上1. 探讨谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX)模拟物．环糊精 (2-Se-CD) 对中波紫外线损伤的防护作用。以小鼠成纤维细胞 (NIH3T3)制备紫外线损伤模型，改良硫代巴比妥酸荧光法测定细胞脂质过氧化作用

2. 采用最新合成的荧光试剂与大白鼠组织及食物中 а-二羧基类化合物生成荧光诱导体，然后用以相 HPLC-荧光对大白鼠组织及食物中的乙二醛，甲基乙二醛 ，二乙酰和 2,3-二酰丙酮４种 а-二羧基类化合物同时进行分离定量检出，荧光检出波长为 λex=350nm ， λem=390nm ，

59

（五）生命科学中

60

1. 探测和分析蛋白质的分子结构

61

2. 基因检测 -分子信标

62

3. 细胞生物学中的应用

63

4.膜融合机理的研究

64

三、荧光光度计的发展

1928 年第一台光电荧光计问世以来 .经过三阶段 :1.手动式 .2. 自动扫描3.微机化

65

1. 分辨率提高： 5.2μs ～ 1ps, 分辨率达 ±0.5ps.

2. 扫描速度加快： 30000nm/min

3. 多功能：可同机进行荧光、磷光和化学发光测量

4. 促使应用技术的发展

例如：时间分辨 ( 相分辨 ) ；同步荧光；三维荧光；荧光光纤化学传感器

66

MFS 与 UV/Vis 法比较：

原理

UV/Vis 吸收

MFS 发射

测定方法

I0 It

F

灵敏度 , 选择性

10-5 ～ 10-6mol·L-1

10-7 ～ 10-9 mol·L-1

I0 F

67

磷光的发现　　 15 世纪被发现（重晶石在强烈阳光下的发光）　　 1944 年： Lewis 提出磷光用于分析的可能性；　　 1957 年： Keirs 将磷光分析用于定量分析及多组份混合物分析；　　 1963 年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药残留量分析。

第五节 磷光分析法简介 molecular phosphorescence analysis

68

S2

S1

S0

T1

absorption

phsophorescence

intersystem

crossing

internal conversion vibrational relaxation

energy

21

3

2

T2

internal conversion

69

（ 1 ）磷光的波长比荧光更长。 （ 2 ）磷光的寿命比荧光长。 （ 3 ）如果分子中有重原子（如 I 、 Br 等）存在，由于自旋 - 轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容易。所以，磷光寿命和强度受重原子和顺磁性离子影响敏感。

特点

70

低温磷光

因磷光寿命长，无辐射跃迁几率增大。在低温下测磷光，

可减少无辐射跃迁对磷光发射的影响。需低温实验装置。

冷却剂：液氮

71

室温磷光（ room temperature phosphorescence ）

固体基质室温磷光法（ solid-surface RTP ）

胶束增稳室温磷光法（ micelle stabilized RTP ）

环糊精诱导室温磷光法（ cyclodextrin induced RTP ）

72

固体基质室温磷光法（ solid-surface RTP ）

特点：

（ 1 ）无需低温冷却装置

（ 2 ）免除溶剂和溶液的除氧过程

（ 3 ）用量少可以在载体上进行色谱分离后直接进行分析

（ 4 ）操作简单便于自动化

（ 5 ）有较宽的线性范围，可进行有机痕量分析

73

胶束增稳室温磷光法（ micelle stabilized RTP ）

特点：

（ 1 ）方法灵敏度更高

（ 2 ）适用于水溶液样品，并且使通常难溶的非极性化合物增

溶于胶束水溶液中

（ 3 ）减少了干扰

（ 4 ）增强了重原子微扰作用

74

环糊精诱导室温磷光法（ cyclodextrin induced RTP ）

特点：

（ 1 ）试样制备简单快速

（ 2 ）氧分子淬灭作用小，有时可以无需除氧

（ 3 ）光谱分辨率高

（ 4 ）选择性极高

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磷光分析法应用

1.稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）； 2. 农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱， 2 ， 4-D 等分析 检测限 0.01 g/cm-3 3. 药物分析和临床分析

76

77

78

参考资料

《现代卫生化学》许向春、邹学贤；北京：人民卫生

出版社， 2000

《荧光探针应用技术》李楠、王凤翔、周春喜；北京：

军事医学科学出版社， 1998

《医学生物物理学》林克春、吴本玠；北京：中国协

和医科大学联合出版社， 1998

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如果婴幼儿体内缺乏使苯丙氨酸转变为酪氨酸的酶时，则苯丙氨酸的含量异常增大而患“苯丙酮尿症”且易引起智力低下，所以，对婴幼儿的该项体查极为重要，但是，由于血液蛋白质中其它芳香氨基酸的影响而难以测出苯丙氨酸的含量，请用本课程所学内容提出一个检测方案。