尖孢镰刀菌致病相关物质 β-D- 葡萄糖苷酶基因的克隆与序列分析

学 号： 1070412 姓 名 ：李燕丹

指导老师：许文耀 教 授 刘 波 研究员

主要内容

AA 研究背景与选题意义

BB 研究内容、研究方法与技术路线

CC

DD

拟关键问题、预期成果与创新点

现有工作基础、工作计划

研究背景与选题意义

尖孢镰刀菌 (Fusarium Oxysporum f.sp cubense )

对重要基因的克隆具有重要意义。

尖孢镰刀菌致病相关物质 β-D- 葡萄糖苷酶 研究发现，在尖孢镰刀菌致病过程中，果胶酶 (PMG 、PMTE) 及纤维素酶 (Cx 、 β- 葡萄糖苷酶 ) 起着重要作用，其在镰刀菌枯萎病程中起着降解细胞壁纤维素破坏植物细胞组织的作用。

目前国内对其他真菌产目前国内对其他真菌产 β-D-β-D- 葡萄糖苷酶的研葡萄糖苷酶的研究主要集中在对纤维素转化作用的研究，对究主要集中在对纤维素转化作用的研究，对 β-D-β-D-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达方面已经有较多的研葡萄糖苷酶的基因克隆、表达方面已经有较多的研究。究。

为镰刀菌致病物质的为镰刀菌致病物质的 β-D-β-D- 葡萄糖苷酶的分子葡萄糖苷酶的分子检测与克隆则尚少涉及，因此，本研究拟对这方面检测与克隆则尚少涉及，因此，本研究拟对这方面进行研究。进行研究。

实验内容

以以 RNARNA 为模板，为模板， RT-PCRRT-PCR ，， RACE,RACE, 克隆香蕉枯萎克隆香蕉枯萎病菌（病菌（ F.oxysporum f.sp cubenseF.oxysporum f.sp cubense ）致病相关）致病相关物质物质 β-D-β-D- 葡萄糖苷酶基因，获得基因全长葡萄糖苷酶基因，获得基因全长 cDNAcDNA 。。

以以 DNADNA 为模板，为模板， PCR,PCR, 克隆香蕉枯萎病菌（克隆香蕉枯萎病菌（ F.oxyF.oxysporum f.sp cubensesporum f.sp cubense ）致病相关物质）致病相关物质 β-D-β-D- 葡葡萄糖苷酶基因，获得基因序列。萄糖苷酶基因，获得基因序列。

序列分析。序列分析。

总 RNA 提取

DNA 提取

RT-PCR PCR

RACE 及拼接

克隆测序克隆测序

基因全长 cDNA序列 基因序列

β-D- 葡萄糖苷酶基因结构分析

尖孢镰刀菌

BLAST 比对近缘种 β-D- 葡萄糖苷酶基因序列

引物设计

基因全长 cDNA序列

技术路线技术路线

RNA 为模板的克隆实验步骤

1. 菌株 RNA 提取

按照 TRIZOL 试剂盒提取 RNA。

RNA 为模板的克隆实验步骤

RT-PCR 合成中间产物：按照 TAKAR PCR Kit(AMV)Ver3.0说明书操作，采用兼并引物进行扩增。

RACE ： 3/RACE ： GeneRaceTM Kit ，按中间产物基因序列设计正向

引物。 5/RACE ： BD SMART RACE cDNA Amplication Kit ，按 3/端

扩增产物序列设计反相引物。

全长序列拼接：将上面获得的中间、 3/端、 5/端片段进行序列拼接，比较分析，去掉重复序列，得到全长 cDNA。

2.RT-PCR2.RT-PCR 以及以及 RACERACE

RNA 为模板的克隆实验步骤

回收目的片段与克隆载体连接 转化至感受态细胞 单菌落 PCR 筛选阳性克隆测序分析

3. 克隆并测序

DNA 为模板的克隆

DNA 提取DNA 提取 PCRPCR

克隆测序克隆测序基因序列基因序列

用尿素提取法 根据近缘物种，设计兼

并引物

上海英俊生物技术有限公司

回收 PCR 产物，连接，转化，筛选，测定基因

序列

序列分析利用利用 DNAstarDNAstar 和和 ClustalClustal 软件进行序列拼接和软件进行序列拼接和

分析。 分析。

序列分析的结果通过国际互联网进行序列同源序列分析的结果通过国际互联网进行序列同源性检索，检索主程序采用性检索，检索主程序采用 BLASTNBLASTN 和和 BLASTXBLASTX ，，序列分析在序列分析在 NCBINCBI 进行。进行。

可能存在的关键性问题及其解决途径

⑴⑴β-D- 葡萄糖苷酶基因兼并引物的设计从 NCBI 上寻找与尖孢镰刀菌近缘性生物的 β-D- 葡萄糖苷

酶氨基酸序列，设计兼并引物。

对策：下载多个不同种的序列，设计多种引物。

⑵以 DNA 为模板时扩增不出目的片段设计的兼并引物，不能扩增出目的片段。

对策：先进行 RNA 为模板， RT-PCR ， RACE ，扩增出基因全 长 cDNA ，设计特异性引物。再以 DNA 为模板设计合成引物并进行 PCR 。

预期成果

获得全长基因序列获得全长基因序列克隆克隆 β-D-β-D- 葡萄糖苷酶基因 葡萄糖苷酶基因 进行有效的序列分析进行有效的序列分析

创新点

从尖孢镰刀菌克隆到从尖孢镰刀菌克隆到 β-D-β-D- 葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶基因，为进一步研究基因，为进一步研究 β-D-β-D- 葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶的致病分子机制奠定基础。的致病分子机制奠定基础。

在本实验室曾经成功地进行淡紫拟青霉几丁质酶基因的克隆。

现有工作基础现有工作基础

工作计划

08 年 7月 -08 年 09 月 查阅资料，构思论文题目； 08 年 9 月 -08 年 12月 查找资料，确定论文题目，撰写开

题报告，准备材料；09 年 1月 -09 年 12月 β-D- 葡萄糖苷酶基因克隆，序列

测定；09 年 12月 -10年 6 月 基因结构分析数据分析，开始撰写论文，并准备答辩。